Abstract
En kvantitativ bio-imaging plattformen er utviklet for analyse av menneskelig kreft formidling i et kortsiktig virveldyr xenotransplantasjon analysen. Seks dager etter implantasjon av kreftceller i sebrafisk embryoer, automatisert bildebehandling i 96 brønners plater koblet til bildeanalyse algoritmer kvantifiserer sprer seg over hele verten. Funn i denne modellen korrelerer med atferd i langsiktige gnager xenograft modeller for plater av poorly- versus høyt ondartede cellelinjer avledet fra bryst, colorectal og prostatakreft. I tillegg kreftceller med spredt mesenchymale kjennetegn viser høyere formidling kapasitet enn celletyper med epithelial utseende. Videre etablerer RNA interferens den metastase-suppressor rolle for E-cadherin i denne modellen. Denne automatiserte kvantitative hele dyret bio-imaging analysen kan tjene som en første-linje
in vivo
screening skritt i anti-kreft narkotika target oppdagelse rørledning
Citation. Ghotra VPS, S He, de Bont H, van der Ent W, Spaink HP, van de Water B, et al. (2012) Automated Whole Animal Bio-Imaging analyse for humane kreftspredning. PLoS ONE 7 (2): e31281. doi: 10,1371 /journal.pone.0031281
Redaktør: Laurent Renia Direktoratet for vitenskap, teknologi og forskning – Singapore immunologi Network, Singapore
mottatt: 02.08.2011; Godkjent: 04.01.2012; Publisert: 8. februar 2012 |
Copyright: © 2012 Ghotra et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av den nederlandske Cancer Society (UL-2010-4670) og EU FP7 ZF Cancer prosjekt (HELSE-F2-2008-201439). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Tradisjonelle anti-kreft narkotika-skjermer er utført ved hjelp av cellelinjer dyrket i 2D kultur eller ved hjelp av
in vitro
proteinbindingsanalyser. Progresjon av kreft, derimot, er en kompleks prosess av dynamiske interaksjoner mellom kreftceller og den organisme som omfatter genetiske endringer som fører til deregulert overlevelse og proliferasjon, angiogenese, invasjon og metastase [1]. Ideelt sett er gener som spiller en rolle i denne prosessen identifisert av
in vivo
ablasjon eller stanse. Selv om genetiske musemodeller for kreft og humane tumorcelle xenotransplantasjon modeller hos gnagere forbli vesentlig, slike systemer er kostbare, langsom, og mindre mottagelig for high-throughput-analyser for kreft legemiddel mål oppdagelse. Det er et klart behov for å utvikle raske, semi-automatisert
in vivo
systemer for medium til high-throughput screening applikasjoner i preklinisk mål oppdagelse og lead compound identifikasjon.
I denne forbindelse, sebrafisk ( ZF) tilbyr en rekke unike fordeler for å undersøke mekanismer som driver kreftdannelse og progresjon. ZF er virveldyr som kan heves i stort antall i en kostnadseffektiv måte. En nesten fullstendig genomsekvens avdekker at de fleste kreftgener og tumorsuppressorgener er høyt konservert mellom ZF og mennesker (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/guide/zebrafish) og ZF skjema spontane svulster med lignende histopatologiske og genuttrykk profiler som humane tumorer [2] – [4]. Viktigere er mulig xenotransplantasjon med humane kreftceller [5], [6]. ZF embryoer som brukes til dette formålet mangler et adaptivt immunforsvar, noe som øker suksessen til xenotransplantasjon mens de gir en mikromiljøet hvor humane tumorceller spre seg, vandrer, form tumormasser, og stimulere angiogenese [5] -. [8]
ZF embryoer er særlig anvendbare for halv high-throughput mikroskopisk analyse plattformer som de er gjennomskinnelige, og kan opprettholdes i 96-brønners plater. Den optiske åpenhet av ZF tilbyr spennende forskningsmuligheter som tillater visualisering av metastatisk prosess med høy oppløsning [8], [9]. Nyere funn tyder på at et bredt spekter av farmasøytisk aktive forbindelser illegale fysiologiske responser i ZF embryoer og hemme sykdomsutvikling i likhet med effekter i pattedyrsystemer [10] – [12]. Disse resultatene understreker den potensielle for en ZF embryo xenotransplantasjon modell som skal benyttes i den anti-kreft legemiddel funnet prosessen. Men på denne tiden, bruker ZF til skjermen for kreft relevant narkotika – og genet målene er begrenset av mangel på omfattende automatiserte bioassay. Her søkte vi automatisert bildebehandling og bildeanalyse prosedyrer til en ZF xenotransplantasjon modell for å utvikle den første semi-automatisert hel-organisme kvantitativ bio-imaging analyse for å analysere kreftspredning i et virveldyr.
Resultater
Vi utviklet en ikke-invasiv, kvantitativ hele dyr Bioimaging metode for formidling av xenotransplanted humane kreftceller i ZF embryoer i 96-brønners format. Alle trinnene er kort skissert i figur 1.
(A) plommesekken implantasjon av CM-Dil merket tumorceller i Tg (Fli: EGFP) ZF embryoer 2 dager etter befruktning. (B) Formaldehyd løst 6 dpi embryoer kledd i 96-brønners plater. (C) Automatisert image oppkjøpet hjelp CLSM plattform utstyrt med bevegelig scenen fanger flere Z stabler per embryo bruker 488 og 561 nm laser linjer. (D og E) Automatisert etablering av utvidet dybde sammensatte bilder. (F) flere utvidede dybdebilder som viser embryoer som ligger i ulike sideorienteringer. (G) Automatisert uniform reorientering av bilder. (H) Scatter tomten representerer svulst foci byrde i flere embryoer som tilhører en eksperimentell tilstand.
Automatisert image fange og pre-prosessering
CMDiI-merkede tumorceller ble injisert i plommen sac av to dager gamle fli-EGFP embryoer [13] og faste 6 dager etter implantasjon (ppt) (figur 1A). Faste embryoene ble kledd i 96 vel glassbunnplater for automatisert imaging (mindre enn 5 minutter per plate) (Figur 1b). Epi-fluorescens mikros ikke klarte å oppdage formidlet tumorceller på grunn av overdreven bakgrunn fra primærtumormassen. Derfor, ved bruk av en konfokal laser-scanning mikroskop (CLSM) kombinert med en automatisert trinn; multiple z stabler pr embryo ble tatt for hver brønn på en fullstendig automatisert fremgangsmåte (figur 1C, 1D og video S1). Confocal bilder ble automatisk konvertert til utvidet dybde sammensatte bilder (figur 1E) som ble omorganisert til en jevn orientering (Figur 1F og G) for å tillate automatisert kvantitativ bildeanalyse (figur 1 H).
Automatisert multiparametric analyse av kreft celle spredning
Etter å ha etablert forhold for automatisert bildebehandling og bilde pre-prosessering av tumorcelle implantert ZF embryoer; vi senere utviklet en algoritme for automatisk analyse av tumor foci byrde i det post-behandlet ZF bilder. For dette ble Bilde-Pro basert programvare utviklet, som utføres i hovedsak tre hovedfunksjoner (se materialer og metoder seksjon for detaljert informasjon om makro s).
1)
reorientering av bildene (figur 2): alle embryoer ble automatisk reorientert til en horisontal orientering, med hodet mot høyre og plommesekken mot bunnen.
2)
Bestemmelse av injeksjons stilling av merkede tumorceller (figur 3A-C): injeksjonsposisjon ble beregnet fra bilder basert på den segmenterte GFP kanalen (og bekreftet ved visuell inspeksjon ved hjelp av den røde kanal).
3)
Påvisning av tumor foci (Figur 3D og E). Den røde kanalen ble segmentert ved hjelp av en intensitet terskel og minimums- og maksimums området filtre
(A) Utvidet dybde bilde av seks dpi ZF embryo. (B) Grey verdi bilde fra kombinasjon av grønne og røde kanaler. (C) Uklart grått bilde etter påføring stengetid filter for å optimalisere bestemmelse av omriss. (D) Embryo segmentert etter påføring intensitet terskel og område filter. Arrowhead indikerer en rød objekt utenfor omrisset som er unntatt fra segmentering. (E) Cropped bilde med bare valgte objektet. (F) Embryo rotert ved x ° for horisontal reorientering. (G og H) Bestemmelse av x-posisjonsverdi av massesenteret (
cm
) og sentrum av sentroide (
cc
). (I) Horisontal flip av bildet bare hvis
cm
er på venstre side av
cc
, noe som resulterer i bilder med hodet av embryoet alltid til høyre side. (J) Bilde etter påføring av lukket filter til det kombinerte grønne og røde kanalen for å få omrisset av embryoet. Point liggende på 75% avstand fra ytterste venstre av embryoet omrisset beregnes. Y-aksen er tegnet på denne X-stillingen fra øvre til nedre omriss. Øvre rektangel 1 er trukket. (K) Nedre rektangel 2 er trukket. (L) Vertikal flip av bildet bare hvis rød intensitet i rektangel 1 er høyere enn i rektangel 2. (M) Skjematisk fremstilling av beregninger for trinn E-I. Samlet innebærer denne prosedyren i bilder der hodet er på høyre og plommesekken er på bunnen av bildet. Scale bar = 200 mikrometer i E og I.
(A) Utvidet dybde bilde av seks dpi fast embryo etter omstillingen. (B) Embryo disposisjonen fra segmentert GFP kanalen og Y-aksen krysser X-aksen på 75% fra ytterste venstre. (C) Beregnet injeksjonspunkt ved 75% avstand fra den ytterste venstre og 75% fra toppen Y-posisjonen. (D) Segmentert røde kanalen viser tumor foci byrde i embryoet. (E) Identifiserte kreft foci. (F) flere parametere av tumorbyrden foci beregnet pr embryo. Hvert tall i bildet svarer til en tumor fokus. (G) Tumor foci formidling i en enkelt embryo representert som spredningsdiagram (koordinerer 0,0 representerer beregnet på injeksjonsstedet). (H) Kombinert spredningsdiagram som viser tumor foci formidling fra 39 injiserte embryoer. (I) Kvantifisering av akkumulert distanse (CD). Hver fylt firkant representerer kumulativ avstand fra injeksjonspunktet av alle identifiserte svulst foci i en enkelt embryo. Mean kumulativ avstand (MCD) i de 39 injiserte embryoene i dette eksperimentet er 15 024 mikrometer. Scale bar = 200 mikrometer i A.
Data ble eksportert til Excel og flere numeriske parametre ble beregnet til å beskrive tumorcelle byrden per embryo. Disse inkluderte totalt antall svulst brennpunkter, gjennomsnittlig avstand på svulst foci fra injeksjonsstedet, og akkumulert distanse fra injeksjonsstedet (figur 3F). Som bare den kumulative avstand parameter kombinert antall spres celler med deres avstand fra injeksjonsstedet, vi tenkte at denne parameteren beste reflektert svulsten formidling kapasitet (figur S1). Resultatene ble representert som grafer som viser posisjonene av tumor foci i forhold til injeksjonspunktet (ved koordinatene x, y = 0,0) for hvert embryo (figur 3G) eller alle embryoer fra en enkelt eksperimentell tilstand (figur 3 H). Fra disse data ble samlet distanse av alle oppdaget svulst foci beregnet per embryo (CD) og deretter gjennomsnitt for alle injisert embryo i en eksperimentgruppe som et endelig kvantifisering av tumorcellespredning (gjennomsnittlig kumulativ avstand (MCD) (figur 3I og S1) .
Vi utførte eksperimenter for å bestemme den tidligste tidspunkt som tillot robust diskriminering mellom dårlig aggressive og svært aggressive cellelinjer Bruke LNCaP og PC3 som sådan et eksempel for prostatakreft [14] -. [19] observerte vi ingen forskjellen ved to ppt; MCD av PC3 kunne skilles fra MCD av LNCaP ved 4 ppt, og ved 6 dpi MCD var markert høyere i PC3 sammenlignet med LnCap med sterk betydning (figur 4) Derfor, 6 ppt ble valgt for analyse i det hele tatt. ytterligere eksperimenter.
(A og B) LNCaP (A) eller PC3 celler (B) ble implantert og embryoer ble fastsatt til 2, 4 eller 6 dpi for imaging (immunfluorescens bilder og automatisert bildeanalyse (spredningsplott )). nederste raden bilder (skala bar = 50 mikrometer) viser zoom-in på området markert med stiplet linje i øverste raden av bilder (skala bar = 100 nm). (C) CD ved 2, 4 og 6 dpi for LnCap (grå) og PC3-injiserte embryoer (svarte) beregnet fra scatterplots i A og B, respektivt. Statistisk testing for forskjellen mellom LNCaP og PC3 på ulike dpi indikeres. * P 0,05, *** p. 0,001
For å karakterisere tumor foci identifisert ved denne metoden, vi beregnet gjennomsnittlig diameter på segmenterte røde objekter i halen regionen PC3 implantert embryoer. Den gjennomsnittlige midlere diameter var ~15 pm med noen større gjenstander opp til ~45 mikrometer, men ingen objekter med gjennomsnittlig diameter 8 mikrometer blir valgt for analysen, som passer med identifisering av individuelle tumorceller eller små klynger (figur 5A). Vi videre analysert identifisert svulst foci med høyoppløselig bildediagnostikk, 3D rekonstruksjon, og overflategjengivelse (Figur 5B og Video S2). Dette bekreftet og utvidet det funn at enkelttumorceller eller små klaser ble identifisert ved automatisert bildeanalyse og viste tumorceller som samvirker med verten vaskulaturen (figur 5B). For å utelukke gjenstander på grunn av CMDiI merking, injisert vi mCherry merket PC3 celler. Helt enig med egenskapene til røde objekter identifisert etter injeksjon av CMDiI-merket PC3, ble enkelte PC3-mCherry celler observert i nært samarbeid med verts blodkar (figur 5C og Video S3). Til slutt, eksperimenter med unimplanted embryoer (Figur 6A) og sammenligning av CM-Dil-merket PC3 celler injisert i standard fli-EGFP eller Casper fli-EGFP embryoer mangler alle pigmenter (Figur 6B og C), utelukkes noen falske positiver på grunn autofluorescence pigment celler.
(A) Kvantifisering av den midlere diameter av makro-identifiserte tumorcelle foci fra halen region av PC3-injiserte embryoer. Data oppnådd fra 5 embryoer. (B) Høyoppløselig avbildning av CM-Dil-merket PC3 tumorcelle foci. (B1) Makro-identifiserte PC3 tumorcelle foci. (B2) Zoom-in på området som er angitt i
B
1 viser tumorceller i forbindelse med verts blodkar. (B3 og B4) Tredimensjonal rekonstruksjon og overflate gjengivelse av området i innsats av B2; pilspisser peke på tumorcelle delvis inne distal langsgående anastomotic fartøy (Video S2 og S3). (C) Høyoppløselig avbildning av PC3-mCherry tumorcelle foci. C1-4, som B1-4 for PC3-mCherry. Scale bar er 100 mikrometer i B1 og C1; 50 mikrometer i B2 og C2; 15 mikrometer i B3 og C3; 10 mikrometer i innfellinger i B3 og C3; 5 mikrometer i B4 og C4.
(A-C) I hvert tilfelle øverst til venstre bildet viser grønt signal (Fli-EGFP) og høyre bilde viser rødt signal for tumorceller. Bottom bildene viser zoomer av eske området i venstre bilde gi grønt (til venstre) og rødt signal (midten) og overført lys (høyre). Scale bar er 100 mikrometer i bilder som viser hele embryo og 50 mikrometer i bilder som er zoomet. (A) Ikke-implantert fli-EGFP embryo avbildes 8 dager etter befruktning. Antall ikke-implantert embryoer og antall kreftceller (feilaktig) oppdaget av automatisert bildebehandling og bildeanalyse metode er angitt til høyre. (B) Fli-EGFP embryo implantert med CM-Dil-merket PC3 avbildes på 6 dpi. (C) Fli-EGFP Casper embryo implantert med CM-Dil-merket PC3 avbildes på 6 dpi.
Til sammen eliminerer denne metoden behovet for visuell scoring og muliggjør automatisert generering og arkivering av bilder og numeriske data som beskriver spredning av tumorceller i et virveldyr organisme. Videre, for tumorceller identifisert av denne automatiserte bio-imaging analysen, tumor-vert interaksjoner kan videre studert i detalj av høy oppløsning mikros
Analyse validering. Sammenheng med atferd i musemodeller og epitel versus spredt fenotype
for å demonstrere anvendelsen av våre automatiserte plattform for å skille mellom dårlig aggressive og svært aggressive kreftceller, tre forskjellige paneler av cellelinjer ble analysert:
1)
for prostatakreft, PC3 (sterkt metastatisk i musemodeller, prostata kreft /beinmetastaser, androgen uavhengig, spredt vekst i 2D kultur, mesenchymale markører) og LNCaP (veldig dårlig metastatisk i musemodeller, prostata carcinom /lymfeknute, uttrykk for prostata differensiering markører, epiteliale øyene i 2D kultur; epiteliale markører) ble analysert [14] – [19].
2)
For brystkreft, BT474 (metastatisk i musemodeller, bryst invasive ductal carcinoma /kanalsystem; ER + /PR + /p53mutated; høy Her2 uttrykk; «svakt luminal epitel som» fenotype i kultur, redusert uttrykk av epitel markører) og MCF7 (meget svak metastatiske potensiale i fravær av ectopically uttrykt onkogener, bryst adenocarcinoma /pleural effusjon, ER + /PR + /p53 normal, lav Her2; epiteliale øyer i 2D kultur; epitele markører) ble analysert for [20] – [23 ].
3)
For tykktarmskreft, SW620 (kolorektal adenokarsinom Dukes «type C /lymfeknutemetastase, spredt vekst i 2D kultur, mesenchymale markører) og HT29 (kolorektal adenokarsinom /tykktarm, epiteliale øyene i 2D kultur, epiteliale markører ) ble analysert [24]. Påfallende, for hver krefttype testet, spredning i denne ZF xenograft analysen signifikant korrelert med metastatisk kapasitet rapportert i musemodeller og /eller karakteristikker som er kjent for å være assosiert med kreft progresjon inkludert differensieringsmarkører eller epitelial versus spredt fenotype (fig 7A og B; fig S2 ). Disse data validere denne kortsiktige automatisert bio-imaging metode og vise at det representerer et kraftig verktøy for å forutsi aggressivitet av kreftceller i mer komplekse, langsiktige
in vivo
systemer.
( A) Spredeplottingen representasjon av svulst celle spredning for indikert prostata (
øvre
grafer), bryst (
midten
), og kolorektal kreft cellelinjer (
lavere
grafer). Antall injiserte embryoer fra 2 biologiske replikater indikeres. (B) MCD bestemt ut fra data som er representert i A. Data er presentert som gjennomsnitt ± S.E.M. * P 0,05, *** p 0,001. (C) 6 dpi embryo injisert med PC3 viser tumor foci byrde bestemmes fra segmentert røde kanalen (
venstre
), og representert som spredningsdiagram (
midt
). (D) Automatisert bestemmelse av regionen for utelukkelse av svulst foci rundt implantasjonsstedet og i området intestinal utvikling (
venstre
), og resterende tumor foci representert som spredningsdiagram (
midt
). (E) MCD før (
Svart
) og etter utelukkelse (
hvite striper
) til angitt prostata (
venstre
), bryst (
midten
), og tykktarmskreft linjer (
høyre graf
). Brett forskjellen mellom dårlig og svært aggressive cellelinjer indikeres. Data er presentert som gjennomsnitt ± S.E.M. * P 0,05, *** p 0,001. (F) MCD etter utelukkelse for PC3 og MCF7- i flere uavhengige eksperimenter viser reproduserbarhet. Data er presentert som gjennomsnitt ± standardavvik
Omfattende ZF cellulær bevegelse foregår i regionen plommesekken, hvor tarm utvikling skjer innenfor tidsrammen av vår analyse [25]. Vi ønsket å utelukke mulig påvirkning av passive migrering av implanterte tumorceller på grunn av denne utviklingsprosess nær den primære implantasjon området. Av denne grunn, ekspanderte vi makro med et ekstra trinn hvor alle tumor foci innenfor et kvadrat som omfatter denne regionen ble ekskludert fra analysen på en objektiv automatisert måte (figur 7C og D). Selv om dette kan føre til undervurdering av den kumulative avstand parameter, fant vi ut at dette unntaket steget ytterligere utvidet vinduet mellom de ikke-aggressive versus svært aggressive celletyper (Figur 7E). Videre analyse av flere uavhengige eksperimenter med PC3, BT474, og MCF7-, viste at denne metoden er svært reproduserbare (figur 7F).
Vi har utvidet analysen til en bredere panel av humane kreftcellelinjer fra ulike opprinnelse inkludert prostata, bryst, lunge, kolorektal, hud og bindevev. Interessant, når disse linjer ble gruppert etter deres morfologi i 2D kultur og uttrykk av epitel eller mesenchymale markører, var det en klar sammenheng med høy spredning med en spredt fenotype (ett unntak var HT1299, som ikke spre effektivt); alle cellelinjer voksende som epitel øyene hadde svært lav spredning kapasitet (figur 8A, Tabell S1). Vi funksjonelt testet i rollen som en typisk markør av epiteliale fenotype, celle-celle-adhesjon reseptor E-cadherin. For dette brukte vi 4T1 muse brystkreft celler som besitter en intermediær fenotype, som vokser som klynger av løst tilknyttede celler i 2D og uttrykker E-cadherin samt noen mesenchymale markører som vimentin (figur 8B). E-cadherin ble stille noe som resulterer i en fullstendig spredt fenotype i 2D (figur 8B og C), og disse celler ble injisert i ZF for å bestemme spredning kapasitet. Faktisk, shRNA målretting E-cadherin, men ikke kontroll shRNA sterkt økt spredning av 4T1-celler, og den automatiserte bio-avbildningsmetode tillot signifikant separasjon mellom 4T1shCdh1 på den ene side og 4T1Wt og 4T1shCtr på den andre (figur 8D-F).
(A) MCD i et panel av humane kreftcellelinjer fra forskjellige steder. Antall injiserte embryoer er indikert.
Hvite linjer
indikerer cellelinjer som viser en spredt fenotype i 2D cellekultur.
Svarte striper
indikerer cellelinjer voksende som epiteliale øyene i 2D kultur.
Grey barer
indikerer cellelinjer med middels /blandet epitel /mesenchymale egenskaper. (B) 4T1 brystkreftceller vokser som øyene løst festet spindel-formet celler (
venstre
) og helt spredt vekst av 4T1 celler etter E-cadherin lyddemping (
midt
). (C) E-cadherin overflateekspresjon ved FACS. (D) Spredeplottingen representasjon av indikert 4T1 varianter. Antall injiserte embryoer fra 2 uavhengige eksperimenter er vist. (E) Representative bilder av embryoer injisert med angitt 4T1 varianter. (F) MCD bestemt ut fra data som er representert i D. Data er gitt i forhold til villtype-4T1 som gjennomsnitt ± S.E.M. ** P 0,01. Scale bar er 200 mikrometer i E.
Helt, en kortsiktig medium throughput helautomatisk hel-organisme bio-imaging modellen er utviklet som skiller med gode reproduserbarhet kreftcelletyper som vokser som øyer eller ha epiteliale markører eller har vist seg å være dårlig aggressive i musemodeller fra cellelinjer som er spredt eller har flere mesenchymale karakteristikk, eller er kjent for å metastasere i mus. Den er kompatibel med RNAi for identifisering av regulatorer av kreft celle spredning og tillater bytte fra lav oppløsning rask bildebehandling til høy oppløsning detaljert analyse for å studere effekter på tumorcelle egenskaper eller svulst celle-vert interaksjoner.
Diskusjoner
Her har vi utviklet en kortsiktig
in vivo
ZF xenograft analysen som er kompatibel med automatisert bildebehandling i 96 brønners plater og koblet til helautomatisk analyse av tumorcelle formidling. Denne analysen viser den første automatiske hele organismen Bioimaging assay i et virveldyr som gir mulighet for å studere aspekter av kreft progresjon. Våre funn viser at denne analysen tett reflekterer resultatene oppnådd i dyrere og mye lavere throughput analyser slike som gnager xenografter
ZF xenograft modell har tidligere blitt brukt til kreft migrasjonsstudier [5] -. [9]. Det er begrensninger i denne modellen, herunder potensielle forskjeller i vertsmikromiljøet og behovet for å arbeide ved temperaturer som er kompatible med overlevelse og migrasjon av pattedyrceller, mens på samme tid å være gunstig for normal ZF fysiologi. Likevel har vi modifisert forsøksbetingelser slik at opptreden av et stort panel av humane kreftcellelinjer fra forskjellige opprinnelser ligner kjente oppførsel i gnagermodeller. Videre vårt arbeid gir denne modellen med automatisering i bildebehandling og bildeanalyse, samt med den statistiske strømmen som er nødvendig for bruk i screening prosedyrer.
Vi tilbyr proof-of-prinsippet for en slik anvendelse ved å teste en kjent regulator av kreft celle migrasjon. Ved hjelp av et panel av cellelinjer vi vise at dette bildebehandling plattformen kan diskriminere mellom celletyper med flere epiteliale egenskaper eller vokser i øyene versus de med mer mesenchymale egenskaper eller vise en spredt fenotype). Vi deretter kombinere analysen med RNAi å slå av celle-celle adhesjon molekyl, E-cadherin. Vi raskt skaffe data fra ~90 dyr pr eksperimentell gruppe på to biologiske replikater støtte hemmende rolle av E-cadherin i cancer utbredelse.
Tatt sammen, kan denne forholdsvis raske gjennomstrømning mediet assay brukes som en første
in vivo
analyse plattformen i målet oppdagelsen rørledningen. Det gir automatisering og statistisk styrke til å identifisere disse treffene fra storskala in vitro RNAi screening innsats som garanterer mer tid- og kostnadskrevende studier i musemodeller. Fremtidige retninger vil omfatte inkorporering av tilsvarende automatisk analyse av induksjon av tumor angiogenese og tumor celledeling å fange flere aspekter av kreft progresjon innenfor denne bio-imaging analysen.
Materialer og metoder
Cellelinjer og ZF håndtering
Alle menneskelige kreftcellelinjer ble innhentet fra ATCC og dyrket i henhold til gitt protokollen. ZF og embryoer ble reist, iscenesatt og vedlikeholdes i henhold til standard prosedyrer i samsvar med de lokale dyrevern forskrifter. Den transgene ZF linjen Tg (fli1: EGFP) uttrykker EGFP i endotelceller i villtype eller «Casper» bakgrunn, ble opprettholdt i henhold til standard protokoller (https://ZFIN.org). PC3-mCherry celler ble generert ved hjelp av en pCMV-mCherry-bc-puro-Kl201 lentiviral vektor (gitt av Dr. R.C. Hoeben, Leiden University Medical Center, Leiden NL). 4T1-shCdh1 og 4T1-shCtr celler ble generert ved lentiviral transduksjon hjelp TRC shRNA konstruerer (Sigma)
Implantasjon prosedyre
Pattedyrceller ble merket med lipofilt fluorescerende celle tracker (CM-Dil;. Eksitasjon maksimalt 553 nm, lot nr C7000;. Invitrogen) i henhold til produsentens instruksjoner. Det merkede cellesuspensjonen ble anbragt i borsilikatglass kapillær nåler (1 mm ytre diameter x 0,78 mm indre diameter .; Harvard Apparatus) og intrayolk injeksjoner ble utført ved anvendelse av en pneumatisk pumpe Pico og en manipulator (WPI). Dechorionated 2 dager etter befruktning ZF embryoer ble bedøvet med 0,003% Tricaine (Sigma) og plassert på en 10 cm petriskål belagt med 1% agarose. Ved å kontrollere injeksjonstrykk og varighet antall injiserte celler ble satt til ca. 100 pr embryo som bestemt ved standard celletelling av sprøytedråpene. Injiserte embryoene ble opprettholdt i egg vann ved 34 ° C og fast 6 dpi med 4% paraformaldehyde.
Automatisert mikroskopi og høyoppløselig bilde
Faste embryoene ble manuelt kledd i 96 vel glassbunnplater (materiale no.655892; Greiner) med hver brønn inneholdende et enkelt embryo. Dette ble enkelt gjort i mindre enn 5 min per plate. Bilde Kjøpet ble utført ved hjelp av et Nikon Eclipse Ti CLSM, som integrerer avanserte optikk, fluorescens deteksjon og skanning maskinvare i en enkelt plattform styrt av EZ C1 programvare. 488 og 561 nm laser lys ble brukt til å opphisse Tg (fli1: EGFP) embryoer og DiI- positive tumorceller. Serie sagittal (laterale) deler ble tatt seks dpi i en automatisert måte (14 × 30 mm) ved hjelp av en Plan Apo 4X Nikon tørr objektiv med 0,2 NA og 20 WD. For tredimensjonale bilder 0,5 mikrometer trinn Z stabler (1024 × 1024 fokale fly, 50-74 mikrometer i dybden) ble kjøpt opp av hjelp 40 × Nikon tørr plan fluor objektiv med 0,75 NA og 0,66 WD.
Bildeanalyse programvare
automatisert image pre-prosessering, automatisert analyse og 3D rekonstruksjon og overflategjengivelse ble utført av image-Pro Plus-basert programvare fra Media Cybernetics.
Utvidet dybdeskarphet
programvaren brukt Z-stack fargebilder fra konfokal mikroskop. De oppnådde grå bilder var pseudo farget med grønt for GFP og rødt for CM-Dil merket tumorceller. En makro ble bygget som bruker begge kanalene for batch prosessering av alle bildene i en mappe. Først fra Z-stack et enkelt, in-focus, sammensatte bildet ble tatt. Piksler i Z-stack ble analysert. For hver posisjon ble pixel fra flyet med den største variansen eller lokal kontrast valgt. Denne piksel ble deretter brukt til det endelige sammensatte bildet.
Automatisert orientering av embryoene (figur 2)
For bildeanalyse bør alle embryoer ha samme retning. For dette ble en makro utviklet der bildene ble endret slik at alle fostre ble horisontalt orientert, med hodet mot høyre og plommesekken mot bunnen av bildet
Automatisert vannrett justering. Fargen bildet ble omdannet til en grå verdi bildet for å gi en kombinasjon av GFP og røde kanaler. Embryoet ble deretter segmentert bruker gjennomsnittlig intensitet histogram beløp, minimum og maksimum område filter. Deretter ble en retning verdi av den segmenterte objektet bestemmes, som ble brukt for å gi embryoet en horisontal stilling
Automatisert horisontal orientering.: X-posisjonen verdien av massesenteret ble bestemt fra den grå kombin GFP og røde kanaler. Hvis denne verdi ble plassert til venstre fra midten av geometriske tyngdepunkt, ble bildet vendes horisontalt. I alle tilfeller, ga bilder hvor hodet av embryo ble orientert mot høyre
Automatisert vertikal orientering. Fra de ytre horisontale stilling, et punkt som ligger på X-aksen ved 75% avstand fra helt til venstre på embryoet omrisset ble bestemt. På denne X-posisjon Y-aksen ble trukket fra topp til bunn skisserer. Et rektangel ble trukket fra -20 til 20 piksler horisontalt fra den beregnede 75% poeng og vertikalt 80 piksler over midten av den øvre Y-aksen. En firkant ble trukket med identiske horisontale parametere og vertikalt 80 piksler under midten av den nedre Y-akse. Den gjennomsnittlige fluorescens intensitet i den røde kanalen ble bestemt for begge rektangler. Hvis intensitet var høyere i den øvre rektangelet i forhold til den nedre rektangel, ble bildet snudd vertikalt. Samme prosedyre kan utføres ved hjelp av GFP kanalen i hvilket tilfelle bildene ble snudd om intensiteten var høyere i bunnen rektangelet. Visuell inspeksjon viste at denne fremgangsmåten, i alle tilfeller resultert i bilder hvor plommesekken ble orientert mot bunnen av bildet.
Automatisert beregning av injeksjons posisjonen for Cy3 merkede celler
First lengst til venstre og lengst til høyre X posisjoner embryoet omrisset ble bestemt. Fra disse stillingene X, er et punkt som ligger ved 75% fra den ytterste venstre bestemt. Deretter, fra denne X posisjonen de øverste og nederste Y-posisjonene ble bestemt. Deretter fra disse Y-posisjonene et punkt som ligger på 75% fra den øverste Y posisjon ble bestemt, som ble utpekt som vilkårlig injeksjonspunktet.
