Abstract
Våre tidligere studier har vist at PMS1077, en blodplateaktiverende faktor (PAF) antagonist, kan indusere apoptose av Raji celler. Imidlertid er virkningsmekanismen ennå ikke er fastslått. Den nukleære transkripsjonsfaktor-kappa B (NF-kB) signalveien spiller en avgjørende rolle i tumorcelleoverlevelse, proliferasjon, invasjon, metastase, og angiogenese, så har vi fastslått at virkningene av PMS1077 og dets strukturelle analoger for tumor nekrose faktor-α ( TNF-α) indusert aktivering av NF-kB signalering. I denne studien, har vi funnet at PMS1077 hemmet TNF-α indusert ekspresjon av NF-kB regulert reportergen på en doseavhengig måte. Western blot-analyse indikerte at PMS1077 undertrykket den TNF-induserte α inhibitor av kB-α (IkB-α) fosforylering, IkB-α nedbrytning, og p65 fosforylering. PMS1077 gående blokkerte TNF-α indusert p65 nukleær translokasjon som vist i immunofluorescens-analysen benyttet. Dokking studier av molekylmodellering spådd at PMS1077 kan samhandle direkte med IKB kinase-β (IKK-β) subenhet. Disse resultatene antydet at PMS1077 kan undertrykke aktiveringen av NF-kB ved å målrette IKK-β involvert i NF-kB signalveien. Til slutt viste vi at PMS1077 lysfølsomt celler til TNF-α indusert apoptose ved å undertrykke uttrykket av NF-kB regulerte anti-apoptotiske gener. Våre resultater viser en ny funksjon PMS1077 på NF-kB signalveien og innebærer at PMS1077 kan betraktes som en anti-tumor lead compound
Citation. Shi J, Chen J, Serradji N, Xu X, Zhou H, Ma Y, et al. (2013) PMS1077 sensitizes TNF-α apoptose i Human prostata kreft celler ved å blokkere NF-kB signalveien. PLoS ONE 8 (4): e61132. doi: 10,1371 /journal.pone.0061132
Redaktør: Jun Li, Sun Yat-sen University Medical School, Kina
mottatt: 17 oktober 2012; Godkjent: 05.03.2013; Publisert: 09.04.2013
Copyright: © 2013 Shi et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Chun Hui prosjekter (antall Z2009-1-62001, https://www.moe.edu.cn) fra Kina Kunnskapsdepartementet og delvis av vitenskap og teknologi støtte prosjekter i Gansu-provinsen (antall 1104FKCA123, https://www.gsstc.gov.cn), Kina. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
i de senere år har vi syntetisert et visst antall piperazinderivater som viste potent dobbelt anti-PAF og anti-HIV-1-aktivitet [1], [2], [3], [4]. Mens ytterligere forbedre disse egenskapene og tar hensyn til fleksibilitet av disse forbindelsene, var vi også engasjert for å undersøke mulige effekter av disse forbindelsene i andre patologiske tilstander, som for eksempel betennelse og tumor genesis. Vårt tidligere arbeid vist at PMS1077 kan indusere apoptose av Raji-celler, men virkningsmekanismen er uklar [5].
På grunn av den viktige rollen av NF-kB regulert genprodukter i cellulær proliferasjon, overlevelse, invasjon, metastase, og angiogenese [6], [7], [8], begrunnet vi at PMS1077 kan mediere apoptose av kreftceller ved modulering av NF-kB signalkaskade. NF-kB familien er i det vesentlige består av fem proteiner, inkludert Rel-A (p65), Rel-B, C-Rel, P50 og P52 [9]. Den typiske pattedyr NF-kB består av et p50 /p65 heterodimeren. I ikke-stimulerte celler, NF-kB binder seg til inhibitor av kB proteiner og deponeres i cytoplasma som et inaktivt kompleks. Ved stimulering for eksempel ved TNF-α, fører signalkaskade til aktivering av IKB-kinase-komplekset, hvilket resulterer i fosforylering, ubiquitinering, og nedbrytning av IicB av 26S proteasomet [9], [10]. Deretter kan den frigjorte NF-kB heterodimer hurtig translocates inn i kjernen, hvor det binder seg til KB-området og induserer transkripsjon av et bredt spekter av mål-gener involvert i kreftutvikling og progresjon [8], [11].
i denne studien hypotese vi at PMS1077 kan modulere NF-kB aktivering veien. For å teste denne hypotese, bestemt vi effektene av PMS1077 og dets strukturelle analoger på TNF-α-indusert NF-kB-aktivering. Våre funn viste at PMS1077 kan inhibere den TNF-induserte α IkB-α degradering, IkB-α fosforylering, p65 fosforylering, og p65 nukleær translokasjon. Dokking studier av molekylmodellering spådd at PMS1077 kan undertrykke NF-kB aktivering av direkte interaksjon med IKK-β. I tillegg ble PMS1077 også funnet å undertrykke TNF-α indusert ekspresjon av NF-kB regulerte anti-apoptotiske gener, noe som fører til sensibilisering av TNF-α indusert apoptose i tumorceller. På denne måten dataene fra denne studien utvidet vår forståelse av de molekylære mekanismene som er involvert i anticancer aktivitet PMS1077, og kan hjelpe oss til å ytterligere optimalisere sine eiendommer for potensielle legemiddelutvikling.
Materialer og Metoder
Cellekultur kultur~~POS=HEADCOMP og reagenser
HEK293T (human embryonisk nyre), ble DU145 (human prostatakreft) og PC3 (human prostata cancer) celler erholdt fra American Type Culture Collection. Celler ble dyrket i DMEM (Dulbeccos modifiserte Eagles medium) supplert med 10% FBS (føtalt bovint serum), 100 enheter /ml penicillin og 100 mg /ml streptomycin og inkubert ved 37 ° C i en 5% CO
2 inkubator . PMS1077 og dets strukturelle analoger ble syntetisert som tidligere rapportert [4]. Disse analogene ble oppløst i DMSO for å gi en 50 mmol /L stamløsning for in vitro eksperimenter. TPCA-en (en spesifikk hemmer av NF-kB) ble kjøpt fra Sigma Aldrich (St. Louis, MO, US-). Antistoffer mot P-p65, p65, P-IkB-α, IkB-α, BCL-XL, Bcl-2, Survivin og PARP ble kjøpt fra Cell Signaling Technology. TNF-α ble kjøpt fra Pepro Tech. GenEscort ™ Transfeksjon Reagens ble kjøpt fra Wisegen Bioteknologi Corporation (Nanjing, Kina).
Transfeksjon og luciferase reporter analysen
DU145 og PC3 cellene ble sådd på 60 mm vev kultur retter, henholdsvis. NF-kB -avhengig ildflue luciferase reporter plasmid (4 × KB-pGL4.20) ble transfektert inn seeded celler ved hjelp GenEscort ™ transfeksjon reagens i henhold til produsentens instruksjoner. Etter 48 timer ble cellene selektert og proliferert i medium supplert med 5 ug /ml puromycin til resistente kloner vist. De to validerte kloner ble kåret DU145-NF-kB-Luc og PC3-NF-kB-Luc. Høy throughput screening for de angitte forbindelser ble utført i disse cellelinjene ved hjelp av ONE-Glo Luciferase Assay System (Promega).
For å studere NF-kB aktivering i HEK293 celler ved TNF-α, NF-kB-avhengige ildflue luciferase reporter (4 × kB-pGL4.20) var forbigående ko-transfektert sammen med Renilla luciferase plasmid (pGL4.74) i HEK-293T celler linje med en GenEscort ™ transfeksjon reagens i henhold til produsentens instruksjoner. Etter behandling ble cellene lysert med passiv lyseringsbuffer (Promega), og luciferase-aktiviteten ble bestemt ved bruk av en dual-luciferase reporter Assay System (Promega) med en Wallac1420 VICTOR (Perkin-Elmer, Wellesely, MA, US-). Relativ luciferaseaktivitet ble uttrykt som et forhold for ildflue luciferase-aktivitet for å Renilla luciferase-aktivitet. Data representerer tre uavhengige eksperimenter utført in triplo.
3- (4, 5-cimethylthiazol-2-yl) -2, 5-difenyl-tetrazolium-bromid (MTT) assay
Cellenes levedyktighet ble bestemt ved hjelp av MTT-analyse. I korthet ble cellene sådd ut i 96-brønners plater (1 x 10
4 celler /brønn), ble behandlet med forskjellige forbindelser ved forskjellige konsentrasjoner, og deretter opprettholdt i kultur i en ytterligere 12 eller 24 timer. Ved slutten av denne perioden ble 20 ul MTT (5 mg /ml) tilsatt til kulturmediet og inkubert ved 37 ° C i 2 timer. Deretter ble mediet fjernet. De vann-uløselige formazankrystaller ble deretter oppløst i DMSO (100 pl /brønn). Den optiske tetthet i hver brønn ble målt med en Wallac1420 VICTOR (Perkin-Elmer, Wellesley, MA, US-) ved 570 nm med en referansebølgelengde på 630 nm. For hver konsentrasjon som testes, brønner inneholdende alle reagenser bortsett fra celler som tjente som kontroller. Celle overlevelse er her beskrevet som relativ absorbans (A) prosentandel som definert av (A
stoffet /A
kontroll × 100) (Ye et al., 2004).
Western blotting-analyse
Western blotting av proteiner ble utført som beskrevet i en av våre tidligere studier [12]. I korthet, ble behandlede celler høstet i RIPA-lyseringsbuffer inneholdende 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,5% DOC, 0,1% SDS, 5 mM EDTA, 1 mM EGTA, 20 mM NaF , 2 mM natriumortovanadat og proteasehemmer Cocktail (Roche). Etter at lysering, ble lysatene sentrifugert i 10 minutter ved 13 000 g ved 4 ° C. Total proteinprøver (30-60 ug) ble overført til PVDF-membran etter elektroforetisk separasjon i 12% SDS polyakrylamidgel. Etter blokkering med 5% fettfri melk i TBST (0,1%) i 2 timer ved romtemperatur ble membranene inkubert over natten med det primære antistoff ved 4 ° C og vasket fem ganger i TBST, så inkubert med pepperrot-peroksidase konjugert sekundært antistoffer ved romtemperatur i 2 timer. Membranene ble vasket fem ganger i TBST, og deretter inkubert med en forbedret chemiluminescence vestlige detection system (Perkin-Elmer Life Sciences, Boston, MA, USA) og utsatt for røntgenfilm.
NF-kB /p65 kjernefysisk translokasjon analysen
immunocytokjemisk analyse av NF-kB /p65 kjernefysisk trans i PC-3 celler ble utført ved hjelp av en Cellular NF-kB trans~~POS=TRUNC Kit (Beyotime Biotech) i henhold til produsentens instruksjoner, som tidligere beskrevet [13 ], [14]. I korthet ble cellene sådd ut i 96-brønners plater ved 4000 celler /brønn. 24 timer senere ble cellene forbehandlet med PMS1077 (50 uM) i 2 timer, etterfulgt av behandling med 20 ng /ml TNF-α i 30 minutter. -Celler forbehandlet med 0,2% DMSO og 2 mM TPCA-1 ble anvendt som negative og positive kontroller, henholdsvis. Etter behandling ble cellene fiksert og inkubert med et blokkeringsbuffer ved romtemperatur i 1 time for å undertrykke ikke-spesifikk binding. Deretter ble cellene inkubert over natten med den primære NF-kB p65-antistoff ved 4 ° C, etterfulgt av inkubasjon med et Cy3-konjugert sekundært antistoff ved romtemperatur i 1 time, deretter med DAPI i 5 minutter før observasjon. Den p65 protein dukket rødt etter fluorescens mikroskopi og kjerner dukket blå. De røde og blå bilder ble slått sammen ved hjelp av Image J programvare for å produsere lilla fluorescens i områder av co-lokalisering.
Nuclear translokasjon av NF-kB /p65 ble også påvist i DU145-celler ved Western blotting-analyse av nærvær av p65 i cytoplasma og cellekjernen. Etter behandling ble cellene cytoplasmiske og kjernefraksjoner fremstilt ved anvendelse av fremgangsmåten som beskrevet i et av de tidligere studiene [12]. Da proteinprøver ble analysert ved Western blotting.
RT-PCR-analyse
Total RNA av de behandlede cellene ble fremstilt ved å bruke RNAprep rene cellesett (TIANGEN, Bei Jing, Kina) ifølge produsentens instruksjoner. 5 pg av total RNA fra hver prøve ble utsatt for revers transkripsjon ved bruk av M-MLV-revers transkriptase (Promega). Følgende primere ble brukt: GAPDH fremover, GTCAACGGATTTGGTCGTATT og GAPDH- revers, AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT; BCL-XL-forward, CTGAATCGGAGATGG AGACC og BCL-XL-revers, TGGGATGTCAGGTCACTGAA; BCL-2-forward, TGCACCTGACGCCCT TCAC og AGACAGCCAGGAGAAATCAAACAG og BCL-2-revers, AGACAGCCAGGAGA AATCAAACAG; survivin fremover, CCTTTCCTAAGACATTGCTAAG og Survivin-revers, GTG AATTTTTGAAACTGGACAG. PCR ble utført ved 94 ° C i 30 s, ved 56 ° C i 30 sekunder og 1 minutt ved 70 ° C i 30 sykluser. PCR produktene ble analysert på 2% agarosegel og visualisert ved etidiumbromidfarging.
apoptose analysen
Påvisning av apoptotiske celler ble utført med FITC-konjugert Annexin-V og propidium jodid (PI) . DU145-celler ble behandlet med 0, 40 og 80 uM PMS-1077 i 24 timer og deretter ble deretter pelletert ved sentrifugering ned, vasket to ganger med kald PBS og sentrifugert ved 1000 rpm for å samle cellene. Celler ble resuspendert i 200 ul av bindingsbuffer, og deretter ble 10 ul av Annexin V-FITC-, ble 5 ul av PI tilsatt. Celler ble inkubert i mørket i 30 minutter og analysert ved strømningscytometri. FACS ble utført med 488 nm som eksitasjon bølgelengde og bånd pass filter av 515-545 nm (for Annexin-V-FITC deteksjon) og 563-607 nm (for PI deteksjon). Dataanalyse ble utført ved hjelp av Cell quest programmet.
Molecular docking studie
IKK-β kinase domene (rester 16-310) ble hentet fra krystallstrukturen av IKK-β i kompleks med en inhibitor (PDB ID: 3RZF) [15]. Forbindelser PMS1077 og PMS601 ble bygget ved hjelp av Avogadro, med MMFF94 kraftfelt energi minimalisering inkludert 5000 trinnene bratteste nedstigningen og 2000 skritt av konjugerte gradienter [16]. Alle strukturer for docking ble tilberedt med AutoDockTools [17]. Gasteiger kostnad og sammenslåing upolare hydrogen ble tilsatt.
Molecular docking ble utført av Autodock Vina [18]. Forbindelser ble satt som fleksible strukturer, og bindende konformere ble søkt hjelp gjentok Local Search global optimizer. Endelige bindende konformasjoner ble valgt etter beste Autodock Vina score, kombinasjon av kunnskapsbasert og empirisk tilnærming Eq. 1. (1)
Her
ΔG
er total binding energi;
ΔG
gauss
er to Gaussian funksjoner som inneholder attraktive sikt for spredning;
ΔG
frastøting
er kvadratet av
d product: (overflaten avstand) når
d 0
;
ΔG
hydrofobe Hotell og
ΔG
hbond
er hydrofobe interaksjoner og hydrogenbindinger, henholdsvis; og
ΔG
tors
er sammensatte dreibare obligasjoner.
bindende affinitet ble også vurdert ved hjelp av Autodock sår 4,1 (Eq. 2) og NNScore 2.0 [19]. (2)
Her
W
vdw
,
W
hbond
,
W
elec
, og
W
sol
er vekt konstanter av Van der Waals interaksjoner, hydrogenbindinger, elektrostatiske interaksjoner, og desolvation energi, henholdsvis;
W
tor
er vekten av forbindelser torsjon.
NNScore 2.2 tar mye mer reseptor-ligand egenskaper til å bidra for binding affinitet, inkludert Autodock Vina vilkår og 12 forskjellige bindende egenskaper fra BINANA [20]. I denne studien, BINANA og Ligplot + [21] ble innført for å analysere samspillet mellom PMS1077 og IKK-β.
Statistikk og dataanalyse
Alle forsøkene ble utført uavhengig minst tre ganger og dataene er presentert som gjennomsnitt ± standardavvik, med mindre annet er angitt. Statistisk signifikans mellom ubehandlede grupper og behandlede gruppene ble bestemt ved hjelp av enveis variansanalyse (ANOVA) og t-test. P 0,05 ble betraktet som signifikant
Resultater
PMS1077 trykt TNF-α indusert ekspresjon av NF-kB-regulert reporter gen
I denne studien å belyse mekanismen involvert. i anti-tumoraktiviteter av PMS1077 (fig. 1), etablert vi DU145-NF-kB-Luc og PC3-NF-kB-Luc cellelinjer som stabilt uttrykker en 4 x kB-promotoren som driver luciferase reporter og bestemmes effekten av PMS1077 på TNF-α indusert aktivering av NF-kB i disse cellelinjene. I denne reportergen analysen ble PMS1077 observert å inhibere TNF-α indusert NF-kB aktivitet med mer enn 50% i DU145-celler og PC3-celler. Bare dataene i DU145-celler er vist i fig. 2A.
(A) DU145-NF-kB-luciferase celler ble behandlet med PMS1077 og dets strukturelle analoger ved endelig konsentrasjon på 50 uM. TPCA-1 (2 uM) er en spesifikk hemmer av NF-kB for positiv kontroll og DMSO som kjøretøy. Deretter ble cellene ubehandlet eller utsettes for TNF-α (20 ng /ml) i 12 timer. Luciferase aktivitet ble målt ved hjelp av ONE-Glo® luciferase analysesystem (Promega). (B) DU145-celler ble behandlet med PMS601, PMS1077, PMS1120 og PMS1144 ved de angitte konsentrasjoner i 12 timer. Cellelevedyktigheten ble bestemt ved å anvende MTT-assay. Verdiene er gjennomsnitt ± S.D. for tre uavhengige replikater. *
P
. 0,05 versus TNF-α stimulert gruppe
For å finne mer potent forbindelser, en serie av analoger (Fig. 1), strukturelt svært nær PMS1077 ble sendt til samme analyse. PMS1120, en stilling isomer av PMS1077 viste de sammenlignende aktiviteter som PMS1077 i begge cellelinjene, mens PMS1141 var like aktiv som PMS1077 bare i PC3 cellelinje. Andre analoger var mindre aktive enn PMS1077 i begge cellelinjene og PMS601 var en av de mest inaktive forbindelser i denne serie. Som for PMS1077, er bare dataene i DU145-celler er vist på fig. 2A.
For å utelukke effekten av cytotoksisitet, bestemt vi effekten av disse forbindelsene på celle levedyktighet. MTT-analysen indikerte at PMS601, PMS1077, PMS1120 og PMS1141 viste bare moderat cytotoksisitet ( 30%) i DU145-celler ved konsentrasjoner så høye som 80 uM (figur 2B.). Til slutt valgte vi PMS1077 som den beste sammensatte og PMS601 som kontroll for de påfølgende forsøkene.
For ytterligere å validere disse resultatene i mer nøyaktig dual-luciferase assay system, HEK293T celler ble midlertidig ko-transfektert med NF-kB -regulated luciferase reporter plasmid (4 × kB-MinIP /PGL4.20) og intern kontroll plasmid (PGL4.74). Som vist på fig. 3A, NF-kB relativ luciferaseaktivitet ble indusert av TNF-α på en doseavhengig måte, og denne aktivitet ble undertrykt ved en kjent IKK-β inhibitor TPCA-1 (Fig. 3B). Når cellene ble behandlet med PMS1077, har vi funnet at TNF-α indusert NF-kB relativ luciferasereportergenet aktiviteten var hemmet på en doseavhengig måte (fig. 3C). Imidlertid PMS601, en negativ kontroll, viste ingen signifikant virkning på aktiviteten (Fig. 3D).
HEK293T celler ble transient ko-transfektert med NF-kB-ildflueluciferase og TK-Renilla luciferase-rapportør vektorer for NF -κB aktivitetsanalyse. (A) NF-kB-avhengige reportergenekspresjon indusert av TNF-α. Transfekterte celler ble behandlet med bærer eller TNF-α (1, 5, 10, 20 og 50 ng /ml) i 12 timer; (B) TPCA-1 inhiberte ekspresjon av TNF-α indusert NF-kB avhengige reportergen. Transfekterte celler ble behandlet med bærer eller TPCA-en (1, 2, 3, og 4 uM), deretter inkubert med TNFa (20 ng /ml) i 12 timer; (C) PMS1077 hemmet TNF-α indusert NF-kB avhengig reportergenekspresjon. Transfekterte celler ble behandlet med bærer eller PMS1077 (20, 40, 60 og 80 pM), og deretter inkubert med TNF-α (20 ng /ml) i 12 timer; (D) PMS601 viste ingen effekt på TNF-α indusert NF-kB avhengig reportergenekspresjon. Transfekterte celler ble behandlet med bærer eller PMS601 (20, 40, 60 og 80 pM), og deretter inkubert med TNF-α (20 ng /ml) i 12 timer. Etter behandling, ble luciferase-aktivitet i (A), (B), (C) og (D) målt ved anvendelse av en dobbelt luciferase-analysesystemet (Promega). Viste data representerer den relative luciferase aktivitet normalisert mot Renilla luciferase aktivitet. Verdiene er gjennomsnitt ± S.D. for tre uavhengige replikater. *
P
0,05 versus TNF-α stimulert gruppe; NS, ikke signifikant.
PMS1077 hemmet TNF-α avhengige IkB-α fosforylering og degradering
fosforylering og ubiquitin proteasome-mediert degradering av IkB-α protein spiller en avgjørende rolle i aktivering av NF-kB signalveien. Mens deteksjon av fosforylering og nedbrytning av IicB-α i HEK293T, har vi funnet at TNF-α indusert IkB-α nedbrytning nådde maksimum ved 0,5 timer til 1 time, og det resyntese av IkB-α oppstått 2 t til 4 t etter TNF-α behandlings (fig. 4A). For å bestemme hvorvidt inhibering av TNF-α indusert NF-kB-aktivering er forårsaket av undertrykkelse av IkB-α degradering, forbehandlet vi HEK293T celler med PMS1077 og deretter utsatt dem for TNF-α i 0,5 time. Spesielt, PMS1077 ble funnet å inhibere nedbrytning av IicB-α på en doseavhengig måte (fig. 4B). I motsetning til dette ble det observert ingen tydelig effekt på nedbrytningen av IkB-α i PMS601 (80 pM) forbehandlede celler (Fig. 4B). Disse data indikerte at PMS1077 kan undertrykke TNF-α indusert IkB-α degradering, noe som fører til undertrykkelse av NF-kB-aktivering.
(A) TNF-α indusert IkB-α degradering, IkB-α fosforylering. HEK293T celler ble behandlet med TNF-α (20 ng /ml) for de angitte tidsperioder; (B) PMS1077 hemmet TNF-α indusert IkB-α degradering. HEK293T cellene behandlet med bærer eller PMS1077 (20, 40, 60 og 80 pM) eller PMS601 (80 pM) og TPCA-1 (1 uM), så inkubert med TNF-α (20 ng /ml) i 0,5 timer; (C) PMS1077 hemmet TNF-α indusert IkB-α fosforylering. HEK293T cellene behandlet med bærer eller PMS1077 eller PMS601 eller TPCA-1 som i (B), deretter inkubert med TNF-α (20 ng /ml) i 2 timer; (D) DU145-celler ble behandlet med bærer eller PMS1077 (40 og 80 uM) og TPCA-1 (1 uM), og deretter ble cellene enten ubehandlet eller utsettes for TNF-α (20 ng /ml) i 12 timer. Etter behandling ble de hele cellelysatene i (A), (B), (C) og (D) fremstilt og analysert ved Western blotting med antistoffer for IkB-α, fosforylering-IkB-α (Ser-32), fosforylering -p65 (Ser-536) og GAPDH. Alle data som vises er representative for tre uavhengige eksperimenter.
For å avgjøre om hemming av TNF-α indusert nedbrytning av IkB-α ble forårsaket av hemming av fosforylering av IkB-α, studerte vi effekten av PMS1077 på TNF-α indusert fosforylering av IicB-α i HEK293T celler. Som vist på fig. 4A, resyntese av IkB-α nådd et nivå lik den for kontroll 2-4 timer etter behandling og IkB-α fosforylering nådd et moderat nivå ved 1-2 timer etter TNF-α behandling, så vi utførte western blot-analyse av IkB -α fosforylering 2 timer etter TNF-α stimulering. Resultatene av denne analyse viste at forbehandling av PMS1077 sterkt hemmet TNF-α indusert IkB-α fosforylering på en doseavhengig måte, men PMS601 viste ingen effekt på denne fosforylering (fig. 4C).
Til sammen utgjør disse resultatene indikerte at PMS1077 hemmet TNF-α indusert aktivering av NF-kB via undertrykke fosforylering og nedbrytning av IicB-α. Imidlertid viste det strukturelle analoge PMS601 ingen signifikant effekt på fosforylering og nedbrytning av IicB-α.
PMS1077 hemmet konstitutiv og TNF-α indusert fosforylering av p65
Det er blitt godt demonstrert at fosforyleringen av serin 536 av p65 spiller en viktig rolle i reguleringen av NF-kB aktivitet og kan induseres ved en rekke av pro-inflammatoriske stimuli, inkludert TNF-α [22], [23], [24], [25]. Av denne grunn har vi også undersøkt effekten av PMS1077 på TNF-α indusert fosforylering av p65. Western blot analyse viste at fosforylering av p65 skjedde i TNF-a-behandlede DU145-celler og denne fosforylering av p65 ble inhibert på en doseavhengig måte i de forbehandlede celler med PMS1077 (40 og 80 uM) (fig. 4D, til høyre).
DU145 og PC3-celler er kjent for å ha konstitutivt aktiv NF-kB [26], [27]. For å avgjøre om PMS1077 påvirker også det konstituerende NF-kB uttrykk i disse cellene, behandlet vi DU145cells med PMS1077 (40 og 80 mm) uten TNF-α. Som vist i fig. 4D (til venstre), PMS1077 fullstendig undertrykt den konstituerende fosforylering av p65 i DU145 cellene på en doseavhengig måte. I tillegg ble PMS601 funnet å ha noen signifikant effekt på både den induserbare og konstitutive fosforylering av p65 (fig. S1). Dermed disse data indikerte at PMS1077 kan undertrykke både induserbar og konstituerende NF-kB aktivering.
PMS1077 blokkert TNF-α indusert NF-kB /p65 kjernefysisk trans
Fordi IkB-α degradering er nødvendig for kjernefysisk translokasjon av p65, forsøkte vi å finne ut om PMS1077 kan også undertrykke TNF-α indusert kjernefysisk translokasjon av p65. Western blot analyse viste at atomtranslokasjon av p65 forekom i DU145 etter TNF-α behandling. Imidlertid, når cellene ble forbehandlet med PMS1077 (50 uM) eller TPCA-1, TNF-α ikke klarte å indusere nukleær translokasjon av p65 (fig. 5A). For å bekrefte disse resultatene, utførte vi immunocytochemistry å observere p65 i PC3 og DU145 cellene. Resultatene viste at i ubehandlede, samt PMS1077 (50 uM) eller TPCA-en forbehandlet-celler, ble p65 lokalisert i cytoplasma, mens i celler behandlet med TNF-α alene, ble p65 translokert til kjernen (fig. 5B og Fig.S2). Imidlertid viste PMS601 ingen virkning på denne translokasjon av p65 (fig. S2). Disse data bekreftet at PMS1077 blokkerte TNF-α indusert nukleær translokasjon av p65.
(A) DU145-celler ble forbehandlet med PMS1077 (50 uM) eller TPCA-1 (2 uM) i 6 timer og etterfølges av TNF -α (20 ng /ml) stimulering i 0,5 timer. Cytoplasmatiske og nukleære ekstrakter som representerer et likt antall av celler ble analysert ved Western blotting ved å bruke de angitte antistoffer. (B) PC-3-celler ble forbehandlet med PMS1077 (50 uM) i 6 timer og etterfølges av TNF-α (20 ng /ml) stimulering i 0,5 timer. TPCA-1 (2 uM) og DMSO ble brukt som positiv NF-kB-inhibitor og negativ kontroll, respektivt. Etter behandling ble cellene farget med primær anti-p65-antistoff og Cy3 fluorescein-konjugert sekundært antistoff (rød), og deretter ble kjernen ble motfarget med DAPI (blå) og undersøkt ved hjelp av fluorescens mikroskopi. Bilder ble kjøpt for hver fluorescens kanal, med passende filtre med 40 × objektiv. De røde og blå bildene ble slått sammen ved hjelp av Image J programvare. Alle data som vises er representative for tre uavhengige eksperimenter.
Docking studie av molekylær modellering av interaksjoner mellom PMS1077 eller PMS601 og IKK-β
En rekke agenter, inkludert TNF-α, interleukin-1 beta (beta), forbolmyristatacetat (PMA), og okadainsyre (OA) har blitt rapportert å aktivere NF-kB, og PMA kan indusere aktivering av NF-kB gjennom ikk-komplekset [28], [29] . I den foreliggende undersøkelse, kan PMS1077 både hemme TNF-α og PMA indusert NF-kB aktivitet (Fig. 2A og S3 fig.). TNF-α indusert fosforylering av IicB-α katalyseres av IKK. Basert på det faktum at PMS1077 kan hemme IkB-α fosforylering, men PMS601 viste ingen effekt på denne fosforylering (fig. 4C), spekulerte vi hvorvidt PMS1077 kunne målrette IKK. For å utforske denne muligheten, sammenlignet vi bindingsaffiniteten av disse to forbindelser og IKK-β ved hjelp av beregningsmetoder. PMS1077 og PMS601 var forankret til IKK-β kinase domene, og bindende affinitet ble beregnet ved hjelp av tre forskjellige rille funksjoner som var Autodock vina poengsum, Autodock 4.1 og NNScore 2.0 (se Materiale og metode). Fra Autodock vina score, score på PMS1077 er lavere enn det PMS601, og den beregnede K
d av PMS1077 var approximatively 15 ganger lavere enn for PMS601. Dette ble bekreftet av to andre scoring system (tabell 1). Begge Autodock 4,1 og 2,0 NNScore viste at den beregnede K
d av PMS1077 var mer enn to hundre lavere enn den for PMS601. Denne beregningen er i overensstemmelse med resultatene som er gitt ovenfor (fig. 4B), som viste ingen tydelig endring i fosforylering av IicB-α ved PMS601 konsentrasjoner opp til 80 uM. Detaljene ved interaksjoner mellom PMS1077 og IKK-β er vist i fig. 6. Hydrofobe interaksjoner ble funnet å bidra mest i bindende affinitet, slik som rester LUE21, VAL29, TYR98, og ILE165. To hydrogenbindinger dannes mellom THR23 og PMS1077.
(A) 3D-modell av PMS1077 (ball og pinne stil) interaksjon med IKK-β kinase domene (rester vist i stick-modellen), hydrogenbindinger er vist i stiplede linje. (B) 2D diagram av interaksjoner mellom PMS1077 og IKK-β.
På denne måten disse beregningene viste at PMS1077 kan hemme NF-kB aktivering ved direkte binding til IKK-β og annen bindende affinitet til IKK-β resulterer i forskjellig aktivitet PMS1077 og PMS601.
PMS1077 lysfølsomt prostata kreft celler til TNF-α indusert apoptose gjennom å undertrykke TNF-α indusert transkripsjon av anti-apoptotiske gener
Vårt tidligere arbeid har vist at PMS1077 kan indusere apoptose av Raji celler [5]. I dette arbeidet har vi funnet at PMS1077 også indusert apoptose i DU145 og betydelig sensitivisert TNF-α indusert apoptose, som dokumentert av MTT analysen (fig. 7A) og ved differensial interferens kontrast mikroskopi (Fig. 7B). Dette ble ytterligere bekreftet ved hjelp av strømningscytometri ved annexin-V-FITC og propidiumjodid (PI) farging av den behandlede PMS1077 DU145-celler som vist i fig. 7C.
(A) DU145-celler ble behandlet med bærer, PMS1077 eller PMS601 som den angitte konsentrasjon (0-80 uM), og deretter inkubert med eller uten TNF-α (20 ng /ml) i 24 timer. Cellelevedyktigheten ble bestemt ved MTT-analyse. (B) DU145-celler ble behandlet med bærer eller PMS1077 (40 og 80 uM), og deretter inkubert med TNF-α (20 ng /ml) i 24 timer. Behandlede celler ble observert ved differensiell interferens kontrastmikroskop. (C) DU145-celler ble behandlet som (B) og apoptose-analyse ble utført ved flowcytometri gjennom annexin-V-FITC og propidiumjodid (PI) farging behandlede celler. (D) DU145-celler ble behandlet med bærer eller PMS1077 (40 og 80 uM), deretter inkubert med TNF-α (20 ng /ml) i 12 timer. Etter behandling ble helcellelysater fremstilt og analysert ved Western blotting med antistoffer som angitt. (E) DU145-celler ble inkubert med TNF-α (20 ng /ml) i 1 time, med bærer eller PMS1077 forhåndsbehandling i 6 timer. MRNA nivået av NF-kB kB målgener ble undersøkt ved hjelp av RT-PCR. (F) DU145-celler ble behandlet som (D) og helcellelysater ble fremstilt og analysert ved Western blotting med antistoffer for PARP og GAPDH. Alle data som er vist er representative for tre uavhengige eksperimenter.
Det har blitt godt etablert at inhibisjon av NF-kB signalveien sensitizes TNF-α indusert celledød og TNF-α blir ofte brukt for å fremkalle celle apoptose [30], [31], [32]. NF-kB signale fiendskap TNF-α og kjemoterapeutika indusert apoptose ved å fremme transkripsjon av anti-apoptotiske gener, for eksempel c-FLIP, CIAP-en, CIAP-2, XIAP, survivin, BCL-xL og BCL-2. På denne måten, kan blokkeringen av NF-kB signale potensere TNF-α indusert apoptose [31], [32], [33], [34]. Vi så bestemt om PMS1077 kan modulere TNF-α indusert uttrykk for anti-apoptose gener BCL-XL, Bcl-2 og survivin i DU145 cellene. Spesielt, etter TNF-α behandling, ble ekspresjonen av disse genene forbedret, men forbehandling av cellene med PMS1077 nedregulert ekspresjonen av disse genene i en doseavhengig måte både protein og mRNA nivå (Fig. 7D og 7E). Vi fant også at TNF-α indusert spalting av PARP ble betydelig økt med PMS1077 (Fig. 7F).
