Abstract
Økende bevis tyder på at kromosomale regioner som inneholder microRNAs er funksjonelt viktig i kreft. Her viser vi at genomisk loci koding MIR-204 er ofte borte i flere krefttyper, inkludert eggstokkreft, pediatriske nyresvulster og brystkreft. MiR-204 viser drastisk redusert uttrykk i flere kreftformer, og fungerer som en potent tumor suppressor, hemme tumormetastaser in vivo når systemisk levert. Vi viste at MIR-204 utøver sin funksjon ved å målrette gener involvert i tumordannelse inkludert
hjerne nevrotrop faktor product: (
BDNF
), et neurotrofin familiemedlem som er kjent for å fremme tumor angiogenese og invasivitet . Analyse av primærsvulster viser at økt uttrykk av BDNF eller dens reseptor tropomyosin relaterte kinase B (TrkB) parallelt en markant redusert uttrykk av MIR-204. Våre resultater viser at tapet av MIR-204 gir BDNF overekspresjon og påfølgende aktivering av den lille GTPase Rac1 og aktin omorganisering gjennom AKT /mTOR signalveien som fører til kreft celle migrasjon og invasjon. Disse resultatene tyder på at microdeletion av genomisk loci inneholder MIR-204 er direkte knyttet til deregulering av nøkkel onkogene trasé som gir avgjørende stimulans for tumorvekst og metastasering. Våre funn gir en sterk begrunnelse for å manipulere MIR-204 nivåer terapeutisk å undertrykke metastase
Citation. Imam JS, Plyler JR, Bansal H, Prajapati S, Bansal S, Rebeles J et al. (2012) Genomisk Tap av tumor suppressor miRNA-204 Fremmer Cancer Cell migrasjon og invasjon av Aktivering AKT /mTOR /Rac1 Signalering og Actin Omorganisering. PLoS ONE 7 (12): e52397. doi: 10,1371 /journal.pone.0052397
Redaktør: Giuseppe Viglietto, Universitetet Magna Graecia, Italia
mottatt: 8. juni 2012; Godkjent: 14 november 2012; Publisert: 21.12.2012
Copyright: © 2012 Imam et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Arbeidet ble støttet av William og Ella Medical Research Foundation grant (mKR), GCCRI starte opp fond (mKR), CPRIT fellesskap (BZ), National Institutes of Health (NIH) T32 trening stipend (YFC), og NIH /National Cancer Institute kreft senter stipend (P30 CA054174-17). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Identifikasjon av kromosomale regioner husing onkogener og tumor suppressor er avgjørende for forståelsen av svulsten patogenesen og bedre behandlingsresultater [1]. Selv om flere kreftrelaterte gener har blitt identifisert i regioner med kromosomavvik [2], flere regioner med tilfeldige eller tilbakevendende kromosomavvik husing faktorer viktige i kreft vekst og progresjon gjenstår å bli identifisert. Nyere studier tyder på at microRNAs (mirnas) er en slik gruppe av faktorer [3]. Mirnas er små, endogene, ikke-kodende RNA som regulerer post-transcriptional genuttrykk ved å binde seg til tre-utranslaterte regioner (UTR) av målet mRNA. Mirnas er kjent for å spille viktige funksjoner i flere biologiske prosesser, inkludert utvikling og differensiering [4], og deregulert ekspresjon av mirnas har vært implisert i en rekke humane sykdommer, inkludert kreft [5]. Økende bevis tyder på at mirnas kan fungere som onkogener eller tumorsuppressorgener [6].
I denne studien har vi fokusert på kromosom loci inneholder MIR-204. MiR-204 er blitt rapportert å spille viktige roller i glatt muskelcelle forkalkning samt endoplasmatiske retikulum stressrespons i trabekelverket celler [7], [8]. I tillegg har de siste rapportene vist like viktige roller for MIR-204 i tumorigenesis, inkludert regulering av kreftutvikling i perifere nerve slire svulster, og migrasjon og invasjon av livmorkreft cellelinjer [9], [10]. Men svært lite er kjent om den mekanismen som MIR-204 regulerer onkogenese generelt, og tumorvekst og metastasering i bryst og eggstokkreft spesielt. Videre er nesten ingenting kjent om hvorvidt MIR-204 kan være målrettet terapeutisk og hvordan Mir-204 uttrykk er regulert i kreft. Våre resultater viser at kromosomale loci innehold MIR-204 blir ofte tapt, noe som resulterer i sin nedre ekspresjon i flere krefttyper. Vi viser at MIR-204 fungerer som en potent tumorvekst og metastase lyddemper. Viktigere, viser våre resultater at MIR-204 kan være målrettet terapeutisk som systemisk levering av MIR-204 hemmet brystkreft lungemetastaser uten å forårsake noen levertoksisitet. Vi fant at MIR-204 fungerer som en tumor suppressor ved å målrette den funksjon av gener assosiert med tumorigenesis, inkludert
hjerne nevrotrop faktor product: (
BDNF
). BDNF er en fysiologisk viktig nervevekstfaktor som spiller en avgjørende rolle i utviklingen av nervesystemet ved å binde og deretter aktivering av tyrosinkinase-reseptoren, tropomyosin relaterte kinase B (TrkB) [11], [12]. I tillegg er det BDNF /TrkB sti rapportert å ha en kritisk rolle i tumorgenese som det fremmer proliferasjon, differensiering, angiogenese og tumor invasivitet [13]. Overekspresjon av BDNF /TrkB har også vært implisert i dårlig prognose av flere faste tumorer inkludert neuroblastom, eggstokk, bryst, prostata og lunge-kreft [14], [15], [16]. Våre funn viser at tapet av MIR-204 gir BDNF /TrkB overekspresjon og samtidig aktivering av AKT /mTOR /Rac1 signalveien, som fører til aktin omorganisering i løpet av kreft celle migrasjon og invasjon. Disse resultatene understreker den funksjonelle betydningen av kromosomale regioner som inneholder spesifikke mirnas i tumorvekst og metastasering.
Resultater
Somatisk Tap av MIR-204 i Kreft
For å identifisere mirnas som er assosiert med avvikende kromosom regioner i humane kreftformer, brukte vi høy oppløsning tilpasset miRNA komparativ genomisk hybridisering (CGH) og high-density CGH offentlig tilgjengelige datasett for eggstokkreft, brystkreft og pediatriske nyresvulster. Denne analysen avdekket flere mirnas i de minimale kromosom sletting og forsterknings regioner av disse svulstene. For å begynne å forstå den funksjonelle betydningen av kromosom loci forbundet med mirnas i tumorigenesis, vi i første omgang fokusert på mirnas stiller genomisk tap (figur S1 A). Den 9q21.12 kromosomale regionen inneholder MIR-204 ble ofte tapt i 44,63% (158/354) av eggstokkreft, 28% (10/35) av brystkreft og 40% (15/38) av de pediatriske nyresvulster (figur 1A , 1B, og fig S1B), som er videre bekreftet ved kvantitativ genomisk real-time PCR-analyse (figur 1C og 1D). Videre reduksjon i nivåene av modne MIR-204 også sterkt korrelert med dets genomiske DNA-innhold i alle de tre tumortyper (figur 1E-1G).
A, med høy oppløsning miRNA-CGH på utvalgte pediatriske tumorer med nyre (venstre) eller uten (høyre) MIR-204 slettinger. Sletting av genomiske loci som inneholder miRNA er indikert med stiplede loddrette linjer. Røde og grønne prikker angir posisjon og verdien av hver sonde reflekterer kopi nummer endring, representert i tre eksemplarer på CGH array. Den grå trendlinjen representerer gjennomsnittsverdien av tre eksemplarer sonde for hver tumor. B, grafer hentet fra meta-analyse av høyoppløste CGH av eggstokkreft (
n
= 354; hentet fra TCGA) som representerer en undergruppe av svulster med eller uten sletting. Slettingen av genomiske loci innehold MIR-204 er angitt med prikkede loddrette linjer. C og D, allel PCR av MIR-204 genomisk locus i pediatriske nyresvulster (C) og eggstokkreft (D). Y-aksen viser logg
2 transform relative kvantifisering verdier. Stiplede linjene viser tap av kopien terskel. E-G, grafisk fremstilling av QRT-PCR-analyse som viser nivåer av MIR-204 i pediatriske nyresvulster (
n
= 38; E), i avansert stadium eggstokkreft (
n
= 11 F) og i bryst kreft (
n
= 10; G), sammenlignet med normal matchet kontrollgruppe nyre (
n
= 38), normal eggstokk vev (
n
= 5) og normal matchet brystvev (
n
= 10).
MiR-204 Fungerer som en potent tumorvekst og metastase lyddemper
drastisk redusert uttrykk av MIR-204 i flere kreft vev bedt oss om å ta rollen som MIR-204 i tumorigenesis. For å finne ut dette, må vi først vurdert effekten av MIR-204 på forankringsuavhengig vekst. Embryonal nyre HEK-293-celler (HEK-293-celler passert spissen 52 ganger er rapportert å være svært tumorgene [17]) å overuttrykke MIR-204 oppviste redusert kolonidannende evne, som ble reddet med overekspresjon av en inhibitor av MIR-204 ( Figur 2A). Lignende resultater ble også oppnådd med MIR-204 overekspresjon brystkreft MDA-MB-231 og eggstokk- kreft SKOV3-celler (data ikke vist). For å bekrefte MIR-204 potensial tumor suppressor-lignende aktivitet ytterligere, høy-passasje HEK-293-celler som stabilt overuttrykker enten MIR-204 eller en kodet sekvens ble injisert inn i nyrene kapsler med nakne mus og tumorvekst og metastase ble evaluert 24 dager etter injeksjonen . I skarp kontrast til å kontrollere svulster, ble MIR-204 overekspresjon svulster dramatisk redusert i størrelse (figur 2B). Deretter undersøkte vi om MIR-204 også hemmer tumorcelle invasjon. Histologisk analyse av xenograft tumor seksjoner indikert drastisk redusert eller ingen invasivitet av svulster i nyrevevet, som overuttrykt MIR-204 sammenlignet med kontrollgruppen (figur 2C). I samsvar med dette, MIR-204 overekspresjon drastisk redusert de trekkende og invasive egenskapene til brystkreft (MDA-MB-231) og eggstokkreft (SKOV3) celler (figur 2D og data ikke vist) in vitro.
En hemmer MIR-204 forankringsuavhengig vekst. Nutrient forbruk (til venstre) og graf (til høyre) viser antall kolonier dannet i myk agar brønner av HEK-293 celler stabilt overuttrykker enten rykke eller MIR-204, videre transfektert med MIR-204-hemmer. (*)
P
0,05; (**)
P
0,01. Resultatene er gjennomsnittet av tre uavhengige eksperimenter. B, MIR-204 overekspresjon hemmer tumorvekst. Fotografiet viser representative elementer av tumorvekst i
RAG2
– /-, γc
– /- SCID mus injisert (i nyren) med HEK-293 celler stabilt overekspresjon enten rykke kontroll eller MIR -204. Søylediagrammet viser at tumorvolumet for MIR-204 (
n
= 9) og krafse (
n
= 9) transfektanter. (*)
P
0,001. C, histologisk analyse av seksjoner fra tumorxenotransplantater overekspresjon enten rykke (kontroll) eller MIR-204. Bildene som vises i det høyre panelet representerer forstørret bilde av eske region angitt i venstre panel. Tumorinvasjon i kontroll transfektanter blir reflektert av invasjon av tumor inn i nyrevev. D, basalmembran matrix invasjon analysen av MDA-MB-231 celler transfektert med 75 nM egge sekvens (kontroll) eller Mir-204 etterligne (MIR-204) eller Mir-204 etterligne transfekterte celler ytterligere transfektert med MIR-204 inhibitor (speil 204 + hemmer). Bar Grafen viser gjennomsnittlig antall invaderte celler telles mikroskopisk i fem forskjellige felt per filter. (***)
P
. 0,001
Terapeutisk målretting av MIR-204
For å underbygge metastase supressoraktiviteten av MIR-204 vi spilte videre terapeutiske eksperimenter i brystkreft lungemetastase modell. Vi først etablert lungemetastaser ved haleveneinjeksjon av MDA-MB-231 brystcancerceller som uttrykker luciferase-GFP, og deretter injiseres MIR-204 eller MIR-204 mutert oligo (negativ kontroll) i halevenen til nakne mus hver 5 dager for 30 dager ved hjelp LANCErII, en lipid-basert in vivo levering kjøretøy. Interessant, systemisk levering av MIR-204 resulterte i betydelig reduksjon eller eliminering av lungemetastaser, mens MIR-204 mutert oligo injiserte mus hadde alvorlig lungemetastase, som målt over den 60-dagers periode (figur 3A-3D og fig S2). Viktigere, mus injisert med MIR-204 viste ingen åpenbare bivirkninger som avslørt av fravær av levertoksisitet eller endringer i kroppsvekt (figur 3E og data ikke vist). Disse resultatene indikerer at MIR-204 kan være en trygg og levedyktig terapeutisk diett for å behandle tumorvekst og metastasering.
En injeksjon av MIR-204 oligonukleotid i halevenen trykt lungemetastaser. Lev Bioluminescens bilder av mus injisert med MIR-204 (
n
= 6) eller MIR-204 mutant (kontroll neg;.
n
= 6) oligonukleotider som bruker Xenogen In vivo Imaging System ( IVIS) (Xenogen). Bilder ble tatt etter subkutan injeksjon av 150 mg /kg D-luciferin substrat i PBS til bedøvede mus. B, tumormetastase volum ble bestemt fra dag 10 til Dyrene ble avlivet på dag 60. Ved hjelp av analyse av avkastningen, tumor lysintensiteten ble beregnet i foton /s, som korresponderer med antall levende celler in vivo. C, representative lunge bilder som viser GFP
+ ve foci (rød sirkel) i neg. kontrollgrupper. D, representative lunge seksjoner som viser metastaser i neg. kontrollgrupper. E, ingen levertoksisitet i MIR-204 injisert mus. Deler av leveren fra MIR-204 injisert mus viser ingen tegn til levertoksisitet. Tilstedeværelsen av multifokale periportal lymfocytter er ikke uvanlig, og er et vanlig funn hos unge dyr.
MiR-204 Mål gener assosiert med tumorigenesis
For å forstå mekanismen som MIR-204 kan spille en rolle i tumordannelse, identifiserte vi gener som reguleres av MIR-204. Siden de fleste mirnas handle for å redusere målet mRNA nivåer [18], utførte vi genuttrykk analyser på celler som overuttrykker MIR-204 og bestemt de potensielle mål av MIR-204. Av genene endret i MIR-204 overekspresjon celler, downregulated gener er mest sannsynlig å være direkte målrettet av MIR-204. Interessant er flere av de downregulated genene er assosiert med kreft-relaterte prosesser og fysisk eller funksjonelt samvirke med hverandre, slik det er åpenbart av sti-baserte analyser (figur S3). Vi utførte detaljerte analyser på to slike gener:
BDNF Hotell og
ezrin Hotell som viste høyere nivåer av endring i vår microarray analyse og omtalt i alle spådd biologiske pathways med høyest funksjonelle berikelse betydning. BDNF med sin reseptor TrkB er kjent for å spille en kritisk rolle i tumor angiogenese og metastase; og ezrin, en cytoskeletal arrangøren protein, har vært implisert i tumorvekst metastasering av flere voksne og pediatriske tumorer inkludert osteosarkom, mammary og pankreatiske adenokarsinomer, eggstokk-karsinom, samt rhabdomyosarkom og pediatriske renale tumorer [19], [20], [21 ]. Videre flere mål prediksjon algoritmer, inkludert SvMicrO [22], Bayesiansk beslutnings fusion tilnærming [23], og miRmate [24] at vi nylig har generert samt TargetScan [25] og Pictar [26], også spådd
BDNF Hotell og
ezrin
å bli målrettet av MIR-204. Videre ble MIR-204 bindingsseter funnet å være evolusjonært bevart gjennom virveldyr, noe som tyder på at det å ha en viktig regulerende funksjon på tvers av en rekke arter. Viktigere, MIR-204 og
BDNF Twitter /
TrkB
samt
ezrin
uttrykk viste en sterk invers korrelasjon i flere svulster (figur 4A-4C og figur S4A-S4C) .
A-C, korrelerer økt BDNF uttrykk sterkt med lavere Mir-204 uttrykk i flere kreftformer. Grafisk fremstilling av QRT-PCR-analyse som viser omvendt korrelasjon mellom MIR-204 og
BDNF
pediatriske nyresvulster (
n
= 38; A), avansert stadium eggstokkreft (
n
= 11, B) og brystkreft (
n
= 10, C), sammenlignet med normal matchet kontrollgruppe nyre (
n
= 38), normal eggstokk vev (
n
= 5) og normal matchet brystvev (
n
= 10). D-H,
BDNF
er en bonafide mål av MIR-204. D, skjematisk av den antatte MIR-204 bindende sekvens i
BDNF
3 «UTR. E, HEK-293 celler ble ko-transfektert med Renilla luciferaseekspresjon konstruere PRL-TK og Firefly luciferase konstruksjoner som inneholder enten pMIR-
BDNF
3 «UTR i fravær og nærvær av Mir-204 etterligne eller pMIR-
BDNF
3 «UTR mutant. Ildflue luciferase-aktiviteten av hver prøve ble normalisert til Renilla luciferase-aktivitet. Gjennomsnitt ± SEM av tre uavhengige eksperimenter (utført i duplikat for hvert forsøk). (**)
P
0,01; (***)
P
0,001. F, QRT-PCR analyse av MIR-204 overekspresjon celler og celler transfektert med MIR-204-hemmere ved hjelp av
BDNF
-spesifikke primere. G, western blot analyse av HEK-293-celler transfektert med MIR-204 etterligne ved anvendelse av anti-BDNF antistoffer (1:1000). β-aktin ble benyttet som en kontroll lasting. Gel fotografier er representative for tre uavhengige eksperimenter. H, grafisk representasjon av band intensiteter kvantifisert ved hjelp av Total Labs TL100 1D gel analyse programvare (
n
= 3;-lineær). BDNF protein nivå for kontrollen ble satt til 100.
For å validere vår microarray og målrette prediksjonsresultater, vi først undersøkt om Mir-204 mål
BDNF Twitter /
ezrin
ved å binde til den anslåtte området i sin 3 «UTR (figur 4D og fig S4D). Faktisk luciferase aktiviteten til en pMIR-reporter konstruksjon inneholdende
BDNF
eller
ezrin
3 «UTR ble betydelig undertrykt, som ble ytterligere redusert i celler overekspresjon MIR-204 sammenlignet konstruere uten 3»-UTR (figur 4E og fig S4D). I motsetning til dette, mutasjon av frø sekvens i
BDNF
3 «UTR-inneholdende konstruere ikke bare gjenopprettes luciferaseaktivitet til nær den for villtype-konstruksjonen, men også gjengitt transkripter fra disse konstruksjonene ufølsom for MIR-204 overekspresjon ( Figur 4E), noe som bekrefter en spesifikk interaksjon mellom MIR-204 og den forutsagte bindingssete i 3»-UTR av disse genene. For ytterligere å underbygge disse resultatene, vi fast bestemt på nivåene av BDNF /ezrin i celler som overuttrykker MIR-204. MiR-204 overekspresjon resultert i betydelig reduksjon av BDNF /ezrin både RNA og proteinnivå (Figur 4F-4H og figur S4E og s4F). Deretter undersøkte vi hvorvidt BDNF og ezrin er funksjonelt viktige mål for Mir-204. For å møte det vi utførte redningsforsøk. Gjeninnføring av
BDNF
eller
ezrin
reddet MIR-204 induserte fenotyper inkludert forankringsuavhengig vekst, cellemigrasjon og invasjon (figur S5 og data ikke vist). Disse resultatene tyder på at Mir-204-mediert regulering av
BDNF Hotell og
ezrin
er en viktig begivenhet i kreftcellevekst, migrasjon og invasjon.
Tap av MIR-204 aktiverer AKT /mTOR alarm og Rac1 Trans i kreftceller
for å finne den mekanismen som MIR-204 kan fremvise sin tumorvekst og metastase supressoraktiviteten, undersøkte vi effekten av MIR-204 på AKT /mTOR signal som både BDNF og ezrin har vist seg å aktivere AKT-reaksjonsveien [27], og selektiv aktivering av AKT ved mTOR har vist seg å regulere kreftcellemigrering og invasjon [28]. Interessant, MIR-204 overekspresjon resulterte i redusert aktivitet av AKT og mTOR nedstrøms mål 4E-BP1 og S6 (figur 5A). 4E-BP1 er en oversettelse inhibitor som dissosierer fra eIF4E ved fosforylering å tillate protein oversettelse, og S6 er en ribosomalt protein som fosforylering forenkler montering av ribosomet og påfølgende oversettelse av mRNA. For å bekrefte våre in vitro funn, analyserte vi uttrykk for fosfor-AKT (Pakt) og fosfor-S6 (PS6) i svulsten xenograft overekspresjon MIR-204. Som vist i fig S6, ble nivåene av pakt og PS6 betydelig redusert, mens total AKT og total S6 nivåene forblir uforandret i tumorer som overuttrykker MIR-204 når sammenlignet med kontroll transfektant tumorer, slik det er åpenbart ved immunhistokjemisk analyse. For å underbygge denne oppfatningen at AKT /mTOR veien er faktisk en viktig målgruppe for MIR-204, vi co-transfektert MIR-204 med konstitutivt aktiv AKT T308D /S473D mutant og viste at konstitutivt aktiv AKT reddet de negative effektene av speil 204 på nedstrøms PS6 og fosfor-4E-BP1 (P4E-BP1) nivåer (Figur 5, sammenlign 5A og 5B). Men vi kunne ikke finne redningen av negative effekter mediert av MIR-204 på Pakt nivåer i celler co-transfektert med konstitutivt aktiv AKT (figur 5B). Dette er på grunn av mutasjon av Ser
473 Asp
473 i konstitutivt aktiv AKT, og derfor den anti-fosfo-Ser
473-AKT-antistoff benyttet for Western blot-analyse bare detektert endogene pakt, hvilken er redusert i nivå, i nærvær av MIR-204 (figur 5A og 5B).
A, MIR-204 undertrykker aktivering av AKT og mTOR signalering. HEK-293-celler transfektert med MIR-204 ble dyrket i serumfrie betingelser og utsatt for Western blot-analyse ved anvendelse av anti-fosfo-Ser
473-AKT (1:1000), anti-total-AKT (1:1000) , anti-fosfor-Ser
235/236-S6 (1:1000), anti-total-S6 (1:1000), anti-fosfor-Thr
37 /46-4E-BP1 (1:1000 ) og anti-total-4E-BP1 (1:1000). β-aktin (1:10,000) ble anvendt som en kontroll lasting. Gel fotografier er representative for tre uavhengige eksperimenter. B, HEK-293-celler transfektert med konstitutivt aktiv AKT T308D /S473D mutant (CA-AKT) i fravær og nærvær av MIR-204 ble dyrket i serumfritt tilstand og utsatt for Western blot-analyse som descried i A. C, overekspresjon av MIR-204 opphever BDNF-indusert membran ruffling og Rac1 trans. HEK-293-celler transfektert med MIR-204 eller MIR-185 ble dyrket i serumfrie betingelser og behandlet med eller uten BDNF (100 ng /mL) i 10 minutter og farget med Rac1 antistoff (rød) og FITC-phalloidin (grønn) . Pilene viser membran ruffling regioner. D, øker MIR-204 følsomheten av HEK-293-celler i apoptose som bestemt ved Annexin V /PI farging med FITC-Annexin V Apoptose Detection Kit. Prosentandelen cellepopulasjon vist er gjennomsnitt ± SEM av tre uavhengige eksperimenter. E, western blot analyse av HEK-293-celler transfektert med MIR-204 ved anvendelse av anti-kaspase-3 (1:500) antistoff og anti-PARP (1:1000) viser økt spaltning av kaspase-3 og PARP. β-aktin (1:10,000) ble anvendt som en kontroll lasting. Gel fotografi er representative for tre uavhengige eksperimenter.
AKT styrer celle invasivitet ved å regulere flere prosesser som er involvert i aktin organisasjon, celle-til-celle-adhesjon, og cellemotilitet [28], [29] , [30]. For å undersøke hvorvidt MIR-204 kan spille en direkte rolle i denne prosessen, vurdert vi effekten av MIR-204 overekspresjon på aktivering av den lille GTPase-proteinet Rac1, som funksjonelt samvirker med AKT /mTOR og er rapportert å spille en avgjørende rolle i cellemigrering og aktin omstilling etter induksjon med BDNF [31] eller epidermal vekstfaktor (EGF) [28]. Stimulering av MDA-MB-231 celler (og SKOV3 eller HEK-293-celler) med BDNF eller EGF induserte membran rusket og forårsaket Rac1 som skal translokert til rusket regionen (figur 5C, fig S7, og data ikke vist). I motsetning til dette, ble membranen rusket og Rac1 trans ikke observert i celler som overuttrykker MIR-204 når de induseres med BDNF eller EGF (figur 5C, fig S7, og data ikke vist). Unndragelse av apoptose, som er avgjørende for tumorvekst og progresjon [32] kan være en annen mekanisme sentralt onkogenese i kreft stiller tap av MIR-204. Videre har økt AKT /mTOR-aktivitet har også blitt assosiert med redusert apoptose i kreft [33]. Faktisk, MIR-204 overekspresjon forårsaket en betydelig økning i nivåene av begge aktivert kaspase-3 og poly-ADP-ribose polymerase (PARP), indikatorer for irreversibel skade på integriteten av cellen og genomet, med en resulterende økning av apoptotisk aktivitet (figur 5D og 5E). Til sammen våre funn tyder på at tap av MIR-204 fremmer tumorcellevekst, migrasjon og invasjon ved å aktivere sine mål gener som er kjent regulatorer av onkogen signalkaskade.
Diskusjoner
Mange mirnas forbundet med kreft er kjent for å være lokalisert til genomiske skjøre områder [34]. Men overraskende lite er kjent om den funksjonelle betydningen av regioner med kromosomavvik som inneholder miRNAs. Det er sannsynlig at de første genetiske skjermer (med lavere komparativ genomisk hybridisering oppløsning) med sikte på å oppdage kromosomavvik oversett endringer i genomiske regioner som inneholder miRNAs. Fordi mirnas påvirke flere gener i en eller flere stier som regulerer cellevekst og apoptose og bidrar til tumordannelse når deregulert, en nærmere gransking av mindre genomiske regioner som koder mirnas vil trolig gi viktig innsikt i mekanismen av tumorigenesis. Siden de fleste mirnas foreslås nedregulert i kreft, tror vi at microdeletion av genetiske områder som inneholder spesifikke mirnas er en hyppigere hendelse som spiller en viktig rolle i utvikling og progresjon av kreft hos mennesker og fortjener større oppmerksomhet.
i denne studien gir vi bevis for at MIR-204, som virker som en potent tumorvekst og metastase lyddemper er somatisk tapt i humane kreftformer. Vi viser at MIR-204 regulerer ekspresjon og funksjon av pro-angiogent protein BDNF og dets reseptor TrkB i tumorer. Våre resultater viser at tapet av MIR-204 fremmer BDNF (eller EGF) induserte kreftcelle migrering og invasjon ved å aktivere AKT /mTOR vei som fører til Rac1 translokasjon og aktin omorganisering. Siden AKT og Rac1 krever hverandre for deres aktivisering [28], [35], våre funn tyder på at tap av Mir-204 uttrykk i humane svulster kan indusere positive feedback loop mellom BDNF /akt1 /mTOR og Rac1 under kreft celle migrasjon og invasjon. Støtte for dette har både mTOR komplekser mTORC1 og mTORC2 blitt rapportert å regulere motilitet og metastasering av tykktarmskreft via Rac1 signalveien [36], og Rac1 har vist seg å samtidig regulere mTORC1 og mTORC2 [37]. Videre BDNF, som aktiverer GTP-bundet Rac1 nivåer [38], er blitt vist å bli blokkert av mTOR-inhibitor rapamycin [39]. Disse studiene, sammen med våre resultater som viser reduserte nivåer av pakt /pS6K i cellelinjer og i tumorer som overuttrykker MIR-204, sterkt tyder på at BDNF /AKT /mTOR /Rac1 signalkaskade er en av de viktigste mål for MIR-204. Fremtidige studier som tar sikte på å ta opp effekten av MIR-204 på mTORC1 og mTORC2 komponenter som Raptor /SIN1 vil trolig gi ytterligere innsikt. I likhet med BDNF, våre resultater viser at MIR-204 hemmer EGF-indusert aktivering av Rac1. Dette er viktig som krysstale mellom EGFR og BDNF-reseptoren TrkB har vist seg å indusere kreftcellemigrering [40] og respons på EGF er et nøkkeltrinn i løpet av kreftcelleinvasjon og er direkte forbundet med metastase [41]. Disse observasjoner tyder på at MIR-204 kan ha en større rolle i å endre vekstfaktor-induserte kreftcelle migrering og invasjon generelt. I tillegg til kreftcelle migrering og invasjon, aktivering av BDNF /TrkB signalering kan også bidra til omgåelse av apoptose i MIR-204 uttømte celler som BDNF /TrkB overekspresjon har vært knyttet til stabilisering og aktivering av AKT som resulterer i redusert apoptose [42]. I samsvar med dette, viser våre resultater at MIR-204 overekspresjon resulterer i redusert fosforylering og aktivering av mTOR nedstrøms mål 4E-BP1 og S6 kinase.
Fordi MIR-204 ligger innenfor
transient receptor potensielle kasjon kanal delen 3 product: (
TRPM3
) genet, som er et medlem av transient-reseptor mulige kanaler familie av proteiner som er kjent for å være viktig for cellulær kalsiumsignalisering og homeostase, vil det være fristende å spekulere at fenotypene assosiert med genomisk tap av kromosom loci inneholder MIR-204 kan også bidratt med verts genet
TRPM3
. Våre resultater viser undertrykkelse av tumorvekst og metastasering etter innføringen av MIR-204 alene, og ingen endring i nivåene av
TRPM3
genet i Mir-204 etterligne eller hemmer overekspresjon kreftceller (Figur S8), klart tyder på at MIR-204 assosiert tumor suppressor fenotype ikke er formidlet gjennom
TRPM3
. Men vi kan ikke utelukke at MIR-204 og verts genet
TRPM3
virke synergistisk å regulere undertrykkelse av tumorvekst samt tumor celle migrasjon og invasjon. Siden en klar rolle for
har TRPM3
i tumorigenesis ikke blitt rapportert, en detaljert studie som undersøker
TRPM3
potensial tumor suppressor rolle og dens synergistisk effekt med MIR-204 (hvis noen) vil være gjenstand for fremtidige undersøkelser.
til sammen våre funn tyder på at genetiske loci som inneholder spesifikke miRNA kan spille en kausal rolle i kreftvekst og metastase ved å regulere nøkkelen onkogene veien. Evnen til MIR-204 for å målrette
BDNF Twitter /
TrkB Hotell og
ezrin
, som har viktige roller i normale cellulære prosesser og overexpressed i aggressive kreftformer, viser at MIR -204 kan kontrollere viktige reguleringsmekanismer, feilregulering som kan disponere normale utviklings /differensiering arrangementer for å gjennomgå transformasjon. Derfor vil strategier som tar sikte på ved hjelp av MIR-204 som terapeutiske regimer har fordelen av å reversere uhensiktsmessig aktiverte trinnene i kreftceller til en mer normal tilstand. Identifiseringen av MIR-204 som en potent tumor suppressor sammen med demonstrasjon av sin terapeutiske potensial og ubetydelig hepatotoxicity etablere en sterk begrunnelse for å utvikle MIR-204 som en levedyktig terapeutisk diett for å behandle kreft.
Materialer og metoder
Normal og tumor vevsprøver og cellelinjer
cellelinjer som representerer pediatriske nyresvulster (HEK-293, embryonal nyrecellelinje), eggstokkene (SKOV3), og bryst (MDA-MB-231) kreft anvendt for eksperimenter ble oppnådd fra ATCC og dyrket i henhold til protokollene gitt. Sytti-seks pediatriske nyresvulster og normal matchet nyre ble kjøpt fra Barnas Oncology Group (Arcadia, California). Elleve avansert stadium ovarietumorer og fem normale eggstokkene vev ble hentet fra UT MD Anderson Cancer Center (Houston, Texas). Femten brystkreft vev og normale matchet vev ble hentet fra UT Health Science Center (San Antonio, Texas).
RNA og protein Analyser
Total RNA ble hentet fra tumorer og normalt vev, samt som alle cellelinjer, og ble underkastet QRT-PCR-analyse, som beskrevet tidligere [43]. Western blot-analyse ble utført som beskrevet tidligere [43]. β-aktin ble benyttet som en kontroll lasting. β-aktin ble benyttet som en kontroll lasting.
