Abstract
α-Actinins (ACTNs) er kjent for å kryssbinde aktin filamenter ved fokale sammenvoksninger i migrere cellene. Blant de fire isoformer av pattedyr ACTNs er ACTN1 og ACTN4 overalt uttrykt. Nylig ACTN4 ble rapportert å forbedre kreft cellemotilitet, invasjon og metastasering. Men den mekanismen som ACTN4 driver disse ondartede fenotyper er fortsatt uklart. Her viser vi at ACTN4, men ikke ACTN1, induserer dannelsen av umodne fokale sammenvoksninger i DLD-1 celler, som fører til rask omsetning av fokale sammenvoksninger. Interessant, zyxin (ZYX) enheten til knutepunkter voksn ble markert redusert i ACTN4-uttrykke DLD-1-celler, mens rekruttering av paxillin (PAX) forekom normalt. På den annen side, i ACTN1-uttrykkende DLD-1-celler, PAX og ZYX vanligvis ble rekruttert til fokal adhesjon, noe som tyder på at ACTN4 hemmer spesifikt fokal adhesjon modning ved å inhibere rekrutteringen av ZYX til fokal komplekser. Ved hjelp av rensede rekombinante proteiner, fant vi at ZYX binding til ACTN4 var defekt under forhold der ZYX binding til ACTN1 ble observert. Videre ble Matrigel invasjonen av SW480 celler som uttrykker høye endogene nivåer av ACTN4 protein hemmet av ektopisk uttrykk for ACTN1. Til sammen våre resultater tyder på at ZYX defekt binding til ACTN4, som dekker brennvoksninger i stedet for ACTN1, induserer dannelsen av umodne fokale sammenvoksninger, noe som resulterer i forbedring av cellemotilitet og invasjon
Citation. Fukumoto M, Kurisu S, Yamada T, Takenawa T (2015) α-Actinin-4 Forbedrer Colorectal Cancer Cell invasjon ved å undertrykke Focal Heft Modning. PLoS ONE 10 (4): e0120616. doi: 10,1371 /journal.pone.0120616
Academic Redaktør: Yves St-Pierre, INRS, CANADA
mottatt: 5 oktober 2014; Godkjent: 24 januar 2015; Publisert: 10 april 2015
Copyright: © 2015 Fukumoto et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Japan Society for Promotion of Science (JSP) gjennom JSP Grants-i-Aid for Scientific Research Grant 25860215 (til S. Kurisu ) og JSP Grants-i-Aid for Scientific Research Grant 23227005 (til T. Takenawa). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
α-Actinins (ACTNs) er allestedsnærværende uttrykt cytoskjelettet proteiner som fornettes aktin filamenter ved etterlevelse veikryss i epitelceller og fokale sammenvoksninger i polarisert trekkende celler [1,2]. I fokal adhesjon, ACTNs samvirke med en rekke andre brenn adhesjons-assosierte proteiner, for eksempel vinculin (VCL) [3,4] og integriner [5,6], og deretter koble aktin filamenter til fokal adhesjon [7-9]. Det er fire isoformer av ACTNs i pattedyrceller [10-12]. ACTN1 og ACTN4 er overalt uttrykk og kalles ikke-muskel isoformer, mens ACTN2 og ACTN3 er spesielt uttrykt i muskelvev. Blant ACTNs, er ACTN4 primært involvert i cellemotilitet og kreft invasjon [12-21]. Under celle bevegelse, er ACTN4 protein uttrykk nivå markert økt og ACTN4 konsentrerer i forkant av trekkende celler [12]. ACTN4 knockdown undertrykker migrasjon og invasjon av kreftceller [15-18,20-22], mens dens overekspresjon i kolorektal kreft celler induserer lymfeknutemetastase i immunsvikt mus [13]. Videre er ACTN4 proteinekspresjon nært knyttet til dårlig resultat hos pasienter med brystkreft [12], kolorektal [13], bukspyttkjertel [20,23], eggstokk [19], blære [21], og lunge [24] kreft. Men grunnen til at ACTN4, snarere enn ACTN1, er ofte assosiert med kreft malignitet tross likheter i domenestruktur, aktin-bindende og-tverrbindings aktiviteter, og Ca
2 + -sensitivity mellom de to gjenstår å bli belyst [25] .
Focal voksn er store integrin baserte, dynamiske makromolekylære strukturer som kobler den ekstracellulære matrise med intracellulære bunter av aktin filamenter kalles stress fibre. Fokal adhesjon er den primære struktur som overfører ekstracellulære strekkraft i en celle. Dermed blir adhesjonsstyrken av celler til substratet og levetiden eller dynamikken av fokal adhesjon kritisk påvirker den dynamiske organiseringen av celleform, inkludert celle motilitet. I migrere celle lamellipodia, begynnende sammenvoksninger, som består av grupperte griner og andre cytoplasmatiske proteiner som samlings vedheft kinase (FAK), ACTN, og vinculin (VCL) i utgangspunktet danne. Disse er kortvarige strukturer som enten omsetningen raskt i området rundt 60 sekunder, eller moden til større (omtrent 1 um i diameter) punktlignende adhesjon referert til som knutepunkter komplekser som vedvarer i flere minutter. Focal komplekser videre vokse sentripe inn langstrakte fokale sammenvoksninger og, samtidig, de tilknyttede aktin stresset fibrene blir tykkere [26]. Polymerisering av lamellipodial aktin katalyseres av aktin nukleasjon fremme faktorer, WASP familie verprolin-homologt protein (wave) familie proteiner og aktin-relatert protein 2/3 (Arp2 /3) -kompleks, som også er nødvendig for montering av begynnende adhesjon. Lamellipodial aktin filamenter, i konsert med ACTNs, skjema forløpere som fungerer som maler for modningen av begynnende sammenvoksninger innenfor fokusvoksn [27,28]. Modningen av begynnende brennvidde heft innebærer deltakelse av stillasproteiner, nemlig paxillin (PAX) og zyxin (ZYX), for å danne stabile fokale sammenvoksn [7,26,29-31]. PAX synes å regulere overgangen fra begynnende sammenvoksninger til Focal komplekser gjennom flere fosforylerte tyrosin rester av PAX. På den annen side, er en forholdsvis sen hendelse som inntreffer etter fokale komplekser dannes ZYX deltagelse i fokale adhesjon. Dermed er ZYX antas å være involvert i dannelsen og omorganisering av fullt modne, sentripetal fokale sammenvoksninger. I overensstemmelse, nylige rapporter tyder rolle ZYX i spenning fiber fortykning som følge av mekaniske påkjenninger [32]. ACTN1 er tradisjonelt antatt å være en linker mellom integrin komplekser og stress fiber, siden ACTN1 kan direkte binde til inte β1, VCL, og ZYX [33,34]. Imidlertid er rollen til ACTN4, som oppviser en høy aminosyre likhet (86%) for å ACTN1, har ikke blitt nøyaktig testet, både i funksjon og i protein-protein interaksjoner i fokal adhesjonsdannelse.
I denne studien viser vi den motsatte effekten av ikke-muskel ACTNs i fokus vedheft modning i kolorektal kreftceller. ACTN1 positivt regulerer brennvidde heft formasjon, mens ACTN4 induserer destabilisering og rask omsetning av fokale sammenvoksninger i ACTN4-overekspresjon celler. Vi viser også, for første gang, en klar forskjell mellom de to ACTN isoformer i ZYX-binding. ACTN4 binder seg ikke til ZYX, som trolig ligger til grunn den observerte høy omløpshastighet på fokale sammenvoksninger i ACTN4-overekspresjon celler, mens ACTN1 binder seg til ZYX som tidligere rapportert. ACTN4 unnlatelse av å binde seg til ZYX tett forbinder med kreft patogenesen, fordi kompromittert celle-grunnen adhesjon fører ofte til økt kreft cellemotilitet og invasivitet.
Materialer og metoder
Reagenser og antistoffer
Den anti-ACTN1 antistoff (H00000087) ble kjøpt fra Abnova (Taipei City, Taiwan). Den anti-ACTN4 antistoff (ALX-210-356) ble kjøpt fra Enzo og biovitenskap (Plymouth Meeting, PA, USA). Den anti-RhoA (sc-418) og anti-myosin regulatoriske lett kjede (MRLC) (sc-28329) antistoffer ble innkjøpt fra Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA, USA). Den anti-fosfor-MRLC (T18 /T19) antistoff (# 3674) og anti-His-tag antistoff (# 2365) ble kjøpt fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA). Den anti-FLAG (F3165), anti-VCL (V9131), anti-ZYX (HPA004835), og pan-ACTN (A5044) antistoffer ble kjøpt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA). Den anti-PAX-antistoff (610051) ble kjøpt fra BD Biosciences (San Jose, CA, USA). Den anti-fosfor-SRC (Y418) antistoff (44-660G) og anti-fosfor-FAK (Y397) antistoff (44-624G) ble kjøpt fra Life Technologies (
Carlsbad
, CA, USA). Den anti-aktin antistoff (MAB1501) ble kjøpt fra EMD Millipore (Rica, MA, USA). Rhodaminmerkede phalloidin ble kjøpt fra Life Technologies. Growth Factor Redusert Matrigel (# 354230) ble kjøpt fra Corning (New York, NY, USA). Aktin proteiner renset fra kanin skjelettmuskulatur (AKL99-A) ble kjøpt fra Cytoskjelett, Inc. (Denver, CO, USA).
Cell kultur
Den menneskelige tykktarmskreft cellelinjer DLD-en HT-29, LoVo, NCI-H508, og Caco-2 var generøse gaver fra Dr. T. Azuma (Tokyo Dental College, Tokyo, Japan). Den menneskelige tykktarmskreft cellelinje SW480 var en generøs gave fra Dr. K. Nagano (The Institute of Medical Science, University of Tokyo, Tokyo, Japan). DLD-en og LoVo ble opprinnelig kjøpt fra JCRB Cell Bank (Osaka, Japan). HT-29, NCI-H508, Caco-2, og SW480 ble fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). Alle cellelinjer, unntatt SW480, ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM; Wako, Osaka, Japan) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS), 4 mM L-glutamin og penicillin /streptomycin. SW480-celler ble dyrket i Roswell Park Memorial Institute 1640 medium (RPMI 1640, Wako, Osaka, Japan) supplert med 10% FBS. FreeStyle 293F celler ble dyrket i FreeStyle 293 Expression medium (Life Technologies).
plasmider og transfeksjon
Full-lengde human ACTN1, ACTN4, og ZYX cDNA ble oppnådd ved polymerasekjedereaksjon (PCR) ved hjelp av DLD-en celle cDNA som mal. Følgende delesjonsmutanter av ZYX ble forsterket av PCR: ZYX-N (aminosyrer [aa] 1-51) og ZYX-C (aa 52-572). Alle cDNA ble sekvensert og subklonet inn i pCMV2A, pCMV4A (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA), pEGFP-N2, pEGFP-N3, pEGFP-C1, pmCherry-N1 (TAKARA BIO Inc., Otsu, Japan), pGEX-6P-1 (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA), og pFastBacHT A (Life Technologies). GFP-vinculin (VCL) konstruksjon ble tidligere beskrevet [35]. For ACTN stabil uttrykk i DLD-1 celler, cDNA som koder GFP, ACTN1-GFP, og ACTN4-GFP ble forsterket av PCR og satt inn pIRESpuro3 vektor (TAKARA BIO Inc.).
Plasmider ble transfektert i DLD- 1 eller SW480 celler ved hjelp Lipofectamine 2000 reagenser eller i FreeStyle 293F celler med FreeStyle Max reagens i henhold til produsentens instruksjoner (Life Technologies).
RNA interferens (RNAi)
Små interfererende RNA (sirnas) rettet mot menneskelig ACTN1 og ACTN4 (siGENOME SMARTpool) og siGENOME Non-målretting kontroll siRNA Pool # 2 ble kjøpt fra GE Dharmacon (Lafayette, CO, USA). sirnas ble transfektert inn i DLD-1-celler med Lipofectamine RNAiMAX reagens (Life Technologies) ved en sluttkonsentrasjon på 10 nM. De transfekterte celler ble dyrket i et vekstmedium for 48-72 timer før den ble underkastet Western-blotting eller immunofluorescens farging.
Dannelse av stabile DLD-1-ACTNs-GFP cellelinjer
DLD- 1-celler ble transfektert med pIRESpuro3-GFP, -ACTN1-GFP, eller-ACTN4-GFP. Enkeltkolonier ble isolert etter 2 uker med puromycin seleksjon (1,5 ug /ml). Protein ekspresjon i cellelysatene ble undersøkt ved immunblotting med et anti-GFP-antistoff. De resulterende celler ble betegnet som DLD-1-GFP, DLD-en-ACTN1-GFP, eller DLD-en-ACTN4-GFP.
Rensing av rekombinante proteiner
Menneske helaftens ZYX og ZYX-C ble klonet inn i pCMV2B vektoren som koder for en N-terminal FLAG tag og transfektert inn i FreeStyle 293F-celler. Cellene ble høstet ved sentrifugering 48 timer etter transfeksjon, og pelleten ble resuspendert i immunutfelling (IP) buffer (20 mM Tris, pH 7,4, 100 mM NaCl, 0,5% NP-40, 1 mM etylendiamintetraeddiksyre [EDTA], og ett mM fenylmetylsulfonylfluorid [PMSF]) supplert med leupeptin og aprotinin. Cellene ble lysert ved ultralydbehandling og sentrifugert ved 100.000 x
g
i 30 minutter. Supernatanten ble inkubert med anti-FLAG M2 affinitetsgel (Sigma-Aldrich) i 2 timer og deretter vasket fire ganger med IP-buffer. Den FLAG-ZYX full og-ZYX-C bundet til anti-FLAG M2 gel ble umiddelbart brukt for pull-down analysen. Human ZYX-N ble klonet inn i pGEX-6P-1 vektor. Denne konstruksjonen ble brukt til å transformere BL21 (DE3) pLysS
Escherichia coli
celler (Promega, Madison, WI, USA). Cellene som uttrykker GST-fusjonsproteinene ble oppsamlet, resuspendert i lyseringsbuffer (40 mM Tris, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,5% Triton X-100, 5 mM EDTA og 1 mM PMSF, og Complete proteasehemmer cocktail tablet [ ,,,0],Roche, Basel, Sveits]), lysert ved ultralydbehandling og sentrifugert ved 12000 x
g
i 30 minutter. Supernatanten ble inkubert med Glutation Sepharose 4B (GE Healthcare) i 2 timer og deretter vasket med lyseringsbuffer. Bundet GST-ZYX-N ble eluert med glutation.
Hans-merket menneskelig full lengde ACTN1 og ACTN4 ble uttrykt i Sf9 celler ved hjelp av Bac-to-Bac Baculovirus Expression System (Life Technologies). Rekombinante proteiner ble renset ved hjelp av Ni-NTA Agarose (Qiagen, Venlo, Nederland).
immunfluorescens mikros
Celler ble transfektert med plasmider eller sirnas og re-belagt på Matrigel-belagte dekk etter 24- 48 h av transfeksjon. Cellene ble tillatt å overholde og spre seg i 24 timer og deretter fiksert med 4% paraformaldehyd i 10 minutter ved romtemperatur, etterfulgt av permeabiliseringen anvendelse av 0,2% Triton X-100 i fosfat-buffret saltvann (PBS) i 5 minutter. Objektglassene ble vasket to ganger med PBS og inkubert med primære antistoffer i 2 timer ved romtemperatur, og deretter behandlet med sekundære antistoffer i 1 time ved romtemperatur. Alexa Fluor 568 geit-anti-kanin IgG (H + L) antistoff og Alexa Fluor 647 geit anti-mus IgG (H + L) antistoff (begge fra Life Technologies) ble anvendt som sekundære antistoffer. Glassene ble montert med PermaFluor Vandig montering medium (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) og observert ved hjelp av en FluoView 1000-D konfokal mikroskop (Olympus, Tokyo, Japan).
Western blotting
Alle celler som brukes til western blotting ble sådd i plast retter forhåndsbelagt med Matrigel. Cellene ble lysert med Laemmli-prøvebuffer, sonikert kort tid for å bryte DNA, og kokt ved 95 ° C i 5 min. Western blotting ble utført ved standard prosedyrer med deteksjon av alkalisk fosfatase-konjugert geite anti-mus eller kanin-IgG sekundære antistoff (Promega). ImageJ programvare (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA) ble brukt til å kvantifisere bandet intensiteter.
Kvantifisering av fokale sammenvoksninger og stress fiber
Focal voksn ble kvantifisert som følger. Cellene ble fiksert og farget med anti-VCL antistoff og rhodamin-phalloidin, eller med anti-PAX og anti-Zyx antistoffer. Bilder ble oppnådd ved konfokal mikroskopi og terskelverdier for tre ganger bakgrunnen. Focal vedheft tall ble kvantifisert ved å telle VCL eller PAX plakk. For å kvantifisere brennvidde heft modenhet, ble Pax- og ZYX-positive plakk per arealenhet (DLD-1 celler) eller per celle (SW480 celler) telles. Åtte til åtti celler hentet fra tre uavhengige eksperimenter ble analysert. Forholdet mellom ZYX-positive til PAX-positive (totalt) plaque, ble beregnet for hver celle og deretter fordelt mellom cellene. For å kvantifisere fokal adhesjon størrelse, det midlere område av PAX-positive plaques ble beregnet for hver celle og deretter fordelt mellom cellene. Alle bildebehandlingen ble gjort ved hjelp ImageJ programvare.
Stress fiberdannelse ble kvantifisert som følger. Celler transfektert med kontroll, ACTN1, og ACTN4 sirnas, eller celler som uttrykker GFP, ACTN1-GFP, eller ACTN4-GFP ble farget med anti-VCL antistoff og rhodamin-phalloidin og avbildes ved konfokalmikroskopi under samme oppkjøps innstillinger. Phalloidin signaler ble terskel på samme nivå, og prosentandelen av celler som danner merkbar spennings fibre som er koblet til VCL plakk i det minste den ene enden ble kvantifisert. Eksperimentene ble gjentatt tre ganger. Minst 23 celler ble scoret for hvert forsøk.
Live-cell imaging av DLD-1 celler og omsetning analyse
DLD-1 celler transfektert med GFP-VCL og mCherry, ACTN1-mCherry, eller ACTN4-mCherry ble re-belagt på Matrigel-belagte, 35 mm med glassbunn retter (Iwaki, Tokyo, Japan) 24 timer etter transfeksjon. Om 16 timer etter re-plating, ble cellene observert i mer enn to timer etter total intern refleksjon fluorescens (TIRF) Mikroskopi (Olympus). Før samling av bildene, ble mediet erstattet med en CO
2-uavhengig medium (Life Technologies) supplementert med 10% FBS og 4 mM L-glutamin. Bildene ble tatt som en ramme hvert minutt i 120 minutter. De fotograferte voksn passer kriteriene ved at de ble lokalisert til en stikker lamellipodia. En sekvens av kymographs ble oppnådd ved bruk av ImageJ programvare. Time-lapse endring i fluorescens intensitet av GFP-VCL ble plottet ved hjelp av Microsoft Excel (Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA), og satsene for focal vedheft montering, stabilitet og demontering ble bestemt som tidligere beskrevet [28]. Disse målingene ble utført i 2-10 adhesjon per celle i 8-10 celler for hver tilstand.
Matrigel invasjon assay
invasjonen analysen ble utført som tidligere beskrevet [36], med noen modifikasjoner. DLD-1-GFP, DLD-1-ACTN1-GFP, og DLD-1-ACTN4-GFP-celler (2,0 x 10
5-celler i serumfritt DMEM) ble sådd ut i det øvre kammeret av BD BioCoat Matrigel invasjon kammer (BD Biosciences) og inkuberes med 10% FBS DMEM i bunnen godt og serumfritt medium i det øvre kammer. Etter 26 timer ble cellene fiksert med 3,7% formaldehyd i PBS i løpet av 30 minutter. Cellene ble vasket med PBS og de invaderte GFP-positive celler på undersiden av filtermembranen ble observert ved konfokal mikroskopi. Cellene i seks tilfeldig utvalgte mikroskopiske felt fra like kamre ble talt opp i tre uavhengige forsøk. SW480-celler ble transfektert med GFP eller ACTN1-GFP plasmider. Etter 24 timer ble celler (5,0 x 10
5 celler) ble sådd ut i den øverste kammeret og inkubert med 10% FBS RPMI 1640 i den nedre brønnen og serumfritt medium i det øvre kammeret.
Trekk -ned analyse
GST-ZYX-N proteiner bundet til glutation Sepharose 4B ble inkubert med renset Hans-ACTN1 eller Hans-ACTN4 proteiner i bindingsbuffer (lysis buffer pluss 1,0% bovint serumalbumin [BSA]) for to h, vasket tre ganger med bindingsbuffer, og bundne ACTNs ble analysert ved SDS-PAGE. FLAG-ZYX fulle og FLAG-ZYX-C-proteiner bundet til anti-FLAG M2 affinitet gel ble blandet med renset Hans-ACTN1 eller His-ACTN4, inkubert i 2 timer i IP buffer, og innbundne ACTNs ble analysert. Mengdene av aktiv RhoA ble kvantifisert i rullegardin analyser med GST-Rhotekin-RBD, som tidligere beskrevet [36]. Signalintensitetene ble målt ved bruk av ImageJ programvare.
Statistisk analyse
For multiple sammenligninger,
P
verdier ble generert ved en-veis analyse av varians (enveis ANOVA) ved hjelp av Dunnetts test for multiple sammenligninger. For to gruppeanalyser, Student
t
-test ble brukt. Analysene ble utført ved hjelp av GraphPad Prism 6 programvare (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, USA).
Resultater
ACTN1 og ACTN4 uttrykk i tykktarm kreft celler
ACTN4 ble rapportert å forbedre cellemotilitet og fremme lymfeknutemetastaser fra kolorektal kreft [13]. Det er imidlertid ikke klart om disse effektene er knyttet til ACTN4 isoform spesifikke funksjoner eller om ACTN1 klassisk isoform er i stand til å fremkalle kreft fenotyper som ACTN4 gjør. Vi først kvantifisert de relative uttrykk nivåer av endogene ACTN1 og ACTN4 proteiner i flere tykktarmskreft cellelinjer ved hjelp av rensede rekombinante proteiner som eksterne kontroller (fig 1A). ACTN4 ekspresjon var høyere enn for ACTN1 i alle celler, bortsett fra DLD-1-celler. DLD-1-celler uttrykte ACTN4 ved en lav, men lignende, nivå enn den til ACTN1 (figur 1B). Derfor, for å avklare differensial funksjon ACTN1 og ACTN4, brukte vi DLD-1 celler fordi effektene av ektopisk uttrykk eller stanse av ACTNs var synlig.
(A) Western blot analyse av ACTN1, ACTN4, og aktin i menneskets tykktarm kreft cellelinjer. ACTN1 og ACTN4 protein nivåene ble målt i forhold til rekombinante His-tag ACTN1 og ACTN4 proteiner som brukes som eksterne standarder. Aktin ble anvendt som en kontroll lasting og renset kaninskjelettmuskel-aktin ble benyttet som en ytre standard. (B) Bånds intensiteter ble kvantifisert, og de molare forholdene mellom ACTNs ble beregnet og fremstilt som mol-% mot aktin. Dataene representerer gjennomsnitt ± SD av tre uavhengige eksperimenter.
Differensial roller ACTN1 og ACTN4 i dannelsen av brennvoksn
ACTN1 og ACTN4 uttrykk i DLD-1 celler ble stille av siRNA (fig 2A). ACTN1 knockdown redusert antall av stress fibre og fokale adhesjon. Men ACTN4 knockdown uventet økt stress fibre og fokale sammenvoksninger (figur 2B-2D). Disse resultatene viser at både ACTN1 og ACTN4 er involvert i dannelsen av stress fibre og fokal adhesjon i DLD-1-celler, men tydelig på motsatte måter: ACTN1 forbedrer den, mens ACTN4 undertrykker den. Kontrasterende roller ACTNs ble også observert av ektopisk uttrykk for ACTN1-GFP og ACTN4-GFP i DLD-1 celler (figur 2E). ACTN4 overekspresjon trykkes dannelsen av stress fibre og fokale sammenvoksninger (fig 2F-2H). På den annen side, ACTN1 overekspresjon indusert utviklingen av stress fiber og fokale adhesjon.
(A) ACTN1 og ACTN4 uttrykk ble brakt til taushet av siGENOME SMARTpool siRNA i DLD-1 celler. Effektiv knockdown ble bekreftet ved western blotting ved anvendelse ACTN isoform-spesifikke antistoffer. Pilspissen indikerer endogene ACTN1. Stjernen indikerer en ikke-spesifikk crossreacting band. (B) Celler transfektert med de angitte sirnas ble farget for vinculin (VCL) og F-aktin og observert av konfokalmikroskopi. Pilene og pilspisser indikerer fokale sammenvoksninger og stress fiber, henholdsvis. Scale bar = 10 mikrometer. (C) prosenter av siRNA-behandlede celler som danner stresset fiber fremstilles grafisk. Data representerer gjennomsnittet ± SD fra tre uavhengige eksperimenter. *
P
0,05, **
P
0,01. (D) De fokale vedheft tall per celle av siRNA-behandlede celler ble fremstilt grafisk. Data representerer gjennomsnittet ± SD av 71 celler for kontroll, 73-celler med henblikk på Si-ACTN1 celler, og 55 celler for si-ACTN4 celler. *
P
0,05. (E) Transient ekspresjon av ACTN1-GFP og ACTN4-GFP i DLD-1-celler ble bekreftet ved Western-blotting ved anvendelse ACTN isoform-spesifikke antistoffer. (F) GFP, ACTN1-GFP, og ACTN4-GFP ble uttrykt i DLD-1-celler, som så ble farget for VCL og F-aktin og observert av konfokal mikroskopi. Pilene og pilspisser indikerer fokale sammenvoksninger og stress fiber, henholdsvis. Scale bar = 10 mikrometer. (G) i prosenter av transfekterte celler som danner stresset fiber fremstilles grafisk. Data representerer gjennomsnittet ± SD fra tre uavhengige eksperimenter. TFX indikerer transfeksjon. **
P
0,01. (H) Den fokale vedheft tall per celle av celler som uttrykker GFP, ACTN1-GFP, og ACTN4-GFP ble fremstilt grafisk. Data representerer gjennomsnittet ± SD av 130 celler for GFP, 52 celler for ACTN1-GFP, og 73 celler for ACTN4-GFP. *
P
0,05.
Major signalmolekyler som overfører informasjon fra vedheft plaketter til aktin stresset fiber inkluderer myosin II, FAK, SRC familie kinaser, og Rho familie GTPases. Derfor undersøkte vi de proteiner som er involvert i dannelsen av fokale sammenvoksninger av western blotting i celler hvor ACTN uttrykk ble brakt til taushet av siRNA (S1 fig). Fosforylering av myosin regulatoriske lette kjeder (MRLC) på treonin 18 og serin 19, og tyrosinfosforylering av FAK og SRC ble ikke endret. RhoA aktiviteten ble redusert spesielt i ACTN1 siRNA-behandlede celler. Selv om nedgangen i myosin II aktivitet i ACTN1 eller ACTN4 knockdown celler ble tidligere rapportert [14,17,37], kunne vi ikke påvise signifikante endringer i MRLC fosforylering. I tillegg reduksjonen observert i RhoA aktivitet var moderat (mindre enn 40% reduksjon for ACTN1 siRNA). Disse endringene korrelerte ikke med fenotypiske endringer i dannelsen av stress fibre og fokal adhesjon observert i ACTN knockdown celler i figur 2B-2D og 2F-2H. I tillegg aktiviteten av regulatorer av begynnende adhesjonsdannelse, dvs. FAK og SRC, var tilsvarende for kontroll og ACTN1 /4 siRNA-behandlede celler, noe som tyder på at endringer av stress fiberdannelse og kontaktklebe tall som reaksjon på manipulering av ACTN uttrykk kunne tilskrives forskjellige aktiviteter sene virkende molekyler i trinnvis modning av fokale sammenvoksninger som regulatorer av fokus kompleks stabilitet eller regulatorer av sentripetal brennvidde heft montering.
ACTN4 forbedrer brennvidde heft omløpshastighet
Neste, vi co-uttrykt ACTN1-mCherry eller ACTN4-mCherry med GFP-VCL og observert VCL tid-lapse bilder ved TIRF mikroskopi å spore montering og demontering av fokale sammenvoksninger. Som vist i figur 3A, S1 Movie, S2 Movie, og S3 Movie, omløpshastighet fokale sammenvoksninger i ACTN4-uttrykke celler dukket opp raskere enn for kontroll eller ACTN1-uttrykke celler. Den tid som kreves for en enkelt adhesjon må demonteres var 34 minutter i gjennomsnitt i kontroll mCherry-uttrykkende celler, noe som indikerer at adhesjonen avgrenset av GFP-VCL-signalet antas å oppnå en moden fokal adhesjon. Levetiden for slike brenn adhesjoner kan deles inn i tre trinn; montering, stabilitet og demontering (figur 3A). Vi målte den tid som kreves for hvert trinn (figur 3B-3D). I ACTN4-uttrykkende celler, den tid som er nødvendig for stabilisering og demontering var kortere enn i kontroll eller ACTN1-uttrykkende celler. Disse resultater viser at i ACTN4-uttrykkende celler, blir levetiden av fokal adhesjon forkortet på grunn av en akselerert hastighet demontering, noe som tyder på at fokal adhesjon blir destabilisert i en isoform-spesifikk måte ved ACTN4 overekspresjon.
(A) mCherry , ACTN1-mCherry, eller ACTN4-mCherry ble samtidig uttrykt med GFP-VCL og VCL tid lapse bildet ble observert av total intern refleksjon fluorescens (TIRF) mikroskopi å spore montering og demontering av fokale sammenvoksninger. De øvre panelene viser representative kymographs av GFP-VCL fluorescens langs 5-mikrometer lange linjer trukket i regionene utvide lamellipodia. Fluorescensintensiteten i det øvre panel ble plottet mot tiden, og vist som et diagram til bunnen av de respektive kymographs. Omsetnings faser av fokal adhesjon sammenstillingen, stabilitet og demontering er presentert som røde stiplede linjer i den mCherry vektordiagrammet. (B-D) Varighet av hver omsatte fase eksemplifisert i den venstre grafen i A ble analysert og kvantifisert fra 51 voksninger for mCherry-uttrykkende celler, 57 voksninger for ACTN1-mCherry-uttrykkende celler, og 64 voksn for ACTN4-mCherry-uttrykkende celler . Data er presentert som boks og whisker tomter med bokser som representerer tjuefemte-syttifemte persentil rekkevidde og værhår representerer tiende-nittinde persentil rekkevidde. N.S., ikke signifikant, **
P
0.01.
ZYX rekruttering til fokus komplekser er svekket i ACTN4-uttrykke celler
Gitt at brennvoksninger blir destabilisert av ACTN4 uttrykk i DLD-1 celler, hypotese vi at ACTN4 hemmer funksjon av proteiner som er involvert i transformasjonen av fokale komplekser til sentripetale fokal adhesjon. Spesielt undersøkte vi lokalisering av ZYX, som er rapportert å spesifikt lokalisere i modne sentripetal fokale sammenvoksninger [30]. Vi brukte PAX som en generell markør for fokale sammenvoksninger gjennom modning. Som vist i den øverste raden av figur 4A, GFP-uttrykke kontroll DLD-1 celler dannet PAX-positive plakk i lamellær celle periferien. Disse plakk ble antatt å tilsvare både fokale komplekser og sentripetal fokale adhesjon. Blant disse plaketter, kunne modne sentripetal fokale sammenvoksn skilles basert på ZYX colocalization. De gjennomsnittlige antall Pax- og ZYX-positive plakk i kontrollceller var 0,14 og 0,073 per kvadrat mikrometer, henholdsvis (fig 4B og 4C). Derfor omtrent halvparten av de fokale sammenvoksninger var ZYX-positive og ble dermed ansett for å være moden i kontrollceller. ACTN1-GFP- og ACTN4-GFP-uttrykke celler dannet tilsvarende antall PAX plakk som observert i kontrollceller, noe som tyder på at ACTNs har liten innflytelse på dannelsen av brenn komplekser (fig 4B). I motsetning til dette, ble både antallet og forholdet mellom ZYX-positive plaques i ACTN4-uttrykkende celler i betydelig grad redusert til 0,049 plakk /um
2 og 40%, respektivt, sammenlignet med de av kontroll og ACTN1-uttrykkende celler (figur 4C og 4D). I tillegg ble den dominerende form av fokal adhesjon i ACTN4-uttrykkende celler endret til en rund, dot-lignende struktur i motsetning til de langstrakte sentripetale adhesjoner som ble ofte observert i kontroll og ACTN1-uttrykkende celler (se pilene i fig 4A, bunn rad). Endringen i form ble reflektert i størrelsen av PAX-positive plaques som ble mindre i ACTN4-uttrykkende celler (figur 4E). Disse resultatene viser at brenn komplekser ikke kan nå modnet sentripetal fokale sammenvoksninger i ACTN4-uttrykke celler. I tillegg ACTN4 hemmer spesifikt riktig rekruttering av ZYX til Focal komplekser, noe som kan forklare de fenotypiske forskjeller mellom ACTN1- og ACTN4-uttrykke celler.
(A) GFP, ACTN1-GFP, og ACTN4-GFP ( vist i grønt) ble uttrykt i DLD-1-celler som ble farget for PAX (blå) og ZYX (rød) proteiner og avbildes under et konfokalt fluorescens mikroskop. Eske regionene i kolonnen lengst til venstre viser det perifere lamellene brukes til PAX og ZYX plakk kvantifisering. En rekke forstørrede bilder av eske regionene er vist til høyre. Pilene og pilspisser indikerer PAX-positive og PAX /ZYX-dobbel-positive plakk, henholdsvis. Scale bar = 30 mikrometer. (B-C) Tall fra Pax og ZYX plaketter per arealenhet av perifer lameller ble talt i GFP-, ACTN1-, eller ACTN4-uttrykke celler. Åtte til seksten celler ble analysert pr gruppe. Feilfelt refererer til standard avvik mellom celler. N.S., ikke signifikant, *
P
0,05, **
P
0,01. (D) Forholdet mellom ZYX-positive til PAX-positive plakk, dvs. totalt plakk voksninger. Feilfelt refererer til standard avvik mellom celler. N.S., ikke signifikant, **
P
0,01. (E) PAX plakk størrelse i GFP-, ACTN1- eller ACTN4-uttrykke celler ble målt i minst 171 voksninger fra 8-11 celler per gruppe. Feilfelt refererer til standard avvik mellom celler. N.S., ikke signifikant, *
P
0,05, **
P
*
P
0,05, **
P
0,05. 0,01.
