Abstract
WAVE3 cytoskeletal protein fremmer kreft invasjon og metastasering. Vi har vist at WAVE3-mediert aktivering av kreft celle invasjon skyldes delvis til regulering av ekspresjon og aktivitet av sentrale metalloproteinaser (MMP), inkludert MMP9, som er sentralt involvert i invadopodia-mediert degradering av den ekstracellulære matriks ( ECM). MMP9 er også en stor NFkB target gen, noe som tyder på en mulig kobling av WAVE3 til denne veien, som vi ønsket å undersøke. Mekanistisk har vi funnet at tap av WAVE3 i kreftceller fører til inhibering av NFKB signalering som et resultat av en reduksjon i den kjernefysiske translokasjon av NFkB og derfor tap av aktivering av NFkB målgener. Omvendt, overekspresjon av WAVE3 var tilstrekkelig til å forbedre NFkB-aktivitet. Både farmakologiske og genetiske manipulasjoner av NFkB effektormolekyler viser at den biologiske konsekvensen av tap av WAVE3 funksjon i NFkB bane resultere i hemming av invadopodia dannelse og ECM nedbrytning av kreftceller, og disse endringene er en konsekvens av redusert MMP9 ekspresjon og aktivitet. Tap av WAVE3 også lysfølsomt kreftceller til apoptose og celledød drevet av TNFa, gjennom hemming av AKT pro-overlevelsesreaksjonsveien. Våre resultater identifisere en ny funksjon WAVE3 i NFkB signalering, hvor aktiviteten er viktig for regulering av invadopodia og ECM degradering. Derfor målrettet terapeutisk hemming av WAVE3 vil bevisstgjøre kreftceller til apoptose og celledød, og undertrykke kreft invasjon og metastase
Citation. Davuluri G, Augoff K, Schiemann WP, Plow EF, Sossey-Alaoui K (2014 ) WAVE3-NFkB Interplay er avgjørende for overlevelse og invasjonen av kreftceller. PLoS ONE 9 (10): e110627. doi: 10,1371 /journal.pone.0110627
Redaktør: Chengfeng Yang, Michigan State University, USA
mottatt: 13 juli 2014; Godkjent: 16 september 2014; Publisert: 16 oktober 2014
Copyright: © 2014 Davuluri et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet fått støtte fra tilskudd P01 HL073311 og R01 HL096062, National Institute of Health, NIH.gov, EFP; og stipend P30 CA43703, Case Comprehensive Cancer Center, Case.edu, til KS-A og WPS. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
metastaser er en kompleks prosess som krever kreftceller til å flykte fra sitt primære område, overleve i blod /lymfesystemet og deretter å etablere en ny nisje i et fjerntliggende område [1]. Under denne prosessen, også referert til som invasjon-metastasering kaskade, kreftceller benytte spesialiserte F-aktin rike fremspring kalt invadopodia, for å konsentrere den enzymatiske aktiviteten til MMP å degradere ECM, og dermed gir kreftcellene for å invadere og migrere gjennom deres mikromiljø [2], [3]. De WASP /WAVE proteiner spille sentrale roller i flere cellulære prosesser, inkludert cellen form, bevegelighet, cytokinese samt kreftcelle invasjon [4] – [6]. WAVE3, spesielt, har vist seg å være avgjørende for den motilitet og invasjon av kreftceller [7] – [9] ved å bidra til dannelsen av lamellipodia utvidelser ved forkanten av invasive celler [8], [10]. Ekspresjonen av WAVE3 også sterkt anriket i flere kreftformer, herunder brystkreft (BC) [11] – [14]. Faktisk ble forbedret uttrykk og aktivitet av WAVE3 vist seg å bidra til metastasering av trippel-negativ brystkreft (TNBC), den mest aggressive subtype av BC [14] -. [16]
Nuclear faktor NFkB aktivering er kjent for å være innblandet i overlevelse, invasjon og metastasering av ulike typer av kreft [17], [18]. Aktivering av NFkB reaksjonsveien er nødvendig for forskjellige fysiologiske og patologiske responser som strekker seg fra montering av en vellykket immunrespons og for overlevelse og proliferasjon av kreftceller [19] – [21]. Den NFkB familie av transkripsjonsfaktorer består av fem medlemmer, p50, P52, Rela (p65), relB og c-Rel, som danner homomeric eller hetero dimers å aktivere transkripsjon av målet gener [22]. I hvileceller, er NFkB opprettholdt i en transcriptionally hviletilstand ved å være sequestered i cytoplasma i protein komplekser med medlemmer av hemmere av IkappaB (IKB) familie, inkludert IκBα, IκBβ, IκBε. I den klassiske veien, kan TNFa indusere IKB kinase (IKK) mediert fosforylering og proteasomal nedbrytning av IκBα, etterfulgt av fosforylering og kjernefysisk translokasjon av p50-p65 heterodimer å aktivere transkripsjon av NFkB målgener [23]. NFkB har blitt vist å stimulere produksjonen av MMPs, inkludert MMP1, MMP3, og MMP9 [24] – [26]. Interessant nok har vi og andre vist at WAVE3 kan også regulere ekspresjon og aktivitet av disse MMP’er, hvilket antyder potensiell rolle WAVE3 /NFkB samspill i reguleringen av MMP9 og invadopodia aktivitet i kreftceller [8], [10].
Her presenterer vi bevis for at metastase fremme aktivitet WAVE3 oppnås blant annet gjennom sin regulering av NFkB signalering i kreftceller. Vi viser at tap av WAVE3 i metastatisk BC MDA-MB-231 celler resulterer i hemming av NFkB aktivitet. Motsatt, overekspresjon av WAVE3 forbedrer NFkB signalering. Vi viser at WAVE3-mediert modulering av NFkB er nødvendig for invadopodia dannelsen og MMP9 ekspresjon og aktivitet som er nødvendig for kreftceller til å degradere ECM. Til slutt viser vi at målrettet-inhibering av WAVE3 sensitizes kreftceller til apoptose og celledød gjennom hemming av AKT og caspase overlevelsesreaksjonsveier nedstrøms av NFkB. Følgelig våre data etablere en ny funksjon for WAVE3 som er avgjørende for reguleringen av NFkB signalering og støtte for bruk av WAVE3 hemmere i kombinasjonsterapier spesifikt mot kreft metastasering.
eksperimentelle prosedyrer
Antistoffer
kanin anti-WAVE3 (1:1000), kanin-anti-MMP9 (1:1000), kanin-anti-MMP2 (1:1000), kanin-anti-p38 (1:1000), kanin-anti p38 fosfo (1:1000), kanin fosfor ERK (1:1000), kanin ERK (1:1000), kanin anti fosfor AKT (Ser473, 1:1000), kanin anti panAKT (1:1000), kanin anti phospho JNK (1 :1000), kanin anti-JNK (1:1000), mus anti-fosfor p65 (Ser536) (1:1000), kanin anti-Cortatcin er fra cellesignalisering Technologies. (Danvers, MA); mus anti-GFP, mus anti-WAVE2 (1:3000), mus anti-Wave1 (1:3000) er fra Santa Cruz Biotechnology Inc (Santa Cruz, CA); kanin anti-p65 NFkB (1:5000) fra Biolegend (San Diego, CA), kanin-anti NAP1 (1:2000), kanin-anti ABI1 (1:5000), kanin-anti CYFIP2 (1:3000), muse anti-actin (1:5000), kanin-anti-Myc (1:1000) er fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO); geit pepperrot-peroksidase-konjugert anti-mus IgG (1:5000) og geit pepperrot peroksidase-konjugert anti-kanin-IgG (1:5000) fra Calbiochem; og Alexa 488-konjugert anti-kanin-IgG og Alexa 568-konjugert anti-mus IgG, Alexa 568-konjugert phalloidin er fra Invitrogen. VECTA-skjold med 4 «, 6-diamidino-to-phenylindole var fra Vector Laboratories (Burlingame, California). Gel elektroforese reagenser var fra Bio-Rad (Hercules, CA).
siRNA og shRNA genuttrykk knockdown
Vi brukte On-Targetplus SMARTpool (Thermo Scientific) siRNA L-012141-00- 0010, L-1012301-00-0010, CYFIP2HSS120271, ABI1HSS11589 (Invitrogen), og SignalSilence IκBα siRNA (Cell Signaling Technology) for forbigående knockdown av ekspresjon av WAVE2, WAVE3, CYFIP2 og henholdsvis ABI1, som tidligere beskrevet (14). Stabil knockdown av WAVE3 ble oppnådd ved transfeksjon av MDA-MB-231 og BT549 BC-celler med enten kontroll-ikke-målsøkende shRNA eller WAVE3 MISSION shRNA kloner (Sigma) etterfulgt av puromycin utvalg av positive kloner som tidligere beskrevet (12).
Cell Culture
Humant MDA-MB-231 BT549 og MCF7 BC-celler ble kjøpt fra American Type Culture Collection (ATCC) og ble opprettholdt i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) supplementert med 10% føtalt bovint serum (FBS), 100 enheter penicillin /ml, 100 ug streptomycin /ml. For stimulering med TNFa, ble cellene først utsettes for serum sult for over natten i DMEM uten føtalt bovint serum, og deretter behandlet med 50 ng /ml TNFa eller fortynningsmidlet DMSO (basalforhold) som den negative kontrollbehandling i 15 min. For proteinsyntese-inhibering, ble celle behandlet med cykloheksimid (CHX; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) ved 50 ug /ml og inkubert i 24 timer. For proteasomhemmingen, ble cellene behandlet med MG-132 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) ved 20 uM konsentrasjon og inkubert i 24 timer. Den Akt-inhibitor MK-2206 (Velg Chemicals, Yorktown, TX) ble anvendt ved sluttkonsentrasjon på 10 uM til behandling av celler i 16 timer mens den IKKβ-inhibitor (EMD Millipore, Billerica, MA) ble anvendt ved den endelige konsentrasjonen av 10 pM til behandling av celler i 24 timer.
Strømningscytometri
MDA-MB-231 eller BT549-celler, transfektert med enten kontroll-ikke-målsøkende shRNA eller shWAVE3, ble behandlet med TNFa etter 3 timer, og dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) dyrkningsmedium supplementert med 10% FBS og puromycin (5 ug /ml). Subkonfluente cellekulturer ble løsnet ved trypsinering og vasket med Hanks balanserte saltløsning med Ca2 +, Mg2 +, og 0,1% BSA. Celler ble bearbeidet for strømningscytometri, som beskrevet av produsenten (Roche In-Situ celledød Detection Kit, Fluorescein). Propidiumjodid er blitt brukt til å påvise døde celler. Alle data ble kjøpt i en BD LSRII instrument og analysert med FlowJo 7.6.3 (Treestar) programvare. Ikke-spesifikk binding av det sekundære antistoff alene til cellene, ble subtrahert fra alle strømningscytometrisk data for å gi de resulterende fluorescens intensitetsverdier som vises.
immunoblotanalyse
helcellelysater inneholder lignende mengder av den totale protein (-50 ug) ble løst i en 10% natrium-dodecyl-sulfat-polyakrylamid-gel, etterfulgt av overføring til nitrocellulose (Bio-Rad, Hercules, CA) eller Immobilon-P (Millipore, Billerica, Massachusetts) membraner ved hjelp av Bio-Rad gel og overføringsapparat. Membranene ble inkubert i 5% helmelk eller bovint serumalbumin i 1 time ved romtemperatur, ble vasket med fosfat-bufret saltvann (PBS), etterfulgt av inkubasjon med det primære antistoff (som angitt) over natten ved 4 ° C. Membranene ble deretter vasket og inkubert i passende sekundære antistoff ved romtemperatur i 1 time, og immunkomplekser ble visualisert ved hjelp av Western-Lys kjemiluminescens deteksjon kit fra Perkin-Elmer (Boston, MA). Signaler ble kvantifisert ved hjelp av ImageJ programvaren i henhold til parametrene beskrevet i ImageJ bruksanvisning (https://rsbweb.nih.gov/ij/docs/guide/146.html). Gjennomsnittsverdier fra 3 forskjellige blotter presenteres.
NFkB luciferaserapportørplasmid analysen
Cignal NFkB reporter analysen kit fra Qiagen Inc (Valencia, CA) ble brukt i henhold til produsentens instruksjoner. I korthet, MDA-MB 231 eller BT549-celler ble ko-transfektert med siWAVE3 eller siWAVE2 med NFkB reporter, negative og positive kontroller, sammen med en Renilla luciferase reporter konstruksjon for intern normalisering. Etter 24 timer ble cellene behandlet med 50 ng /ml rekombinant humant TNFa i 30 minutter med mindre annet er angitt. Dual luciferase-assays (Promega, Madison, WI) ble utført i en 96-brønners plate ved anvendelse av Veritas Mikroplate luminometer (Turner Biosystems, Sunnyvale, CA), og promoteren aktivitetsverdier er uttrykt i vilkårlige enheter etter normalisering til luciferase-aktivitet av Renilla reporter. Forsøk ble utført i tre paralleller, og standardavvikene verdier er angitt.
Immunofluorescence Mikros
Celler ble dyrket på dekkglass og fiksert i 4% paraformaldehyd i 20 min i PBS ved romtemperatur og vasket med PBS. Cellene ble deretter permeabilisert i 0,2% Triton X-100 i PBS i 15 minutter, vasket en gang med PBS, og inkubert i blokkeringsoppløsning inneholdende 5% bovint serumalbumin (Sigma) i PBS i 2 timer ved romtemperatur. Primær så vel som sekundære antistoffer ble fortynnet til de anbefalte konsentrasjoner på 5% bovint serumalbumin i PBS. Celler ble inkubert med det primære antistoff i 1 time, vasket med PBS, og deretter inkubert med det sekundære antistoff i 1 time. Aktin filamenter (F-aktin) ble beiset med rhodamin-konjugert phalloidin (Molecular Probes, Eugene, OR) i PBS. Objektglassene ble montert på objektglass ved hjelp av Vectashield monteringsmedium inneholdende 4 «, 6-diamidino-2-fenylindol (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Fluorescens bilder ble tatt med et Nikon TE2000-E invertert mikroskopi. Signaler ble kvantifisert ved hjelp av ImageJ programvaren i henhold til parametrene beskrevet i ImageJ bruksanvisning (https://rsbweb.nih.gov/ij/docs/guide/146.html). Gjennomsnittsverdier av 5 forskjellige bilder ble plottet.
Gelatin Zymografi
Gelatin zymografi akrylamidgeler (10%) ble fremstilt i henhold til standardprosedyrer [8]. Gelatin ble tilsatt til gelen oppløsning til en endelig gelatin konsentrasjon på 1 mg /ml. Den cellefrie supernatant ble blandet med 2 x prøvebuffer, inkubert ved romtemperatur i 10 minutter, og 25 ul av blandingen ble fylt på gelene. Etter elektroforese ble gelen inkubert i Zymogram renaturering av buffer med forsiktig omrøring i 30 minutter ved romtemperatur, etterfulgt inkubering i Zymogram utvikle buffer ved 37 ° C i minst fire timer. Gelatinase-aktivitet ble visualisert ved å farge gelene med Coomassie Brilliant Blå G250 og avfarget i eddiksyre-metanol-dH
2O (01:03:06). Områder i protease aktivitet ble fotografert med et speilreflekskamera.
Invadopodia formasjon analysen
FITC-gelatin nedbrytnings analysene ble utført i henhold til produsentens prosedyre (Invitrogen). I korte trekk, ble dekkglass (18 mm diameter) belagt med 50 ug /ml poly-L-lysin i 20 minutter ved romtemperatur, vasket med PBS, fiksert med 0,5% glutaraldehyd i 15 minutter og vasket med PBS til 3 ganger. Etter vasking, ble objektglassene snudd på et fall på 0,2% FITC-konjugert gelatin i PBS inneholdende 2% sukrose, inkubert i 10 minutter ved romtemperatur, vasket med PBS til 3 ganger, ble tilsatt natriumborhydrid (5 mg /ml) i tre min, og til slutt inkubert i 2 ml fullstendig medium i 2 timer. Celler (2 x 10
5 hver brønn) ble sådd ut i FITC gelatin-belagte dekkglass og inkubert ved 37 ° C i 12 timer. Invadopodia og ECM degradering ble dokumentert ved hjelp av fluorescens konfokalmikroskopi som beskrevet [27], [28]. Signal analyse og rekonstruksjon av 3D-bilder ble utført ved hjelp av ImageJ programvare.
Statistiske analyser
Data er presentert som gjennomsnitt ± standardavvik av minst tre uavhengige forsøk. Resultatene ble testet for signifikans ved hjelp av en uparet Student
t
test. En
p
verdi mindre enn 0,05 ble betraktet som signifikant.
Resultater
WAVE3 er nødvendig for NFkB aktivitet
For å dokumentere samspillet mellom WAVE3 og NFkB signale har vi brukt et luciferase reporter-baserte NFkB analyse for å vurdere endringer i NFkB-aktivitet i nærvær og fravær av WAVE3. Som en positiv kontroll for NFKB aktivering, brukte vi TNFa, en kjent stimulator av NFkB signalering. Vi fant at TNFa behandling av MDA-MB-231 eller BT549 celler økte NFkB aktivitet med minst tre ganger i begge cellelinjer i forhold til ustimulerte celler (fig. S1 i File S1). Men i WAVE3-knockdown (sh-W3) celler (Fig. 1A innfelt), luciferase-aktivitet, og derfor NFkB-aktivitet, ble redusert med minst fire ganger sammenlignet med MDA-MB-231 transfektert med kontroll ikke-målsøkende shRNA (Ctrl-sh) (fig. 1a). Således WAVE3 var nødvendig for NFkB-aktivitet. Denne inhibering av NFkB-aktivitet var spesifikk for tap av WAVE3 siden knockdown av WAVE2 uttrykk, en annen bølge isoform, hadde ingen effekt på av NFkB-aktivitet (Fig. S2 i File S1).
(A) Luciferase-baserte NFkB reporter analyse i MDA-MB-231 celler med stabil transfeksjon av et ikke-målsøkende shRNA (Ctrl-sh) eller WAVE3-trageting shRNA (sh-W3). (Innfelt) Western blot-analyse av protein-lysater av celler som beskrevet i (A) med anti-WAVE3 antistoff. p-aktin ble benyttet som en kontroll lasting. (*, P 0,05). (B) Western blot-analyse med de angitte antistoffer med proteiner fra lysater Ctrl-sh MDA-MB-231 og to forskjellige shWAVE3-avledede kloner (sh-W3-1 og sh-W3-2), før og etter behandling TNFa (50 ng /mL i 15 min). Tallene under p-p65 og WAVE3 paneler angir antallet gangers endring av p-p65 og WAVE3 nivåer henholdsvis, sammenlignet med de ubehandlede Ctrl-SH-celler. (C) Kvantifisering av p-p65-nivåer i de angitte forhold. (D) Western blot-analyse med p65-antistoff av de nukleære fraksjon lysatene fra den Ctrl-sh og SH-W3 MDA-MB-231-celler, med eller uten TNFa behandling. H2b ble anvendt som en lastekontroll for den nukleære fraksjonen. Tallene under H2b panelet indikerer ganger endring P65 nivåer med hensyn til ubehandlede Ctrl-sh celler. (E) Immuno-farging for kjernefysisk translokasjon (hvite piler) av p65 protein (rød) i Ctrl-sh og shWAVE3 MDA-MB-231 celler. Celler kjerner er kontra farget med DAPI (blå). (F) Kvantifisering av p65 nukleær farging. Alle data er representative for 3 uavhengige eksperimenter, eller er gjennomsnitt ± SD (n = 3; *, p 0,05, t-test)
Fosforylering av NFkB p65 subenheten til serin 536 og dens kjernefysiske translokasjon er nødvendige skritt for NFkB aktivering. Vi fant tap av WAVE3 i MDA-MB-231-celler for å inhibere (3- til 8-gangers reduksjon) p65 fosforylering nivåer (Fig. 1B og 1C). Selv etter stimulering med TNFa, kan p65 fosforylering nivåer i WAVE3-knockdown cellene ikke gjenopprettes til disse nivåene funnet i ikke-måls shRNA-transfekterte celler (Fig. 1B og 1C). Lignende resultater ble funnet i BT549-celler (fig. S3 i File S1). I tillegg, nukleær translokasjon av p65, som er det endelige trinn i aktiveringen kaskade av NFkB signalering, ble også signifikant hemmet i WAVE3-knockdown MDA-MB-231-celler, som målt ved nivåene av p65-proteinet i kjernen (10 gangers reduksjon) av både immunblotting av den nukleære fraksjonen av cellelysatene (fig. 1D) og immunfarging analyser (5-ganger reduksjon) av hele celler (fig. 1E, 1F og fig. S4 i File S1). Igjen, stimulering av WAVE3-knockdown celler med TNFa klarte å øke p65 innenfor kjernefraksjonen til nivåer som finnes i kontrollceller transfektert med kontroll ikke-måls shRNA (Fig. S4 i File S1). Sammen utgjør disse dataene støtter ytterligere involvering av WAVE3 i aktivering av NFkB signalveien.
WAVE3 overekspresjon aktiverer NFkB signale aktivitet
For bedre å forstå hvordan WAVE3 modulerer NFkB signalering, søkte vi en kombinasjon av genetiske og farmakologiske midler for å manipulere effektor molekyler i NFkB pathway. Først undersøkte vi om overekspresjon av eksogene WAVE3 kan påvirke NFkB aktivitet. For å gjøre dette, overexpressed vi enten GFP alene eller GFP-WAVE3 fusjonsprotein i MDA-MB-231 celler og vurderes for NFkB aktivitet. Ved hjelp av luciferase-baserte NFkB reporter-analysen beskrevet i figur 1A, har vi funnet overekspresjon av WAVE3 (fig. 2A) stimulert NFkB-aktivitet ved 3-gangers økning (fig. 2B). I samsvar med denne observasjonen, WAVE3-overexpresion også stimulert ( 3 ganger økning) p65 fosforylering uten å påvirke total p65 uttrykk nivåer (Fig 2C.). Motsatt, behandling med en spesifikk hemmer av IKKβ (IKKβ-I), oppstrøms aktivator av NFkB signalering, avstumpet den TNFa-mediert stimulering av fosfo-p65 i WAVE3-overekspresjon MDA-MB-231 celler (0,9-gangers endring i TNFa og IKKβ-i-behandlede celler sammenlignet med 3,2 ganger endring i TNFa bare behandlede celler (fig. 2D)). Således støtter disse dataene ytterligere rolle WAVE3 i reguleringen av NFkB signalering. Deretter overvåket vi p65 protein fosforylering og omsetning i GFP og WAVE3-overekspresjon MDA-MB-231 celler etter behandling med cykloheksamid (CHX), en potent hemmer av
de novo
proteinsyntesen. Mens fosforylering nivåer av p65 ble øket (~3- til 4-ganger økning) i de WAVE3-overekspresjon-celler, ble behandling med CHX ikke påvirke uttrykket nivåer av total p65 (fig. 2E). Likeledes behandling med MG-132, en forbindelse som inhiberer proteasomet-mediert proteindegradering, påvirket ikke WAVE3-mediert økning av fosforylert p65 i WAVE3 overekspresjon-celler (fig. 2F), mens nivåene av total p65 forble uendret ( fig. 2F). Således er disse data viser at WAVE3-mediert modulering av NFkB-signalering ikke krever medvirkning av WAVE3 i protein neo-syntese (i CHX data, fig. 2E) eller t proteasom-mediert proteinnedbrytning (MG-132 data, fig . 2F).
(A) Western blot-analyse av WAVE3-GFP proteinnivåer i GFP og GFP-W3-uttrykkende celler. (B) Luciferase-baserte NFkB reporter analysen i GFP og GFP-WAVE3 uttrykke celler (*, p 0,05). (C *, p 0,05, t-test)
WAVE3-mediert modulering av NFkB-signalering ikke gjør krever andre medlemmer av WAVE regulatoriske komplekse
WAVE3, som de andre medlemmene av WASP /WAVE familie, er kjent for å fungere som en aktivator av Arp2 /3 komplisert å fremme aktin polymerisasjon og cytoskjelettet ombygging. For WAVE proteiner for å utføre denne cytoskeletal reorganisering funksjonen, må det være inkorporert i en pentamer proteinkompleks, også referert til som WAVE regulerings kompleks (WRC) som, i tillegg til WAVE proteiner, inneholder også NAP1, ABI1 /2, CYFIP2 og HSPC300 [29]. Følgelig vi tok opp spørsmålet om hvorvidt WAVE3-mediert modulering av NFkB signale krever involvering av de andre medlemmene i WRC. Først viste vi at mens siRNA-mediert knockdown av WAVE3 resulterte i en signifikant hemming ( 8-fold reduksjon) av WAVE3 uttrykk, det gjorde ikke påvirke uttrykket nivåer av de fire andre medlemmene i WRC (fig 3A.). Motsatt sirnas rettet mot enten ABI1 eller CYFIP2, noe som resulterte i selektiv tap av uttrykk for sine respektive mål, påvirket ikke uttrykk nivåer av de andre medlemmene i WRC (Fig. 3A). Funksjonelt, og som forventet, WAVE3-knockdown inhibert NFkB signalering (5-gangers reduksjon), som målt ved tap fosforylering av p65 (fig. 3B). Likevel, redusert uttrykk for noen av de andre medlemmene i WRC (ABI1 og CYFIP2) påvirket ikke fosforylering nivåer av p65 (fig. 3B). Videre, mens stimulering med TNF økt p65 fosforylering nivåer i både kontroll og knockdown celler, fosforylering nivåer i WAVE3-knockdown celler var mer enn to ganger mindre enn i kontroll siRNA celler eller ABI eller CYFIP2 siRNA celler (fig. 3B). Sammen tyder disse resultater klart at WAVE3-mediert modulering av NFkB-signalering ikke krever medvirkning av medlemmene av WRC, og derfor representerer en aktivitet på WAVE3 uavhengig av sin tradisjonelle aktin polymerisasjon egenskapen innenfor WRC.
(A) Western blot-analyse med de angitte antistoffer i MDA-MB-231-celler forbigående transfektert med et ikke-målsøkende siRNA (Ctrl-si) eller siRNA rettet mot enten WAVE3 (Si-W3), ABI1 si-ABI1), eller CYFIP2 (SI-CYFIP2). (B) Western blot-analyse med p-p65 og p65 samlede antistoffer fra cellelysatene beskrevet i (A). Tallene under de β-Actin panel angir antallet gangers endring p-p65 nivåer med hensyn til de ubehandlede Ctrl-si-celler. Både i (A) og (B), ble β-Actin anvendt som en lasting kontroll.
ekspresjon og aktivitet av MMP9, en større NFkB målgen, inhiberes av tap av WAVE3
Vi har tidligere vist at stabil knockdown av WAVE3 resulterer i tap av ekspresjon og aktivitet av flere MMPs, inkludert MMP1, 3 og 9 [8]. Blant disse MMP’er, er MMP9 et viktig mål av NFkB veien, øke muligheten for at WAVE3 kan være involvert i NFkB-medierte regulering av MMP9. Først må vi brukte Western blotting for å fastslå at MMP9-ekspresjon ble hemmet på grunn av stabil knockdown av WAVE3; nedgangen i MMP9 protein var ~ 5 ganger i MDA-MB-231 (fig. 4A) og ~4 ganger i BT549-celler (Fig. S5 i File S1). Av notatet, ble uttrykket nivåer av Wave1 og WAVE2 ikke påvirket av tap av WAVE3, og har derfor ingen betydning for endringer av MMP9 nivåer forårsaket av WAVE3-knockdown (fig. 4A). Deretter brukte vi gelatinase zymografi analysen vise MMP9 aktivitet ble også hemmet (5-fold reduksjon) i WAVE3-knockdown celler (Fig. 4B). I tillegg stimulering med TNFa, noe som er en stor aktivator av NFkB signalveien, forsterket (~3.5-gangers økning) MMP9 aktiviteten i kontrollcellene (Ctrl-SH). Men i WAVE3-knockdown celler, stimulering med TNFa var ikke i stand til å aktivere MMP9 på nivåene i (fig. 4C) kontrollcellene. Dermed disse resultatene tyder på at WAVE3-medierte regulering av MMP9 kan utøves gjennom modulering av NFkB-signalering. Derfor kan ekspresjon og aktivitet av MMP9 brukes som avlesning for WAVE3-mediert modulering av NFkB-aktiveringsnivåer.
(A) Western blot-analyse med de angitte antistoffer i cellelysater av MDA-MB-231-celler transfektert med ikke-måls shRNA (Ctrl-sh), og to forskjellige sh-WAVE3 kloner (sh-W3-1 og sh-W3-2). Tallene under WAVE3 og MMP9 panelene angir fold endring WAVE3 og MMP9 nivåer med hensyn til ubehandlede Ctrl-sh celler. p-aktin ble benyttet som en kontroll lasting. (B) Gelatin zymografi aktivert MMP9 og MMP2 i kondisjonert medium av Ctrl-sh to sh-W3 kloner. C) Gelatin zymografi aktivert MMP9 før og etter behandling med TNFa i det kondisjonerte medium av Ctrl-sh og to sh-W3 kloner. I begge (B) og (C), er Red-Ponceau-farget gels vist som lasting kontroller. Tallene under de Zymografi panelene angir ganger endring av MMP9 nivåer med hensyn til ubehandlede Ctrl-sh celler.
WAVE3 er nødvendig for invadopodia dannelse og ECM degradering gjennom NFkB signaliserer
den biologiske betydning av tap av WAVE3 og dens effekt på NFkB signale ble undersøkt ved evnen av kreftceller til å danne invadopodia og forringe ECM, som begge krever MMP9 aktivering drevet av NFkB signalering. MDA-MB-231 celler, som de fleste svært invasive kreftcellelinjer, danner invadopodia
in vitro
når sådd på komponenter av den ekstracellulære matrise. For å overvåke MMP9 aktivitet innen invadopodia, ble MDA-MB-231 celler belagt på fluorescerende gelatin-belagt dekkglass. Etter farging for F-aktin, ble det observert invadopodia som punktlignende klaser av F-aktin på den ventrale overflaten av cellene som er i direkte kontakt med gelatin underlaget (fig. 5A panel a). Disse invadopodia strukturene overlapper med områdene av degradering av gelatinen matrise (fig. 5A, paneler b og c), og kan visualiseres i tre-dimensjonal (3-D) rekonstruerte bilder som invaginations i gelatin seng (fig. 5A panel d) . Cortactin er et velkjent merke for invadopodia (Fig. S6 i File S1). Vi fant at TNFa behandling av MDA-MB-231 resulterte i samlokalisering av WAVE3 med Cortactin på invadopodia strukturer (Fig. 5B), i samsvar med involvering av WAVE3 i invadopodia formasjon.
(A) Confocal mikroskopisk mikrografer av MDA-MB-231-celler dyrket på FITC-merket gelatin og farget for (a) F-aktin filamenter (rød). De hvite pilespisser peke på invadopodia strukturer (hvite flekker). (B) Områder i ECM degradering (svart pil-hode) er vist som svarte flekker. De invadopodia strukturene sammenfallende med områder av ECM degradering i det flettede bildet (c). (D) Når det tre-dimensjonale rekonstruerte bildet de sorte pilene peker på invadopodia (rød) infiltrering av gelatin seng (grønn). (B) Confocal mikroskopiske mikrografer av MDA-MB-231-celler dyrket i kollagen-belagte dekkglass, behandlet med TNFa (50 ng /ul) i 15 minutter, og farget for WAVE3 (venstre panel) og Cortactin (midtre panel). Pil-hoder peke på områder med invadopodia hvor både Cortactin og WAVE3 colocalize i det sammenslåtte bildet i panelet til høyre (gule flekker).
Vi brukte denne gelatin-basert invadopodia analyse for å vurdere effekten av WAVE3 på dannelsen av invadopodia og etterfølgende nedbrytning av ECM av MDA-MB-231-celler. Vi har funnet en signifikant reduksjon både i antall invadopodia (fig. 6A, venstre panel og fig. 6B), så vel som det totale arealet av invadopodia-mediert nedbrytning av gelatin i WAVE3-knockdown-celler sammenlignet med ikke-målsøkende shRNA styre (Ctrl-sh) MDA-MB-231 celler (Figur 6A, midtre panel og fig. 6C). Det var mer enn tre gangers reduksjon (p 0,05) i antall invadopodia (figur 6B.) Og mer enn 10 gangers reduksjon (p 0,05) i området av ECM nedbrytning i WAVE3-knockdown-celler sammenlignet med kontrollceller (fig. 6C). Mens Våre data viser at tapet av WAVE3 hemmer både invadopodia dannelse og nedbrytning av ECM, synes dette fenomen til å påvirke de fleste cellene observert under mikroskop, og grundig analyse av våre data ikke fant en reduksjon i antallet celler som danner invadopodia og forringe ECM, heller, tap av WAVE3 synes å ha en global effekt. Behandling med TNFa, noe som resulterte i en betydelig økning i antall invadopodia i kontrollcellene (p 0,01), var ikke i stand til å redde inhibering av invadopodia forårsaket av manglende WAVE3 (figur 6D & Co.. 6E). Omvendt, over-uttrykk for WAVE3 i de ikke-invasive MCF7- BC celler (fig S7A i File S1), som vi tidligere hadde vist seg å stimulere deres invasivitet [30], resulterte i en klar økning i både invadopodia formasjon og gelatin nedbrytning av TNFa stimulert celler (fig. S7b i File S1).
(A) konfokalmikroskopi mikrografer av kontroll shRNA- eller sh-WAVE3-uttrykker MDA-MB-231 celler dyrket på FITC-merket gelatin og farget for F aktin filamenter (venstre paneler). De hvite pilespisser peke på invadopodia strukturer (hvite flekker).
