Abstract
Sykelighet og dødelighet av prostatakreft (PCA) har økt de siste årene på verdensbasis. Foreløpig eksisterende metoder for diagnostisering og behandling gjør ikke situasjonen bedre, spesielt for hormon ildfast prostatakreft (hrpc). Mangelen på molekylære prober for PCa hindret tidlig diagnostisering av metastase og nøyaktig staging for PCa. I dette arbeidet har vi utviklet en ny aptamer sonde Wy-5a mot PCa cellelinje PC-3 av celle-SELEX teknikk. Wy-5a viser høy spesifisitet overfor målcellene med dissosiasjonskonstanter i det nanomolare området, og ikke gjenkjenner andre testede PCA cellelinjer og andre tumorcellelinjer som ble testet. Fargingen av kliniske seksjoner vev med fluorescerende fargestoff-merket Wy-5a viser at seksjoner fra høyrisikogruppe med metastase oppviste sterkere fluorescens og seksjoner fra benign prostatahyperplasi (BPH) ikke oppviser bemerkelsesverdige fluorescens, noe som tyder på at aptamer Wy-5a kan bindes til protein relatert til utviklingen av PCa. Den høye affinitet og spesifisitet av Wy-5a gjør dette aptamer hold potensial for bruk i diagnose og målrette behandlingen av PCa
Citation. Wang Y, Luo Y, Bing T, Chen Z, Lu M, Zhang N, et al. (2014) DNA Aptamer Evolved av Cell-SELEX for godkjenning av prostatakreft. PLoS ONE 9 (6): e100243. doi: 10,1371 /journal.pone.0100243
Redaktør: Sabato D’Auria, CNR, Italia
mottatt: 18 januar 2014; Godkjent: 23 mai 2014; Publisert: 23 juni 2014
Copyright: © 2014 Wang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne erkjenne økonomisk støtte fra National Natural Science Foundation of China (81172430, 81372728, 21205124 og 81201694) og Grant 973 Program (2011CB935800) og Specialized forskningsfond for doktorgradsutdanning av høyere utdanning i Kina (20120171120059). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft (PCA) er den vanligste ikke-hud svulst i den mannlige befolkningen over hele verden [1]. Nylig har flere studier vist at hendelsen av PCa er betydelig høyere enn for tjue år siden [2]. Oppdaterings statistikk viser at sykelighet av PCA har overskredet lungekreft og bli den vanligste ondartet svulst i menn. Mer enn 238,590 mennesker vil bli diagnostisert med PCa og 29 720 vil dø av metastatisk PCa i USA (US) i 2013, og er den nest største årsaken til kreftdød i amerikanske menn, bak lungekreft [3]. Dessverre, de fleste PCA pasienter i Asia hadde avansert lokal sykdom eller metastaser av den tiden de fikk diagnosen, og dødelighet av PCa kan fortsette å stige i de fleste asiatiske land. Dette kan være forårsaket av forandringer i livet eller kosttilskudd stil og miljø [4].
Ytelsen PCa i tidlig stadium viser en relativt lat kur hos de fleste pasientene [5]. Denne funksjonen har gjort PCa vanskelig å bli lagt merke til og diagnostisert i tidlig stadium. Når pasientene er vondt, er de fleste av dem oppsto det benmetastase. I utgangspunktet er de fleste PCA pasientene er følsomme for androgen deprivasjon terapi (ADT), men varigheten er heterogen, kan det vare fra noen måneder til mer enn 3 år [6]. Til slutt kan PCa utvikle seg til hormon ildfaste prostata kreft (hrpc), som er motstandsdyktig mot konvensjonell terapi. Vellykket kreftterapi basert på tidlig diagnose og nøyaktig oppsetning, som begge krever egnede molekylære prober og biomarkører [7]. Videre er de molekylære nivåforskjeller bestemme fenotypen; personlig behandling er basert på disse ulike biomarkører til å diagnostisere og skille nøyaktig. Men mangelen på molekylære prober for PCA celler hindret tidlig diagnostisering av metastaser og nøyaktig iscenesettelse for PCa. Serum prostataspesifikt antigen (PSA) er en biomarkør for PCA og har vært mye brukt for påvisning av PCa. Konsentrasjonen av PSA er også forbundet med ondartet grad og tumorresidiv. Men PSA ikke en spesifikk markør for PCa siden dets serumnivå øker med benign prostatahyperplasi (BPH) og påvirkes av mange faktorer som for eksempel medisiner (Finasteride), urologiske manipulasjoner, betennelse, eller til og med utløsning [8], [9] . Selv sammen med generalisering av screening med prostata-spesifikt antigen (PSA) testing, ble den diagnostiske rente og tidlig behandling forbedres raskt, men den kliniske studien i Amerika og Europa viser at screening har ingen effektiv på å redusere dødeligheten av PCa [ ,,,0],10], [11]. Så for å forbedre klinisk klassifisering og personlig kjemoterapi, er det fortsatt behov for å finne nye biomarkører eller sonder med mer spesifisitet.
Nylig ble en ny klasse av molekylære prober betegnes aptamer har tiltrukket seg mye oppmerksomhet som molekylære prober for sykdom diagnose og terapi. Aptamerer er single-strandet oligonukleotider som kan foldes inn unike tertiærstrukturer gjennom ulike intra interaksjoner [12]. I likhet med antistoffer som er vilt anvendes i klinikken, kan aptamerer bindes spesifikt til forskjellige mål som varierer fra små organiske molekyler til proteiner [13], [14]. Sammenligning til antistoffer, aptamerer har lav molekylvekt og høyere stabilitet, penetrasjon hurtig vev, manglende immunogenisitet [15] – [18], og spesielt, kan aptamerer bli kjemisk syntetisert og modifisert [19]. Disse fordelene gjør aptamerer allsidige verktøy for diagnostikk [20], bildecytometri [21] og målrettet terapi [22].
aptamerer er generert av SELEX teknologi (Systematisk Evolution of ligander ved eksponentiell berikelse) [20], [23]. Celle-SELEX er en aptamer utvelgelsesprosedyre ved å bruke hele celler som mål, noe som frembringer cellespesifikk aptamerer ved anvendelse av forskjellene på molekylnivå mellom to cellelinjer [19], [24] – [27]. Av Cell-SELEX, et panel av aptamerer som specically binder å målrette cellelinje kan identifiseres uten å vite det eksakte membranproteiner. I prosessen med berikelse, de levende cellene forsikre målene eksisterende på membranen beholde sin natur formasjon, slik at de oppnådde aptamerer vil opprettholde den samme affinitet og spesifisitet i deres cellulære programmer [28]. I denne artikkelen beskriver vi aptamer utvalg mot PC-3 celler (PCA cellelinje). Gjennom celle-SELEX identifiserte vi en DNA aptamer, som spesifikt binder seg til PC-3 celler og kan skille BPH prøver og høy risiko PCA prøver fra klinikken.
Diskusjon
Aptamer utvalg mot
Resultater og PC-3-celler
fremgangsmåte ifølge aptamer valg er vist i figur 1. Den mål-cellelinje PC-3 er en typisk cellelinje fra androgen uavhengig cancerpasient med osseous metastase. Androgen uavhengige kreftpasienter med osseous metastaser er mest vanskelig å behandle. For å generere aptamerer med høy spesifisitet, har vi brukt mer enn en type cellelinje som negativ kontroll for telleren utvalg, inkludert nontumor-udødelig prostata epitelceller linje RWPE-1, human hepatisk karsinom cellelinje SMMC-7721 og human cervical cancer cell linjen Hela.
For første runde valg, ble målcellene inkuberes med tilfeldig DNA bibliotek bassenget. Etter vasking ble forble sekvenser på celler forsterket ved hjelp av polymerase-kjedereaksjon (PCR), og separert i enkelt-trådede sekvenser for den andre runden valget. Fra den andre runden seleksjon, ble de negative cellene inkubert med den anrikede basseng før den målcellebindende for å eliminere de sekvenser som er bundet til de vanlige molekyler tilstede på overflaten av målcellene og kontrollceller. For hver to eller tre runder av utvalget, ble aptamer berikelse overvåkes av flowcytometri og confocal bildebehandling. Hvis aptamer sekvenser ble anriket, fluorescens intensitet på overflaten av PC-3-celler ble sterkere etter inkubering av cellene med de valgte bassenger. Som vist i figur 2A, fluorescens intensitet på overflaten av PC-3-celler i stor grad økt i de første ti runder med utvelgelse, og fluorescensen forbedring på kontrollcellene (SMMC-7721, figur 2B) var mye mindre, noe som indikerer at aptamerer for målet celler ble sterkt beriket. Men etter utført ytterligere fem runder med valg, selv om fluorescens på PC-3 celler var likevel sterkere enn på kontrollceller, fluorescens forbedring på PC-3 celler ble tregere og at på kontrollceller ble raskere, noe som tyder på at mer uspesifikke sekvenser som er bundet til begge cellelinjer ble anriket. Konfokal imaging (figur 2C) viste at aptamerer bindes på membranen til målcellene. Etter ytterligere to runder med utvelgelse med sterkere telleren seleksjon, ble den 17 runde bassenget klonet og 50 kloner ble sekvensert.
Strømningscytometri-analyse av utvalgte bassenger binding for å målrette cellelinje PC-3 (A) og negativ kontrollcelle linjen SMMC-7721 (B), er Blank bakgrunnen fluorescens av ubehandlede celler. Lib er FITC-merket DNA-bibliotek som negativ kontroll. (C) Confocal avbildning av PC-3 celler farget av det 15. runde valgt basseng merket med FITC (× 100 olje nedsenking linse).
Identifikasjon av aptamerer mot målceller
etter justering, ble de oppnådde sekvenser av 50 kloner funnet å distribuere til 5 familier i henhold til de likheter med tyven sekvenser. Gjennom analyse av den forutsagte sekundære struktur av sekvensene i hver familie [29] – [31], seks sekvenser ble avkortet og syntetisert for bindings-forsøket (sekvenser som ikke er vist). Flowcytometri analyse viste at en sekvens, Wy-5a viste den sterkeste binding til PC-3 celler og de svakeste binding til andre celletyper (Figur S1); derfor denne sekvensen ble videre karakterisert. Den sekundære strukturen forutsigelse [32] har vist at Wy-5a vedtatt en stilk-løkke struktur med en en-basen bule på stammen (figur 3). Fjerne en-basen bule, ble en perfekt stilk-løkke struktur sekvens Wy-5b (tabell 1) også syntetisert for ytterligere karakterisering. Bindingsanalysen viste at Wy-5a og Wy-5b spesifikt bundet til PC-3 celler (figur 3). De likevekt dissosiasjon konstanter (
K
d) av Wy-5a og Wy-5b ble beregnet til å være 73,59 ± 11,01 og 173,1 ± 44,67, noe som indikerer at aptamer Wy-5a har høyere affinitet til PC-3 celler enn Wy-5b. Jo høyere affinitet Wy-5a tyder på at en-basen bule på stammen av Wy-5a kan innebære at binding til dens mål. På grunn av den høyere affiniteten til Wy-5a, ble det videre karakteriseres som en ny probe for deteksjon PCa.
Konsentrasjonene av DNA er 0, 1,0, 2,0, 4,0, 8,0, 16, 32, 64, 128 og 256-merket DNA-bibliotek (Lib). Den antatte sekundære strukturen i Wy-5a og wy-5b (til høyre), var gjenoppbygge av verktøyet tilbys av Integrerte DNA Technologies (IDT). [Www.IDTdna.com/page/scitools].
spesifisitet av utvalgte aptamerer
Spesifisiteten av Wy-5a til andre tumorcellelinjer ble undersøkt ved flowcytometri og confocal imaging (figur 4). Blant alle de testede cellelinjene, Wy-5a bare bundet til PC-tre cellelinje, ikke binde seg til andre PCA cellelinjer (som DU145, fra PCa hjernemetastaser med moderat metastatisk potensial; 22RV-en, fra lokale PCa uten metastatisk potensielle), og andre kreftcellelinjer, inkludert lungekreft-cellelinje (A549), human brystcancer cellelinje (MCF-7), human cervical cancer cellelinje (HeLa), hepatomcellelinje (SMMC-7721), kolon kreftcelle linjer (LoVo og HCT-8), leukemicellelinje (Jurkat) og kronisk myelogen leukemi-cellelinje (K562) (tabell S1). Disse resultatene indikerer at aptamer Wy-5a har utmerket spesifisitet til mål-cellelinje. Den høye spesifisiteten gjør Wy-5a har potensial for bruk i deteksjon av metastaser PCa eller et verktøy for mål terapi
Row A, målrette cellelinje PC-3.; Row B, SMMC-7721; Row C, HeLa; Rad D, 22RV-1. Colum 1, fluorescens bilder; Colum to, overlapping av fluorescens bilder og lyse felt bilder, Colum 3, Histogram Plot av Flowcytometri. Blank er bakgrunnsfluorescens av ubehandlede celler henholdsvis; Lib er FITC-merket DNA-bibliotek som negativ kontroll.
De bindingssteder i aptamer på målcellene
confocal bildebehandling har vist at de oppnådde aptamerer bundet på celleoverflaten ( Figur 2C og figur 4, rad A), og således en proteinase fordøyelse eksperiment ble utført for å verifisere om målmolekylet er et membranprotein. Som vist i figur 5, etter behandling med trypsin eller proteinase K i 2 minutter, PC-3-celler nesten ikke binder Wy-5a, noe som indikerer at målmolekylet av aptamer Wy-5 er et membranprotein.
etter behandling med trypsin eller proteinase K, PC-3 celler nesten ikke binde Wy-5a. Blank er bakgrunnen fluorescens av ubehandlede celler henholdsvis.
Den internalisering av Wy-5a
Tidligere studier har vist at oligonukleotider lengre enn 25 baser ikke fritt kunne trenge gjennom membranen [33] , [34]. Wy-5a er en 52-basen oligonukleotid, den er rettet mot en membran protein. For å undersøke hvorvidt Wy-5a kan internal inn i cellene via reseptor-mediert endocytose, ble PC-3-celler inkubert med Wy-5a ved 37 ° C i 2 timer. Økningen av tempreture fra 4 ° C til 37 ° C ikke mye påvirke bindingen av Wy-5a til PC-3-celler (fig S2). Flowcytometri-analysen (figur 6) viser at forbehandling av cellene med trypsin forårsaket nesten fullstendig tap av aptamer binding (sammenlignet med ubundet DNA labrary). Men behandling av celle med trypsin etter aptamer bindende bare forårsaket delvis tap av aptamer binding, noe som tyder på at noen Wy-5a kan internalisere inn i cellene. I konfokalt bilde av PC-3-celle etter inkubasjon med Wy-5a ved 37 ° C i 2 timer (figur 6), sterk fluorescens signal ble observert på cellemembranen og svak fluorescens signal ble funnet i hele celler. Men confocal bilde av celler icubated DNA bibliotek viste ikke signifikant fluorescens signal med unntak av noen uspesifikke lyspunkter dispersedly adsorbert på celler. Disse resultater antyder at Wy-5a kan være involvert i reseptormediert endocytose
W /O-behandling:. Celler ble inkubert med Wy-5a; Forbehandling: Cellene ble forbehandlet med trypsin og deretter inkubert Wy-5a; etterbehandlings: cellene ble inkubert Wy-5a, og deretter behandlet med trypsin; Lib: negtive kontroll, ble cellene inkubert med FITC-merket DNA-bibliotek; blank. er bakgrunnen fluorescens av ubehandlede celler
Den farging av kliniske PCa glir
Over resultater hav vist at aptamer Wy-5a har utmerket spesifisitet til PC-3 celler enn DU145 og 22RV-1 celler. PC-tre cellelinjen ble initiert fra et bein metastasering av en klasse IV androgen uavhengig PCa pasient. Videre er det skjelettmetastasene den vanligste metastatiske reiser i fremskreden fase PCa, observert i opptil 80% av pasientene [35]. DU145 ble avledet fra PCa hjernemetastaser med moderat metastatisk potensiale, og er ikke hormonsensitiv [36]; 22RV-1 er en human cellelinje PCa uten metastatisk potensiale avledet fra en xenograft i mus [37]. Derfor målproteinet av Wy-5a kan ha sammenheng med aggressivitet eller metastase. Dermed aptamer Wy-5a kan ha potensial i tumorklassifisering og iscenesettelse. For å teste muligheten for Wy-5a for svulst klassifisering og iscenesettelse, brukte vi denne aptamer å farge PCA vevssnitt fra kliniske pasienter. Den negative kontrollen er BPH vev, en utbredt noncancerous endring i aldrende mann. Tumorvev ble fått fra pasienter med PCa (identifisert av senior patolog, den tredje tilknyttet sykehuset av Sun Yat-Sen University). Seksjonene ble kuttet fra formalinfiksert parafin-embedded (FFPE) vev, og membran antigener ble reparert ved koking EDTA Antigen Retrieval Solution før farging. Som vist i figur 7, etter farget med FITC (fluoresceinisotiocyanat) merket aptamer Wy-5a, kreft vev utviste sterk fluorescens-signal. Men fluorescens signalet ble knapt observert på lysbildet av BPH vev
Sjelden fluorescens signal. (-) Ble observert på BPH lysbilder. I godt differensiert prostatakreft, Gleason Resultat: 2 + 3, ingen bevis for annet organ metastaser, veldig svak fluorescens signal (+) ble observert. I prostatakreft pasient lavt differensiert, Gleason Resultat: 5 + 5, med bein metastasering, ble sterk fluorescens signal (+++) observert. (Colum 1) HE farging av parafin delen fra klinisk prøve, (Colum 2) Bright felt av konfokal, (Colum 3) Fluorescence signal av konfokal.
farging av alle lysbilder ble oppsummert i tabell 2 . Helt, alle de 10 BPH lysbilder fra ulike pasienter viste negative resultater og 20 kreft glir ut av 28 tilfeller av kreft vev viste positive resultater. Kun åtte tilfeller av kreft lysbilder kan ikke være farget av aptamer. Sammenligning av Gleason score på kreft vev og medisinske posten av pasientene, fant vi et interessant fenomen: lysbildene fra pasienter med høy Gleason score ( 6) med benmetastaser viste sterkere fluorescens på cellemembranen enn lav score (≤6 ) uten metastase (figur 7). Dette indikerte at målproteinet av Wy-5a sterkt uttrykt i disse høye resultater pasienter med metastasering. Den Gleason gradering systemet er et kraftig verktøy for å prognosticate og hjelpemiddel i behandlingen av menn med PCa. Basert på patologisk struktur av flenser, epitelial, blir vevet bilde klassifisert i fem typer. Fra den første til den femte type, graden av differensiering reduseres gradvis [38]. Siden Gleason score reflekterer malignitet grad av PCA kan disse resultatene antyder at målet protein av Wy-5a kanskje har noen sammenheng med ondartet grad eller aggressivitet eller progresjon av tumor. Videre protein identifisering og evaluering vil bli gjennomført for å belyse dette spørsmålet. Dette settet med resultatene tyder aptamer Wy-5a har potensial til å tjene som probe for diagnostisering av PCa.
PCA pasienter med tilbakefall eller i avansert stadium vil etter hvert bli hrpc og viser ingen svarer på ADT [6]. Utviklingen av sin legemiddelresistens i tillegg til hormon Ingen respons, må effekten av behandlingen frustrerende [39]. Imidlertid heterogen varighet indikerte at typene og manifestasjoner av pasientene er forskjellige. Nøyaktig klassifisering av type eller klasse er nyttig for å forbedre effektiviteten av behandlingen. Derfor mer diagnostiske reagenser er nødvendig for å kunne velge den optimale personlig terapi. Noen kjemoterapeutika er effektive in vitro, men manglende celle-selektivitet, alvorlige toksisitet og bivirkninger begrenset deres bruk in vivo. Aptamer mediert målrettet medisin kan være en god løsning. Inntil nå dagene, har bare en RNA aptamer sikte på PCa blitt generert av tradisjonelle SELEX prosess, dvs. aptamer mot PSMA (prostata spesifikt membranantigen, bare uttrykt i LNCaP cellelinje) [40]. For vanligvis cellelinje PC-3, er det fortsatt ingen oligonukleotid aptamer utviklet seg. Nylig aptamer basert levering av legemidler har vist gode resultater [41]. Den høye affinitet og spesifisitet til PC-tre cellelinje og til kreft vev med høy risiko og metastasering innebærer at DNA aptamer Wy-5a hold potensial innen klassifisering, gjenkjenning og målet terapi av PCA pasienter.
Experimental §
Cell kultur
Twelve etablert cellelinjer ble brukt: RWPE-en er et udødelig normal menneskelig prostata epitel cellelinje. PC-3, DU-145 og 22RV-en er menneskelige PCA cellelinjer. SMMC-7721 er en human leverkreft cellelinje. LoVo og Hct-8 celler er colorectal carcinoma-cellelinjer. HeLa er en menneskelig livmorhalskreft cellelinjer. A549 er en human lunge-cancercellelinje. MCF-7 er et humant bryst kreft cellelinje, Jurkat er en akutt T-celle leukemi-cellelinje K562 er en kronisk myelogen leukemi-cellelinje. RWPE-en, PC-3, DU-145, 22RV-en, SMMC-7721 og LoVo cellelinjer ble kjøpt fra Typisk kultur bevaring kommisjon cellen bank, Chinese Academy of Sciences (Shanghai, Kina). HeLa, A549, MCF-7, Jurkat og K562 ble kjøpt fra Institutt for medisinske Science ved Chinese Academy of Medical Sciences (Beijing, Kina). RWPE-1 ble dyrket i keratinocytt Serum Free Medium (K-SFM) med bovint hypofyseekstrakt (BPE) og human rekombinant epidermal vekstfaktor (EGF), de andre tumorcellelinjer ble dyrket i RPMI 1640 dyrkningsmedium supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS, GIBCO) og 100 enheter /ml penicillin streptomycin (Sigma). Alle cellelinjer ble holdt ved 37 ° C og 5% CO
2 inkubator. I hele prosessen, må alle viktige indeks over vokser på celler holde stabil og celler ble holdt i en god tilstand, som etablere et stabilt grunnlag for videre forsøk.
Buffer
Vaske buffer ble forberedt ved å tilsette 5 mmol MgCl
2 og 4,5 g glukose i en L 0,01 M PBS (inneholder 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 3,58 g Na
2HPO
4 · 12H
2o, 0,272 g KH
2PO
4 per 1 L DDH
2o. pH = 7,4) uten kalsium og magnesium. Bindingsbufferen ble fremstilt ved å tilsette 1 mg /ml bovint serumalbumin (BSA, Sigma) og 0,1 mg /ml laksesperm DNA (Invitrogen) i vaskebuffer.
SELEX ssDNA-bibliotek og PCR-primere
HPLC-renset bibliotek inneholdt en sentral randomisert sekvens på 45 nukleotider (nt) flankert av 20-nt primer hybridisering nettsteder (5′-ACGCTCGGATGCCACTACAG-45nt-CTCATGGACGTGCTGGTGAC -3 «). En fluoresceinisotiocyanat (FITC) -merket 5′-primeren (5»-FITC-ACGCTCGGATGCCACTACAG-3 «) og en biotinylert (Bio) 3′-primer (5′-Bio-GTCACCAGCACGTCCATGAG-3») ble brukt i PCR-reaksjonene for syntese av dobbeltmerket, dobbel-strengede DNA-molekyler. Etter denaturering i alkaliske forhold (0,2 M NaOH), er FITC- konjugert forstand ssDNA aptamer skilt fra biotinylated anti ssDNA tråd med streptavidin-belagte sepharosekuler (streptavidin Sepharose High Performance) (GE Healthcare, Sverige) og brukes for neste runde valg eller bindingsanalysen. Utvelgelsesprosessen ble overvåket ved hjelp av strømningscytometri-analyse og konfokalt avbildnings.
Prosedyre av SELEX
Fremgangsmåten i celle-SELEX er lik den som tidligere beskrevet [42]. I korthet ble fremgangsmåten utført som følger fremgangsmåten (figur 1). Før hver runde av SELEX, den målceller PC-3 ble dyrket til 80~90% konfluens og de negative celler ble dyrket til å fullføre konfluens i 60-mm petriskål og vasket tre ganger med PBS foravkjølt. 10 nmol innledende ssDNA bibliotek ble oppløst i 1 ml bindingsbuffer ble denaturert ved 95 ° C i 5 minutter og holdt i isbad i 15 minutter, deretter plassert i romtemperatur omtrent en halv time før bruk. Etter inkubering biblioteket bassenget med målcellene ved 4 ° C i 1 time, ble den opprinnelige biblioteket oppløsningen fjernet. Etter å ha vasket med vaskebuffer klebe celler ble skrapet av og samlet opp i en 2 ml rør og vasket på nytt. De bundne DNA ble eluert ved tilsetning av 500 ul av DDH
2o inn i røret, og oppvarming til 95 ° C i 5 min. Etter sentrifugering ble supernatanten anvendt som templat, og amplifisert ved PCR med primerne er merket med FITC eller biotin (10-15 sykluser med 30 sek denaturering ved 95 ° C, 30 sek annealing ved 59 ° C og 30 sek ved forlengelse 72 ° C, den siste runden, etterfulgt av 5 minutter ved 72 ° C;. holde produksjonen ved 4 ° C for Taq-polymerase og dNTP-er ble erholdt fra Takara). Det FITC-merket ssDNA forstand bassenget ble separert fra PCR-produktet ved streptavidin-belagte Sepharose-kuler for den neste runden valg. Fra den andre seleksjonsrunde, ble de negative cellene inkubert med den ssDNA basseng første teller for valg, da den negative celler bundet med uspesifikke sekvenser ble fjernet ved sentrifugering. Supernatanten ble inkubert med målceller for å berike den spesifikke sekvenser. Utvelgelsesprosessen ble overvåket ved hjelp av flowcytometri og confocal bildebehandling. Fra 2. til 5. runde, ble RWPE-1 celler brukes til disken valg; fra 6. til 8. runde, ble SMMC-7721 brukes til disken valg; fra 9nde-10nde runde valg, ble Hela celler brukes for teller valg. Etter 10. runde, ble HeLa og SMMC-7721 celler brukes til disken utvalg separat i hver runde. For å oppnå aptamerer med høy affinitet og spesifisitet, ble trykket av valget forbedret gradvis fra 1 til 15 valg ved å redusere mengden av ssDNA bassenget (fra 100 pmol til 50 pmol), inkubasjonstiden for målcellene (fra 60 min til 30 min), og målcellen nummer (fra 7,5 millioner /10 cm plate til 1 million /3,5 cm plate) og ved å øke antallet vaskinger (fra to til tre). I de to siste rundene av styrket utvalg (16.-17), reduserte vi bassenget til 30 pmol, inkubasjonstid på 15 minutter og øke vasking fire ganger med sterkere risting. Totally 17 runder av utvalget ble utført før sekvensering. Klone og sekvensering ble utført av Sangon Bioteknologi Co, Ltd, etter
flowcytometrisk analyse
For å overvåke anriking av aptamer sammen med fremdriften av SELEX, målcellene og negative celler var dyrket i monolag med 80~90% konfluens, deretter dissosiert cellene med 0,02% EDTA etter vasket med PBS en gang ved romtemperatur. Etter å ha vasket med kald vaskebuffer to ganger,-celler (2 x 10
5) ble inkubert med FITC-merket ssDNA bassenger eller utvalgte DNA-sekvenser (0,25 um) i 200 ul bindingsbuffer ved 4 ° C i 30 minutter. Før strømningscytometri-analyse ble cellene vasket to ganger med kald vaskebuffer og filtrert med en 400 mesh sikt celle. Fluorescens ble bestemt med FACScan cytometer (Becton Dickinson) ved å telle 1 × 10
4 arrangementer. Den FITC-merket bibliotek bassenget ble brukt som en negativ kontroll.
Farging av menneskelig svulst vev seksjoner ved hjelp valgt aptamer
Parafin vevsblokker ble levert av patologi avdeling tredje tilknyttet sykehuset, Sun Yat- sen-universitetet (Guangzhou Kina). Forbehandlingen av seksjonene (5 um tykke) ble utført som beskrevet tidligere [43], [44]. Antigenet gjenfinningsprosess er lik med Immunohisto-kjemi. Vevssnittene ble deparaffinated i xylen to ganger (10 minutter hver gang) etter holdt i konstant temperatur ovn ved 60 ° C i 20 min. Bruk gradient etanol (100%, 95% og 70%) for å rehydrere seksjon og skylle skinnene i deionisert vann. Etter vask i PBS i 5 min, alle delene ble satt i TE-buffer (inneholder 10 mmol Tris, 1 mmol EDTA per 1 L DDH
2O, pH = 8,0) og raskt oppvarmet til koking ved mikrobølgeovnen, og deretter holde temperatur ved 95 ° C i 15 min for å hente antigener og naturlig avkjøling til romtemperatur, deretter vasket tre ganger med fersk PBS. Etter histologisk prosess, ble vevssnittene inkubert med bindingsbuffer inneholdende 20% FBS og 0,1 mg /ml laksesperm-DNA ved romtemperatur i 60 min og deretter inkubert med 250 nM FITC-merket aptamerer i bindingsbuffer 60 min ved 4 ° C. Da disse vevssnitt ble vasket tre ganger med fersk PBS, tørket og forseglet ved Antifade Polyvinylpyrrolidon monteringsmedium. Til slutt ble de fargede seksjoner fotografert av roterende disk confocal fluorescens mikroskopi (Olympus IX71, Japan). FITC var spent med en 488 nm argonionlaser (Mells griot, CA) .De fluorescens signalene ble observert av en 40 × objektiv (NA 0,90, UPLSAPO, Olympus, Japan). Bildene ble analysert ved FV10-ASW Version 3.1.
Affinitet og spesifisitet av det aptamer
14 cellelinjer ble brukt for å teste spesifisiteten av de aptamerer ved strømningscytometri-analyse som beskrevet ovenfor. For å teste affinitet forskjellige aptamerer til PC-3cell, ble forskjellig konsentrasjon av aptamerer inkuberes med 2 × 10
5 celler ved 4 ° C, og deretter analysert ved flowcytometri. Den midlere fluorescensintensitet av hver prøve ble trukket fra den midlere fluorescensintensitet av bakgrunn. Likevekts-dissosiasjons-konstanter (
K
d) i aptamer-celle-interaksjon ble oppnådd ved å montere avhengighet av fluorescensintensiteten av spesifikk binding av konsentrasjonen av aptamerer til ligningen
Y
=
B
max
X Twitter /(
K
d +
X
), ved hjelp av Sigmaplot (Jandel, San Rafael, CA) [ ,,,0],25].
Proteinase behandling av celler
PC-3-celler ble vasket to ganger på fatet med PBS ved romtemperatur, dissosiert med 0,02% EDTA. Etter å ha vasket, 2 x 10
5cells inkubert med 200 ul av 0,05% trypsin og 0,1 mg /ml proteinase K ved 37 ° C i 2, 5 og 10 min henholdsvis. Reaksjonen ble avsluttet ved tilsetning av komplett medium. Etter vask ble de behandlede cellene inkubert med aptamer og anvendt for strømningscytometri-analyse som beskrevet tidligere.
Confocal bilde av celler
konfokal fluorescens mikroskopi ble benyttet for å observere binding av aptamerer til levende celler. 2 × 10
4 celler ble dyrket i 35 mm Glass Bottom oppvask for mer enn en dag for å få et godt forlengelse. Etter å ha vasket med kald vaskebuffer, ble cellene inkubert med aptamerer (0,25 um) ved 4 ° C i 30 minutter. Etter vasket to ganger, celler ble fotografert av roterende disk confocal fluorescens mikroskopi (Olympus IX71, Japan). FITC var spent med en 488 nm argonionlaser (Mells griot, CA) .De fluorescens signalene ble observert av en 40 × objektiv (NA 0,90, UPLSAPO, Olympus, Japan). Bildene ble analysert ved FV10-ASW versjon 3.1.
Den internalisering av den aptamer
målcellen PC-3 ble dissosiert med 0,02% EDTA. Etter vasking ble cellene delt inn i 5 rør. En tube uten noen behandling som blank; en Røret ble inkubert med 0,25 pM FITC-merket DNA biblioteket som negtive kontroll; en Røret ble inkubert med 0,25 pM FITC-merket Wy-5a som positiv kontroll; en tube ble forbehandlet med 0,05% trypsin i 10 minutter og deretter inkubert med 0,25 pM FITC-merket Wy-5a (før behandling); en Røret ble inkubert med 0,25 pM FITC-merket Wy-5a, og deretter behandlet med 0,05% trypsin i 10 minutter (etter behandling). Alle inkuberingene med DNA ble utført ved 37 ° C i 2 timer i serumfritt RPMI 1640 medium. De fem prøver ble brukt for strømningscytometri-analyse som beskrevet ovenfor. For det konfokale observasjon, ble PC-3-celler inkubert med 0,25 pM FITC-merket Lib eller Wy-5a i serumfritt RPMI 1640-medium ved 37 ° C i 2 timer og deretter påføres for avbildning, som beskrevet ovenfor.
støtte Informasjon
Figur S1.
Strømningscytometri undersøkelser av celler etter inkubasjon med tdifferent aptamerer. Blank. Er bakgrunnen fluorescens av ubehandlede celler
doi: 10,1371 /journal.pone.0100243.s001 plakater (TIF)
Figur S2.
Strømningscytometri-analyse av PC-3-celler etter inkubasjon med Wy-5a ved 4 ° C eller 37 ° C. Bindingsevnen av Wy-5a viser ingen forskjell ved 4 ° C eller 37 ° C. Blank. Er bakgrunnen fluorescens av ubehandlede celler
doi: 10,1371 /journal.pone.0100243.s002 plakater (TIF)
Tabell S1.
