Abstract
Doble minutt kromosomer (DMS) har viktige implikasjoner for kreft progresjon fordi onkogener ofte forsterket på dem . Vi har tidligere oppdaget en funksjonelt udefinert gen forsterkes på DMs, Ribosomalt L22-like1 (
RPL22L1
). Forholdet mellom
RPL22L1 Hotell og kreft progresjon er ukjent. Her
RPL22L1
ble preget for sin rolle i kreft i eggstokkene (OC) metastase og dens underliggende mekanisme ble undersøkt. DNA kopiantall og mRNA uttrykk for
RPL22L1
i OC celler ble analysert ved hjelp av data fra Kreft Genome Atlas og Gene Expression Omnibus database. En immunohistokjemisk analyse av kliniske OC prøver ble utført og relasjonene mellom ekspresjonsnivået og clinicopathological faktorer ble vurdert. I tillegg
in vivo Hotell og
in vitro
analysene ble utført for å forstå hvilken rolle
RPL22L1
i OC. RPL22L1 uttrykk var høyere i OC eksemplarer enn i normalt vev, og dens uttrykk nivået var høyt positivt korrelert med invasjonen og lymfeknutemetastase (
P
0,05).
RPL22L1
over-uttrykk betydelig forbedret intraperitoneal xenograft tumor utvikling i nakne mus og fremmet invasjon og migrasjon
in vitro
. I tillegg
RPL22L1
knockdown bemerkelsesverdig hemmet UACC-1598 celler invasjon og migrasjon. Videre
RPL22L1
over-uttrykk oppregulert den mesenchymale markører vimentin, fibronektin, og α-SMA, redusert uttrykk av epiteliale markører E-cadherin, α-catenin, og β-catenin.
RPL22L1
hemming redusert uttrykk for vimentin og N-cadherin. Disse resultatene tyder på at
RPL22L1
induserer epithelial-til-mesenchymale overgang (EMT). Våre data viste at DMs forsterket genet
RPL22L1
er avgjørende for å opprettholde den aggressive fenotype av OC og i utløser celle metastase ved å fremkalle EMT. Det kan brukes som en roman prognostisk markør og /eller effektiv terapeutisk mål for OC
Citation. Wu N, Wei J, Wang Y, Yan J, Qin Y, Tong D, et al. (2015) Ribosomalt L22-like1 (
RPL22L1
) Fremmer Eggstokkreft metastaser ved å fremkalle epithelial-til-Mesenchymale Transition. PLoS ONE 10 (11): e0143659. doi: 10,1371 /journal.pone.0143659
Redaktør: Xin Yuan Guan, The University of Hong Kong, Kina
mottatt: 05.08.2015; Godkjent: 06.11.2015; Publisert: 30.11.2015
Copyright: © 2015 Wu et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: DNA kopiantall analyse av data kan hentes fra oncomine.org (https://www.oncomine.org/resource/main.html) og alle de detaljerte trinnene er innenfor papiret. Alle andre relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Denne studien ble støttet av programstyret for Changjiang Scholars og Innovativ Research Team i University (Grant No. IRT1230 til YJ), National Natural Foundation Science of China (Grant No. 81371617 til YJ), Utestående Youth grunnlaget for Heilongjiang-provinsen i Kina (Grant No. JC201215 til YJ)
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer.
Innledning
Eggstokkreft (OC) er den nest vanligste gynekologisk kreft og den første dødsårsaken [1]. Kreft metastasering, snarere enn primære svulster, er ansvarlig for de fleste kreftdødsfall [2]. På grunn av mangel på definitive tidlige symptomer og egnede markører for OC diagnose på et tidlig stadium, er de fleste av pasientene diagnostisert med sent stadium OC sammen med metastaser, som typisk har en 5-års overlevelse av 30% [3]. Det er viktig å forstå de molekylære mekanismene som er involvert i OC metastaser, og for å bestemme effektive, spesifikke og sensitive molekylære mål som kan brukes til metastase diagnose, prognose, og individuell behandling.
Doble minutt kromosomer (DMS) er cytogenetiske kjennetegnene på genamplifisering [4]. DMS vises i ulike typer av humane kreftceller, men ikke i normale celler [5]. Som ekstra-kromosomale elementer som bærer amplifikasjoner av genomiske DNA-sekvenser, DMS bidra til kreft dannelse og progresjon, onkogener er ofte til stede i de amplifiserte sekvensene og proteinene de koder ofte er overuttrykt [6]. Eksempler på gener forsterket på DMs inkluderer
MYC
i tykktarmskreft [7],
MYCN
i neuroblastom [8],
EGFR
i hjernesvulst [9], og
EIF5A2 product: [10, 11] i eggstokkreft [12]. Som DMs er biler av forsterkede gener inkludert mange onkogener, funksjonelle studier av gener som er forsterket på DMs er en god måte å utforske kandidat onkogener.
Vårt team tidligere identifisert 3q26.2 som opphavet til DMS i menneske eggstokkreft cellelinje UACC-1598, og en rekke gener ble co-forsterket på de samme eggstokkene DMs, inkludert
MYCN
,
EIF5A2
, og
RPL22L1 product: [13 ]. Begge
MYCN Hotell og
EIF5A2
spiller viktige roller i kreft progresjon. Men forholdet mellom
RPL22L1 Hotell og kreft er ikke kjent.
I denne studien, viste vi at
RPL22L1
er vanlig over-uttrykt i klinisk OC enkeltpersoner og sitt uttrykk nivå er sterkt knyttet til tumorinvasjon og metastasering. En
in vivo
Forsøket viste at tvangs uttrykk for
RPL22L1
fremmer intraperitoneal xenograft tumor utvikling i nakne mus, og forbedrer celle migrasjon og invasjon
in vitro
. Videre banke den ned med små interfererende RNA (siRNA) hemmer migrasjon og invasjon
in vitro
. I løpet av denne prosessen,
RPL22L1
overekspresjon resulterte i økt ekspresjon av mesenchymale markører som vimentin og α-SMA, og redusert ekspresjon av epitel-markører, slik som E-cadherin, α-catenin, og β-catenin , noe som indikerer at induksjon av epiteliale-til-mesenchymale overgang (EMT), kan forklare den observerte økning i motilitet og invasjon evne til metastasering. Våre data viste at
RPL22L1
spiller en viktig rolle i prosessen med OC metastaser.
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
Denne studien ble godkjent av Etisk komité Harbin Medical University med følgende referansenummer, HMUIRB20150023. Eggstokkreft microarray (TMA) for immunhistokjemi ble kjøpt fra USA Biomaks (ov951, ov1912, ov6161, Rockville, MD, USA) og Xin Chao (Hova-Can90PT-01, Shanghai, Kina). Begge selskapene følger etiske utsagn for å bekrefte at de lokale etikkomiteer godkjent deres samtykke prosedyrer, alle deltakerne gitt sine skrift informert samtykke og alle anstrengelser hadde blitt gjort for å beskytte pasienten privatliv og anonymitet. De etiske uttalelser gitt av selskaper og protokollen av forsøket hadde blitt sjekket nøye og godkjent av etikkomiteen av Harbin Medical University (HMUIRB20150023). Fire ukers gamle BALB /c mus (spesifikk patogen-fri) ble kjøpt fra SLAC (Shanghai, Kina) og plassert i Harbin Medical University Animal Laboratory. Mus ble holdt under standardiserte lys-kontrollerte betingelser ved romtemperatur (24 ° C) og 50% fuktighet, med fri tilgang til mat og vann. Dyreforsøk ble utført i henhold til anbefalingene i retningslinjene av Forsøksdyr Bruk av Harbin Medical University. Protokollen ble godkjent av etikkomiteen av Harbin Medical University (HMUIRB20150023) og alle anstrengelser ble gjort for å minimere lidelse.
Cellelinjer og cellekultur
Menneskelig eggstokkreft cellelinje UACC-1598, SKOV3, HO-8910, og HO-8910PM ble kjøpt fra Type Culture Collection av den kinesiske Academy of Sciences (Shanghai, Kina). Alle celler ble dyrket følgende metodene som beskrives av ATCC (Manassas, VA, USA), og ble godkjent i 2012 på Micro-lese Genetics Company (Beijing, Kina) med en kort tandem repeat analyse.
Forberedelse av metafase oppslag og fluorescens
in situ
hybridisering (FISH) analyse
Cellene ble høstet for metafase spredning preparat i henhold til metodene beskrevet i tidligere studier [14, 15] og ble farget med Giemsa. To BAC kloner, GFP-RP11-355H10, som spesifikt dekker
MYCN plakater (forsterket i UACC-1598 og ligger på DMs [13]), og Cy3-RP11-726H11 for
RPL22L1
, ble valgt som DNA-prober og hybridisert til metafase sprer av celler som tidligere beskrevet [16]. Kromosomer ble motfarget med DAPI (4, 6-diamidino-2-fenylindol). Bilder ble tatt med en Leica DM5000 B fluorescens mikroskop (Wetzlar, Tyskland), og analysert ved hjelp av MetaMorph Imaging System (Universal Imaging Corporation, West Chester, NY, USA).
DNA kopiantall og genekspresjonsanalyse
De Oncomine DNA kopiantall datasett (https://www.oncomine.org/resource/main.html) omfatter data avsatt i Kreft Genome Atlas (TCGA Ovarian to datasett, http: //TCGA-data. nci.nih.gov/tcga/) ble anvendt for å bestemme forskjeller i DNA-kopi-antall mellom OC og normale blod /eggstokk-vev. 607 eggstokkene serøs cystadenocarcinoma, 431 normal blod, og 130 normale prøver eggstokk vev ble analysert. Data ble innhentet gjennom følgende trinn: type gen navn:
RPL22L1
i søkeboksen og bla treet velge Primær Filter Datasett typen DNA kopiantall datasett. Resultatet av TCGA Ovarian 2 er rett i den første, og grafen var på venstre side. Klikk på histogrammet knappen i øvre venstre hjørne av grafen tittelen for å få et histogram graf. På gruppe filtre over grafen tittelen, klikk på trekanten symbol, i den valgte «Kreft og Normal Type» menyen for å gjøre analysen gruppert etter kreft og normale prøver. Datatilgang krever en akademisk e-postkonto. Forfattere bør kontaktes for påloggingsinformasjon hvis det er nødvendig.
To uavhengige microarray gene expression datasett ble brukt. Begge datasett ble generert ved hjelp av Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array plattform (Santa Clara, CA, USA). De raw.CEL filer for de to datasettene ble lastet ned fra Gene Expression Omnibus (GEO) nettside (GSE27651 og GSE28450) [17, 18], og normalisert med RMA (robust multi-matrise gjennomsnitt) algoritme [19].
QRT-PCR
Total RNA for hver cellelinje ble ekstrahert med høy Pure RNA Isolation Kit (Roche, Basel-Stadt, Sveits) etter produsentens anvisninger. PrimeScript
® RT Reagens Kit Perfekt Real Time (Takara, Dalian, Kina) ble brukt til revers transkribert total RNA. CDNA ble kvantifisert ved hjelp LightCycler
® 480 SYBR Grønn Jeg Master (Roche) i en LightCycler
™ 480 II Real Time System (Roche). De spesifikke primere for humant
RPL22L1
og
GAPDH
var som følger:
RPL22L1
forover-primer, 5′-AGAAGGTTAAAGTCAATGG-3 «og revers primer, 5»-ATCACGAAGATTGTTCTTC- 3 «;
GAPDH
fremover primer, 5′-ATCACTGCCACCCAGAAGAC-3 «og revers primer, 5’TTTCTAGACGGCAGGTCAGG-3». Uttrykk for
RPL22L1
i prøvene ble normalisert til at av
GAPDH Hotell og fold-endring i uttrykket ble beregnet ved hjelp av to
-ΔΔCt metode.
Western blot analyse
Celler ble lysert ved 4 ° C i RIPA (8990, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Cellelysater inneholdende 40μg av total protein fra hver prøve ble applisert på 12% natrium-dodecyl- polyakrylamidgeler og overført til en polyvinylidenfluorid-membran (Millipore, Billerica, MA, USA). Etter blokkering i 10% blokkeringsløsning (Roche), ble membranene inkubert over natten ved 4 ° C med primære antistoffer, etterfulgt av 1-timers inkubasjon med anti-mus /anti-kanin-sekundært antistoff (200-332-263 /610-132-007 , Rockland immunochemicals, Limerick, PA, USA) ved romtemperatur. Bilder ble innhentet ved hjelp av Odyssey Infrared Imaging System (LI-COR biovitenskap, Lincoln, NE, USA) og beskjæres ved hjelp av Adobe Photoshop CS5 (Adobe Systems Inc., San Jose, CA, USA), representant for fem uavhengige eksperimenter. GAPDH ble anvendt som en kontroll. Detaljene i de primære antistoffer er gitt i supplerende materiale S1 Tekst
Tissue microarray
The OC microarray (TMA) ble kjøpt fra USA Biomaks (ov951, ov1912, ov6161;. Rockville, MD, USA) og Xin Chao (Hova-Can90PT-01, Shanghai, Kina). Godkjenning for denne studien ble innhentet før det ble satt i gang fra den lokale regionale etiske komité. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle deltakerne.
Immunohistochemistry
Immunohistochemistry (IHC) studiene ble utført ved hjelp av Powervision
™ Two-Step Histostaining Reagens (Zhongshan Golden Bridge, Beijing, Kina) i henhold til produsentens instruksjoner. I korte trekk, ble TMA seksjoner deparaffinized og vannes ut. For antigen gjenfinning, TMA slides ble mikrobølgebehandlet i 10 mM citratbuffer (pH 6,0) i 8 min. Endogen peroksidaseaktivitet ble blokkert med 3% hydrogenperoksid i 10 minutter. Den TMA Glassene ble inkubert med en 1:50 fortynning av monoklonalt mot humant RPL22L1 (01:50) over natten ved 4 ° C i et fuktig kammer. Glassene ble deretter sekvensielt inkubert med geite-anti-kanin IgG-antistoff-pepperrotperoksidase-konjugater i 30 minutter ved 37 ° C, og 3′-3′-diaminobenzidin ble anvendt som kromogen substrat. Til slutt ble alle lysbilder kontra for kjerner med hematoxylin, dehydrert, og montert. For den negative kontrollen, ble det primære antistoff erstattet med normal kanin IgG. RPL22L1 immunoreaktivitets i TMA prøvene ble evaluert etter tre patologer. Intensiteten av immunoreaktivitets på TMA ble gradert på en skala fra 0 til 3 basert på konsensus av de tre etterforskere.
vektorer
RPL22L1
-ORF ble PCR forsterket og klonet inn i pcDNA3.1 (+) ekspresjonsvektor (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). SiRNA (h) og kontroll siRNA ble kjøpt fra RiboBio (Q000200916-1-B, Guangzhou, Kina). Luciferase reporter plasmid pGL4.17 ble vennlig levert av Dr. ZH Zhong (Institutt for mikrobiologi, Harbin Medical University, Harbin, Kina).
Transfeksjon
Alle plasmider og sirnas ble transfektert inn i cellene bruker Lipofectamine 2000 (Invitrogen) i henhold til produsentens instruksjoner.
Nude mus tumor xenograft modell
dyreforsøk ble godkjent av etikkomiteen av Harbin Medical University (HMUIRB20150023) og utført i henhold til retningslinjer for Forsøksdyr bruk av Harbin Medical University. Fire uker gamle BALB /c nakne hunnmus ble randomisering tilordnet i hver gruppe, fem mus pr gruppe. Hver mus ble injisert med 1 x 10
6-celler (i 200 ul av fosfatbufret saltvann [PBS]). Tumorvekst ble målt to ganger i uken via bioluminesens imaging. Mus ble injisert intraperitonealt med 150μg /g D-luciferin (BIOSYNTH, Naperville, IL) i PBS og bedøvet med 2,5% isofluran. Fotoner som sendes ut fra musene ble registrert av IVIS Lumina (Advanced Molecular Vision, Lincolnshire, UK) og presentert som pseudo-fargebilder er lagt på en grå-skala kroppsbilde. Alle mus ble avlivet av CO
2 innånding 30 dager etter injisert. For å sikre død etter CO
2 kvelning, ble halshugging utført.
Cell migrasjon og invasjon analyser
Transwell celle migrasjon og invasjon analysene ble utført ved hjelp av Corning 8,0 mm Transwell inserts (8 -μm pore størrelse, 24-brønns plate) og BD BioCoat
™ Matrigel
™ Invasion Chambers (Corning Incorporated biovitenskap, Tewksbury, MA, USA) i henhold til produsentens instruksjoner.
Sårtilheling analysen
celle~~POS=TRUNC var riper med en 10-mL pipette tips (i en seks-brønns plate). Fotografier (forstørrelse, × 40) ble tatt umiddelbart, og ved hver 24-timer etter såret før sårene ble åpenbart helbredet. For hver analyse ble forsøkene utført ved ni forskjellige stillinger, og hele analysen ble gjentatt tre ganger.
Immunofluorescence farving
Celler ble fiksert i metanol og blokkert i 1-h med 10% normal geiteserum, 0,3% bovint serumalbumin, 0,05% saponin, og 0,3% Triton X-100 i PBS. De primære antistoffer ble tilsatt og inkubert ved 4 ° C over natten. Celler ble senere vasket med PBS og inkubert med fluorescens-merket sekundært antistoff. En fluorescens mikroskop (Leica) ble brukt til å fange bilder.
statistikker
RPL22L1 protein uttrykk nivåer av TMA ble analysert ved Wilcoxon signerte rang tester. Den χ
2 test ble brukt for å undersøke sammenhenger mellom genuttrykk og kliniske parametre. Andre data ble uttrykt som gjennomsnitt ± SD, og den statistiske betydningen av forskjeller mellom to grupper ble evaluert ved hjelp av to-tailed uavhengig Student
t
-UNDERSØKELSER. Statistisk signifikans ble erklært hvis
P
0,05. Beregninger ble utført ved hjelp av SPSS 13.0. (IBM, Armonk, NY, USA)
Resultater
RPL22L1
ble forsterket via DMs og over-uttrykt i UACC-1598 celler
The OC cellelinje UACC-1598 inneholdt forsterket gener i form av DMS. Onkogen forsterkning på DMS er representativ for tumorgenese, men forekommer ikke i normale celler (figur 1A). Ved hjelp av en FISH analyse, oppdages vi forsterket regioner av
RPL22L1 Hotell som samlokalisert med
MYCN
på DMs (fig 1B). Videre har vi oppdaget forsterkningen av
RPL22L1
i normale eggstokkreft vev, humane lymfocytter, og UACC-1598 celler ved hjelp av PCR (fig 1C). Vi har også undersøkt forsterkningen av
RPL22L1
i ytterligere tre eggstokkreft cellelinjer (S1 Fig). RT-PCR bekreftet uttrykk for
RPL22L1
i forskjellige prøver (figur 1D). Resultatene indikerte at
RPL22L1
ble forsterket via DMs i UACC-1598 celler.
(A) Representative bilder av metafase kromosomer UACC-1598 og normale humane lymfocytter. Pilene viser DMs i UACC-1598 celler (forstørrelse, × 1000). (B) Representative bilder av FISH analyse. Metafase kromosomer UACC-1598 og humane lymfocytter ble påvist med DNA-prober. (A) Red probe viser
RPL22L1 Hotell og (b) grønn probe viser
MYCN
; (C) begge prober ble plassert på samme locus på DMS som indikert ved pilene, (d) rød sonde indikerer
RPL22L1
i normale humane lymfocytter (forstørrelse, × 1000). (C) DNA forsterkning nivåer av
RPL22L1
påvist ved PCR, (D) RT-PCR resultat av mRNA uttrykk nivåer av
RPL22L1
i ulike prøver.
DNA kopiantall og uttrykk nivå av
RPL22L1
i klinisk OC prøver
for å bestemme forsterkningen av
RPL22L1
i klinisk brukte vi Oncomine database (https: //www .oncomine.org) for å analysere DNA-kopi antall profiler av
RPL22L1
i en TCGA eggstokkene datasett (TCGA ovarian 2, https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/) [20 , 21]. Dette datasettet klart indikert en betydelig økning i DNA-kopi antallet
RPL22L1
i OC sammenlignet med normale blod og eggstokk-vev, ved å terskel
P
10
-4 (2A).
(A) DNA kopiantall profiler av
RPL22L1
i en ovarian serøs cystadenocarcinoma datasett registrert i Oncomine database (TCGA Ovarian to datasett) . To uavhengige microarray genuttrykk datasett (B) GSE29405 og (C) GSE27651 fra GEO nettsted ble brukt til å undersøke uttrykket nivået av
RPL22L1
i OC. De raw.CEL filer for de to databasene ble lastet ned og normalisert ved RMA.
RPL22L1
ble mer høyt uttrykt i OC enn i normal eggstokkvev (*
P
0,05, uavhengig Student
t
-test). Representative bilder av RPL22L1 protein uttrykk i (D) OC og (E) matchet tilstøtende normalt vev ved IHC (forstørrelse, × 400).
Videre fikk vi offentlig tilgjengelige GEO uttrykk datasett for å analysere uttrykket av
RPL22L1
i OC prøver. To GEO datasett basert på Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array ble brukt for å evaluere
RPL22L1
mRNA uttrykk nivåer i OC og normale eggstokkene vev. I hver av de to datasettene,
RPL22L1
uttrykk var betydelig høyere i OC enn normalt på eggstokkene vev (Fig 2B og 2C,
P
0,05, t-test).
for ytterligere å undersøke protein uttrykk nivået av
RPL22L1
i kliniske prøver, ble fire OC TMA brukes for IHC analyser. Fargeintensitet ble estimert ved hjelp av en indeks for 0-3 i cellekjernen og cytoplasma (S2 fig). RPL22L1 ble klart uttrykt mer høyt i OC cytoplasma enn at av de tilstøtende normalt vev (Fig 2D og 2E) (
P
= 0,008, Wilcoxons signed-rank test).
Vi har undersøkt assosiasjoner mellom RPL22L1 protein uttrykk nivåer og clinicopathologic variabler. RPL22L1 uttrykk i cytoplasma av OC celler var sterkt assosiert med scene, invasjon, og lymfeknutemetastase (
P
0,05, Pearsons χ
2 test, tabell 1). Disse resultatene indikerte at ekspresjonen av
RPL22L1
er vanligvis høyere i kliniske OC prøver, og dets ekspresjon nivå er assosiert med tumorprogresjon, spesielt med invasjon og lymfeknutemetastase.
RPL22L1
forbedret intraperitoneal xenograft tumor utvikling
in vivo
for å oppdage rollen høyt nivå
RPL22L1
i tumorprogresjon, vi valgte en OC cellelinje med lav RPL22L1 uttrykk, SKOV3, for nærmere funksjonelle studier (fig 3A). SKOV3 celler var stabil transfeksjon med luciferase tidligere og deretter stabil transfeksjon med
RPL22L1 plakater (Fig 3B og 3C). For å undersøke hvilken rolle
RPL22L1
i tumorprogresjon
in vivo
, vi intraperitonealt injisert SKOV3-RPL22L1 og kontrollceller i nakne mus. De xenopodet Tumorene ble målt ved anvendelse av bioluminescens ved 30
th dag etter injeksjon, område av xenograft tumor i mus med SKOV3-RPL22L1 celler injisert var større enn for kontroll-celler injisert (figur 3D). Resultatet antydet at høyt nivå av
RPL22L1
bidra til kreftutvikling.
(A) Uttrykk for RPL22L1 i UACC-1598 og SKOV3 celler ble undersøkt av vestlige blotter. Ekspresjon av
RPL22L1
i SKOV3-RPL22L1 og kontrollceller ble undersøkt ved (B) Western blots og (C) QRT-PCR. (D) Fire uker gamle nakne mus ble injisert intraperitonealt med SKOV3-RPL22L1 eller kontrollcellene og Bioluminescens bilder ble tatt etter 30 dager. (Bar: gjennomsnitt ± SD; *
P
0,05, uavhengig Student
t
-test).
RPL22L1
fremmet OC celle migrasjon og invasjon
for å bekrefte rollen som
RPL22L1
i OC celler, ble UACC-1598 celler behandlet med tre konkrete sirnas mot
RPL22L1 plakater (siRNA-1, siRNA -2, og siRNA-3). Siden siRNA-2 viste den mest effektive knockdown av endogen
RPL22L1
, ble det valgt for senere analyser (S3 Fig). Bortsett SKOV3-RPL22L1 og kontrollcellene, brukte vi en annen to OC cellelinjer HO-8910 og HO-8910PM med lavere
RPL22L1
uttrykk for transient transfektert med
RPL22L1
for videre funksjonell studie (S3 fig). Effekten av
RPL22L1
på cellemotilitet var preget av sårhelende, transwell migrasjon, og Matrigel invasjon analyser. Knockdown av
RPL22L1
i UACC-1598 celler (1598-siRPL22L1) forårsaket klart ression av celler migrasjon og invasjon. Over-uttrykk for
RPL22L1
i SKOV3-RPL22L1, HO-8910 (8910-RPL22L1), og HO-8910PM (8910PM-RPL22L1) celler kan betydelig forbedre celler migrasjon og invasjon (
P
0,05, figur 4). Cell vekst ble analysert ved en MTA-analyse,
RPL22L1
hadde ingen innflytelse på celleproliferasjon (data ikke vist). Disse resultatene antydet at høyt nivå på
RPL22L1
forbedrer OC-celler migrering og invasjon.
(A-D) Representative bilder av sårhelende analyse av celler (forstørrelse x 40). (E-H) migrering av celler ble påvist ved transwell migrasjon analyse, og (I-L) celle invasjon ble evaluert ved anvendelse av en Matrigel invasjon kammer. Eksempler på celler som migrerte gjennom membranen (venstre panel), søyler indikerer tredoble eksperimenter (forstørrelse, × 100, Bar: gjennomsnittlig ± SD *
P
0,05, uavhengig Student
t Anmeldelser – test).
uttrykket nivået av
RPL22L1
påvirkninger OC cellelinje EMT
det har blitt stadig klarere at EMT er en integrert del av utviklingen av epiteliale -avledede tumorer [22, 23]. Vi fant ut at SKOV3-RPL22L1 celler viste en spindel-formet og fibroblastisk morfologi, mens 1598-siRPL22L1 celler utstilt svinn former og økt celle-celle adhesjon (S4 fig). Derfor undersøkte vi om
RPL22L1
indusert EMT kunne redegjøre for
RPL22L1
formidlet endringer i celler motilitet og invasjon. Biokjemiske kjennetegn på EMT inkludere tap av uttrykket av epitel markørproteiner og samtidig økning i mesenchymale markør uttrykk [22, 24]. Western blot og immunofluorescens-analyser ble brukt for å vurdere ekspresjonen av epiteliale og mesenkymale markører. Etter ektopisk over-uttrykk for
RPL22L1
i SKOV3 celler, uttrykk for epitelceller beslutningstakere, for eksempel E-cadherin, β-catenin, og α-catenin redusert, mens uttrykk for vimentin, α-SMA, og fibronektin øket (figur 5A og 5B). I 1598-siRPL22L1 cellene ble ekspresjonsnivåene av mesenchymale markører vimentin og N-cadherin degradert (figur 5C). Disse resultatene antydet at uttrykket nivået av
RPL22L1
påvirkninger EMT i OC celler.
(A) Western blot viste lavere nivåer av epiteliale markører (E-cadherin, β-catenin og α- catenin), og høyere nivåer av mesenchymale markører (vimentin, α-SMA, og fibronektin) i SKOV3-RPL22L1 sammenlignet med i kontrollceller. (B) HVIS analyse viste reduserte nivåer av epiteliale markører (α-catenin og β-catenin) og økte nivåer av mesenchymale markører (fibronektin og vimentin). (C) Western blot analyse viste at knockdown av
RPL22L1
av siRNA resulterte i et redusert nivå av mesenchymale markører (vimentin og N-cadherin) i UACC-1598 celler.
Diskusjoner
DMs er ondartede cytogenetiske markører og er nært korrelert med tumorprogresjon [4]. Tidligere fant vi ut at
RPL22L1
forsterket på DMs, men dens funksjon er uklar. Mange onkogener forsterkes via DMs i ondartede kreftceller [34.38.39], for eksempel
EIF5A2 Hotell og
MYCN
, som begge er plassert på samme locus som
RPL22L1
på DMs. Vi utledes at
RPL22L1
kan være involvert i OC progresjon, og bekreftet dette i en serie av
in vitro Hotell og
in vivo
analyser.
Bruk offentlig tilgjengelig TCGA og GEO uttrykk datasett vi fant både DNA kopiantall og mRNA uttrykk for
RPL22L1
var signifikant høyere i OC vev enn i normale eggstokkene vev. Protein uttrykk for
RPL22L1
ble undersøkt ved IHC ved hjelp av fire OC TMA. Vi fant ut at RPL22L1 uttrykk var ofte høyere i OC vev sammenlignet med normal tilstøtende eggstokkvev (
P
= 0,008, Wilcoxons signed-rank test). Videre fant vi uttrykket nivået var signifikant korrelert med sykdom stadium (81,7% i stadium 2-4 mot 64,5% i trinn 1) invasjon dybde (81,9% i T2-T4 versus 64,5% i T1) og lymfeknutemetastase (86.6 % med versus 70,3% uten metastase), noe som tyder på at det høye nivået av RPL22L1 i OC-celler kan lette invasiv /metastatiske fenotype. Disse funnene understreker en potensielt viktig rolle
RPL22L1
som en underliggende biologisk mekanisme i utviklingen og progresjon av OC.
Resultatene fra IHC analyse indikerte at
RPL22L1
kan være involvert i patogenesen av OC progresjon, spesielt i metastasering. For å bekrefte denne hypotesen, naken mus tumor xenograft, sårhelende, transwell migrasjon, og Matrigel invasjonen analysene ble utført for å undersøke hvilken rolle
RPL22L1
i regulering OC celler motilitet, invasjon. Over-uttrykk for
RPL22L1
åpenbart fremmes svulst utvikling
in vivo Hotell og økt migrasjon og invasjon evne tre OC cellelinjer
in vitro
. Videre knockdown av endogen
RPL22L1
av siRNA i UACC-1598 celler hemmet migrasjon og invasjon
in vitro
. Migrasjon og invasjon er to viktige stadier i metastase [25], og disse funksjonelle analyser sterkt antydet at
RPL22L1
spiller en viktig rolle i å fremme metastase via styrke celle migrasjon og invasjon.
Mange biologiske prosesser er knyttet til migrering og invasjon, inkludert EMT, en nøkkelhendelse i tumorinvasjon og metastase [26]. Over-uttrykk for
RPL22L1
redusert uttrykk av epitelceller markørproteiner (E-cadherin, β-catenin, og α-catenin) og økt uttrykk av mesenchymale markører (vimentin, α-SMA, og fibronektin), som er biokjemiske kjennetegn på EMT [24, 27, 28]. Men etter knockdown av
RPL22L1
i UACC-1598 celler, mesenchymale markører vimentin og N-cadherin var åpenbart nedregulert. EMT spiller en avgjørende rolle i å fremme metastase og i løpet av denne prosessen cellene få migrasjon og invasjon evner, som fremmer metastase [29, 30]. Følgelig sluttes vi at over-ekspresjon av
RPL22L1
sannsynlig indusert EMT for å fremme celle invasjon og metastase.
RPL22L1 er en paralog av RPL22, som er et RNA-bindende protein-komponenten i 60S ribosomal subenhet. Ribosomale proteiner er viktige komponenter i ribosomer hvor cellulære proteiner er syntetisert. Til dags dato har ca 80 ribosomale proteiner er identifisert. I tillegg til deres viktige roller i proteinsyntese, noe ribosomale proteiner er involvert i ekstra-ribosomale funksjoner, slik som DNA-reparasjon, apoptose, transkripsjonen regulering, og translasjonen regulering [31-36]. Et økende antall rapporter har antydet at ribosomale proteiner har onkogene potensial [37-39]. Nylig,
RPL22
har blitt funnet å bli mutert eller nedregulert i forskjellige krefttyper, inkludert T-akutt lymfatisk leukemi, invasive brystcancer, og lunge adenokarsinom. I tillegg
RPL22
direkte undertrykker uttrykk for
RPL22L1
mRNA, og en mangel på RPL22 forårsaker en kompensatorisk økning i RPL22L1 [40, 41]. Disse studiene ort vår formodning om rollen som
RPL22L1
i kreft progresjon.
Til sammen våre resultater antydet at
RPL22L1
spiller en viktig rolle i OC progresjon ved å øke celle invasjon og metastasering via induserende EMT. Som
RPL22L1
er en DM gjennomført forsterket genet, kan våre data bidra til å forklare funksjonen til DMs i kreft.
