Abstract
Kreft Targeting Gene-Viro-terapi (CTGVT) er konstruert ved å sette inn en antitumor genet inn en onkolytiske virus (OV). Det er faktisk et OV-genterapi, som har mye bedre antitumor virkning enn hver av genterapi alene eller virotherapy alene i vår tidligere publiserte rapporter. Denne studien er en modifikasjon av CTGVT ved å sette inn en tykktarmskreft (CRC) spesifikk suppressor genet, ST13, til en CRC bestemt onkolytiske virus, Ad · CEA · E1A (Δ24), å konstruere annonse · (ST13) · CEA · E1A (Δ24) for å øke målrettingen tropisme for tykktarmskreft, og det ble kort nevnt som CTGVT-CRC. Selv ble rapportert mange studier på CEA promoter og ST13 genet, men ingen konstruksjon har blitt utført for å kombinere både av dem som en ny strategi for tykk- og endetarmskreft (CRC) spesifikk terapi. I tillegg til CRC spesifisitet, det antitumoreffekt av Ad · (ST13) · CEA · E1A (Δ24) var også utmerket, og fikk nesten fullstendig hemming (ikke utrydding) av CRC xenograft siden ST13 var et effektivt antitumorgenet med mindre toksisitet, og en kinesisk patent (nr 201110319434,4) var tilgjengelig for denne studien. Ad · (ST13) · CEA · E1A (Δ24) forårsaket celle apoptose gjennom P38 MAPK (dvs. P38) som oppregulert CHOP og ATF2 uttrykk. Den mitokondrielle medisinert apoptose veien ble aktivert ved økning av caspase 9 og caspase 3 uttrykk
Citation. Zhou X, Xie G, Wang S, Wang Y, Zhang K, Zheng S, et al. (2012) potent og spesifikk antitumor effekt for tykktarmskreft ved CEA og Rb Double regulert Onkolytiske Adenovirus husing
ST13
Gene. PLoS ONE 7 (10): e47566. doi: 10,1371 /journal.pone.0047566
Redaktør: Zhaozhong Han, Vanderbilt University, USA
mottatt: May 22, 2012; Godkjent: 18 september 2012; Publisert: 15 oktober 2012
Copyright: © Zhou et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet , National Basic Research Program of China (973 Program) (No. 2010CB529901, nr 2011CB510104), Stiftelsen ble støttet av stiftelsen Science of Zhejiang Sci-Tech University (ZSTU) under Grant No. 1,016,834 Y National Natural Science Kina (81172449), Viktig National Science Teknologi konkret prosjekt for hepatitt og hepatoma Relaterte Program (2008ZX10002-023), og den nye innovasjonsprogram (2009-ZX-09102-246). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Kreft er en stor global folkehelseproblem. Totalt 1,529,560 nye krefttilfeller og 569,490 dødsfall fra kreft oppsto i USA alene i 2010 [1]. Tykktarmskreft er den nest høyeste dødsårsaken i USA, og er den fjerde vanligste kreftformen hos menn og den tredje vanligste kreftformen hos kvinner over hele verden [2]. Således er det viktig for forskere og leger for å utvikle nye strategier for colon cancer behandling. En strategi som ble igangsatt av oss i 1999 til 2011, betegnet Cancer Targeting Gene-Viro-terapi (CTGVT), omfatter innsetting av et antitumor gen inn i et onkolytisk virus (OV) [3], [4]. Det er faktisk et OV-genterapi. Den CTGVT (OV-genet) har potent antitumoreffekt, som er et resultat av de innsatte gener for å bli replikert flere hundre ganger sammen med replikasjon av viruset onkolytisk i kreftceller [5]. Vanligvis, rekkefølgen på antitumoreffekten er bedre ved CTGVT (OV-gen) enn effekten av OV og Ad-genet. Vi har viet oss til å studere CTGVT (OV-genet) strategi i over 10 år og publisert ca 70 relaterte papirer, som alltid viste mye høyere antitumoraktivitet enn for Ad-genet [6], [7], [8]. Den CTGVT (OV-genet) er betimelig å bli et hett tema siden Amgen betalte 1 milliard dollar for å kjøpe den OncoHSV-GM-CSF (OV fra Herpes simplex virus) fra BioVex [9] og OncoPox-GM-CSF har blitt publisert i Nature, 2011 [10].
Colorectal tumorigenesis er en komplisert prosess som er drevet av flere gener og involverer mange trinn. Tidligere forskning har vist at
ras
genmutasjoner; slettinger i kromosomer 5q, VED BETJENING 17Q og 18q;
neu, c-myc, etter eller
c-myb
presiseringer; og rearrangements av
trk
onkogen var involvert i tykktarmssvulster [11]. Men disse molekylære endringer kan ikke fullt ut forklare hele prosessen med kolorektal tumorigenesis. I 1993, Zheng
et al
. identifisert en kolorektal kreft-relatert gen som ble nedregulert i kolorektal cancer, kalt undertrykkelse av tumorgenisitet 13 (ST13) (GenBank aksesjonsnr HSU17714), som ble klonet ved subtraktiv hybridisering mellom screening cDNA fra normale slimhinnevevet og mRNA av kolorektal karsinom vev [12], [13], [14], [15]. Dermed ST13 var en kandidat tumor-suppressor gen som er involvert i kolorektal kreft [16], [17]. Økt ST13 protein uttrykk kan undertrykke spredning og indusere apoptose av kolorektal cellelinjer. Vår tidligere forskning bekreftet at bruk av ZD55-ST13 (en onkolytisk adenovirus slette E1B 55KDa) førte til en 100-fold hemmende effekt for tumorcellevekst i forhold til Ad-ST13
in vitro, etter og ZD55-ST13 også utøves en potent antitumoreffekt i et SW620 xenograft dyremodell av kolorektal karsinom [18]. Den forbedrede antitumor effekt av en annen onkolytisk adenovirus konstruksjon SG500-ST13 spissen SG500 var tydelig fra forsøk ved bruk av HCT116 og SW620-cellelinjer
in vitro
, så vel som anvendelsen av HCT116 xenograft modell
in vivo
[19]. I alle de ovennevnte ST13 forskning, er det ingen arbeid ved hjelp av celletype-spesifikk CEA promotor for å drive E1A (Δ24) uttrykk for å styre selektive replikasjon av virus for ytterligere CRC spesifikk terapi.
carcinoembryonic antigen (CEA) er en mye brukt svulst markør, særlig i overvåking av pasienter med kolorektal kreft [20]. Tidligere forsøk indikerte at CEA kan fungere som en celle adhesjonsmolekyl som kan spille en viktig rolle i embryogenese og eventuelt i løpet av tumorutvikling [21]. Schrewe H
et al
., Funnet at en CEA-genpromoteren-konstruksjon viste anticancer aktivitet som var ni ganger større mot CEA-produserende adenocarcinom-cellelinje SW403 enn den ikke-CEA-produserende HeLa-cellelinjen [20]. CEA-promoteren koblet til herpes simplex virus tymidinkinase (HSV-tk), så ut til å selektivt oppregulerer ekspresjonen av HSK-tk i CEA-uttrykkende pankreatisk karsinom cellelinje BXPC3, noe som har ført til antitumor-effekter [22]. AdCEAp /Rep, hvori E1A ekspresjon ble drevet av CEA-promoteren, effektivt inhiberte multiple levermetastaser av CEA-positive tykktarmskreft M7609 i en xenograft modell [23].
I denne studien ST13-genet ble innsatt inn i et onkolytisk viral vektor Ad · CEA · E1A (Δ24) som tilføres CEA promoter for å kontrollere E1A uttrykk med en 24-bp delesjon i E1A regionen ansvarlig for binding av retinoblastom (Rb) protein og dets replikasjon og denne konstruksjon ble kalt Ad · (ST13) · CEA · E1A (Δ24) (den ST13 i parentes representerer et uttrykk kassett). Dette er en modifikasjon av CTGVT med CRC spesifikk Cancer Targeting Gene-Viro-terapi (kortvarig CTGVT-CRC), som utgjør en ny strategi som ikke tidligere har vært rapportert. Våre data indikerer at antitumor av Ad · (ST13) · CEA · E1A (Δ24) var høyere enn for Ad · (EGFP) CEA · E1A (Δ24), videre høyere enn for ONYX-015
in vitro
og
in vivo
. Ad · (ST13) · CEA · E1A (Δ24) behandling betydelig hemmet, men ikke helt utryddet veksten av xenograft SW620 kolorektal karsinom i nakne mus, og overlevelsestiden ble dramatisk forbedret uten en naken mus død i annonse · (ST13) · CEA · E1A (Δ24) behandlede gruppen. Disse resultatene gir en ny innsikt for klinisk kolorektal kreft-spesifikk terapi og et patent er søkt [201110319434,4].
Materialer og metoder
Plasmider, virus og reagenser
pMD18-T vektor ble kjøpt fra Takara, Ltd., og den pBHGE3 plasmid ble kjøpt fra Microbix Biosystem Inc. (Toronto). Puten · E1A (Δ24), pMD18-T Simple-HCMV-MCS-polyA (SV40) og pXC2-CEA plasmider ble tidligere konstruert av vår gruppe. Den pCA13-ST13, ONYX-015 og Ad-WT virus ble opprettholdt i vårt laboratorium.
A. Skjematisk bygging av Ad · (ST13) · CEA · E1A (Δ24) og Ad · (EGFP) · CEA · E1A (Δ24). De innfødte
E1A
promoter ble erstattet av CEA arrangøren å kontrollere uttrykk for
E1A
gen med en 24-bp sletting. En ST13 eller EGFP ekspresjonskassett under kontroll av hCMV-promoteren var innsatt mellom den ψ pakking signalsekvensen og den E1A genet. B. Identifikasjon av CEA arrangøren og ST13 genet i PAD · (ST13) · CEA · E1A (Δ24) ved PCR. Lane M: DL2000 Marker; Felt 1: CEA arrangøren; Felt 2: ST13 genet. C. Påvisning av E1A (Δ24) og ST13 uttrykk nivåer når SW620 celler ble infisert med Ad · (ST13) · CEA · E1A (Δ24), Ad · (EGFP) · CEA · E1A (Δ24) eller den typiske onkolytiske virus ONYX- 015 ved en MOI på 5 i 48 timer. Western blot analyse ble gjennomført for å oppdage E1A (Δ24) og ST13 proteinnivåer.
Antistoffer mot caspase-3, caspase-9, Fas, BCL-XL, CHOP, E1A, p38, Phospho-p38 MAP kinase, ATF-2 og Phospho-ATF-2 ble kjøpt fra Cell Signaling Technology, Inc. PARP-1/2 og p-aktin antistoffer ble oppnådd fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA), anti-ST13 og anti-hekson-antistoffer ble innkjøpt fra Epitomic, og den IRDye® 680 esel-anti-muse-IgG og IRDye® 680 esel-anti-kanin-IgG ble ervervet fra LI-COR.
Levedyktigheten av tumorceller infisert med forskjellig mois av de ulike onkolytiske adenovirus. Tre CRC tumorcellelinjer (SW620, HCT116 og HT29) og tre CEA-negative cellelinjer (Bcap37 brystkreft, CNE Nasopharynageal karsinom og HeLa cervikal karsinom) og to normale celler (QSG7701 og WI38) ble infisert med enten Ad · (ST13 ) · CEA · E1A (Δ24), Ad · (EGFP) · CEA · E1A (Δ24), eller den typiske onkolytiske virus ONYX-015 på en rekke mois (0,1, 1, 5 eller 10 MOI), 4 dager, celle Levedyktigheten ble bestemt ved anvendelse av et MTT-assay. Ikke-infiserte celler ble vurdert å være 100% levedyktighet. Barer representerer gjennomsnitt ± SD (n = 6). B. Påvirkningen av viral infeksjon på cellelevedyktigheten til forskjellige tider. Tre CEA positive cellelinjer (SW620, HCT116 og HT29) og tre CEA-negative cellelinjer (Bcap37, CNE og HeLa) og to normale celler (QSG7701 og WI38) ble infisert med enten ONYX-015, Ad · (EGFP) · CEA · E1A (Δ24), eller Ad · (ST13) · CEA · E1A (Δ24) ved en MOI av 10. Etter 24, 48, 72 og 96 timer, cellen levedyktighet ble målt ved hjelp av MTT analysen. Dataene er presentert som gjennomsnitt ± SD av triplikat eksperimenter. C. levedyktighet av tumorceller infisert med forskjellige Mois av Ad · (ST13) · CEA · E1A (Δ24). CEA-negative tykktarmskreft cellelinje (Colo-320) og CEA-positive ikke-tykktarmskreft cellelinje (A549, MCF-7) ble infisert med Ad · (ST13) · CEA · E1A (Δ24) ved en rekke Mois ( 0,1, 1, 5 eller 10 MOI), 3 dager ble cellelevedyktigheten bestemt ved anvendelse av et MTT-assay. Barer representerer gjennomsnitt ± SD (n = 6).
Bygging av annet rekombinant adenovirusesThe CEA promoter fra pXC2-CEA ble subklonet inn PAD · E1A (Δ24) for å danne Pad · CEA · E1A (Δ24 ) som bærer adenovirus serotype 5 E1A gen med en 24-bp sletting fra 923 bp til 946 bp. Hele ST13 Ekspresjonskassetten ble videre satt inn i puten · CEA · E1A (Δ24) for å danne Pad · (ST13) · CEA · E1A (Δ24). Konstruksjonen metode for generering av PAD · (EGFP) CEA · E1A (Δ24) var tilsvarende som for PAD · (ST13) CEA · E1A (Δ24)
. Sekvensen til hver av de plasmidkonstruksjoner ble bekreftet ved hjelp av restriksjonsenzymnedbrytning, PCR og DNA-sekvensering. Den onkolytiske virus annonse · (EGFP) · CEA · E1A (Δ24) og Ad · (ST13) · CEA · E1A (Δ24) ble generert ved homolog rekombinasjon mellom PAD · (EGFP) · CEA · E1A (Δ24) eller PAD · ( ST13) · CEA · E1A (Δ24) med adenovirus emballasje plasmid pBHGE3 (Microbix Biosystem) i HEK293 celler ved hjelp av effectene transfeksjon reagens (Qiagen, Hilden, Tyskland) i henhold til produsentens instruksjoner. Hver rekombinant adenovirus ble valgt etter tre runder med plakkrensing i HEK293-celler og ble identifisert separat ved PCR. Den endelige rensingen av det virus ble utført ved cesiumklorid densitetsgradient-sentrifugering.
Morfologiske observasjoner av tumorceller og normale celler infisert med de forskjellige onkolytiske adenovirus som påvist ved mikroskopi. Celler ble infisert ved en MOI på 10, og de morfologiske forandringer i cellene ble observert ved mikroskopi etter 72 timer etter infeksjon. B. Påvisning av apoptose i SW620 celler ved FACS. SW620 celler ble infisert med enten ONYX-015, Ad · (EGFP) · CEA · E1A (Δ24) eller Ad · (ST13) · CEA · E1A (Δ24) ved en MOI på 10. På 48 timer ble cellene høstet og farget med annexin V-FITC (for tidlig-stadium apoptose) eller PI (for sent stadium apoptose) og ble undersøkt ved strømningscytometri. C. Prosentandelen av apoptotiske celler ble beregnet ved hjelp av Cell søken programvare. Dataene er presentert som gjennomsnitt ± SD (feilfelt) i triplikat eksperimenter. (** P 0,01; *** p 0,001)
Cellelinjer og cellekultur
HEK293 (humane embryonale nyrecellelinje) celler, A549 (human lunge adenokarsinom. linje), ble Colo-320 (human koloncancercellelinje), og MCF-7 (human brystcancer cellelinje) erholdt fra American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA). HeLa (human livmorhalskreft cellelinje), SW620, HT29 og HCT116 (human kolorektal kreft cellelinjer), WI38 (human føtal lunge fibroblast cellelinje normal), og QSG-7701 (human normal levercellelinje) celler ble kjøpt fra Celle Bank på Type Culture Collection av den kinesiske Academy of Sciences (Shanghai, Kina). SW620-celler ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM, Gibco BRL, Grand Island, NY) ble supplert med 5% føtalt bovint serum (FBS), 4 mM glutamin, penicillin (100 U /ml), og streptomycin (100 ug /mL). Alle andre cellelinjer ble dyrket i DMEM supplert med 10% FBS. Alle cellekulturer ble opprettholdt ved 37 ° C med 5% CO
2 i en fuktet inkubator. Celler i en logaritmisk vekstfase ble anvendt for eksperimentene.
SW620-celler ved western blot. SW620 celler ble infisert med enten ONYX-015, Ad · (EGFP) · CEA · E1A (Δ24) eller Ad · (ST13) · CEA · E1A (Δ24) ved en MOI av 5, 48 h, apoptose relaterte proteiner ble analysert ved western blot.
Western blot analyse
for ytterligere å utforske de molekylære mekanismene som er ansvarlig for celledød indusert av rekombinant adenovirus, ble Western blot analyser utført. SW620 og HCT116-celler ble utsådd i 6-brønners plater i en tetthet på 5 x 10
5 per brønn og dyrket over natten, og de ble deretter behandlet med eller uten viruset i 48 timer. Både adherente og flytende celler ble høstet i lyseringsbuffer [62,5 mM Tris-HCl (pH 6,8), 2% natriumdodecylsulfat (SDS), 10 mM glycerol, og 1,55% ditiotreitol]. Proteinkonsentrasjoner ble bestemt ved anvendelse av en Bicinchoninic Acid (BCA) proteinanalysesett (Thermo Scientific, Rockford, USA). Like mengder av proteiner ble separert ved 12% SDS-PAGE og ble deretter overført til nitrocellulose (NC) membraner. Membranene ble blokkert med 5% skummet melk og deretter inkubert med primære antistoffer, og de passende sekundære fluorescerende antistoffer. Immundeteksjon ble visualisert ved hjelp av en Odyssey infrarød bildesystem (LI-COR biovitenskap Inc, USA).
celleviabilitet analysen
Celler ble fordelt i 96-brønners plater og behandlet med enten ONYX-015, Ad · (EGFP) · CEA · E1A (Δ24), eller Ad (ST13) · CEA · E1A (Δ24) ved de angitte mois og tidspunkter. En MTT-analysen ble utført for å bestemme cellenes levedyktighet etter behandling med de forskjellige adenoviruser. Fire timer før slutten av inkubasjonen ble 20 ul av MTT-løsning (5,0 mg /ml) ble tilsatt til hver brønn. De resulterende krystaller ble oppløst i 150 ul DMSO /brønn ved risting i 10 min. Den optiske tetthet (OD) ble målt ved 570 nm ved hjelp av en DNA mikroplateleser (GENIOS modell, Tecan, Männedorf, Sveits). Den celleoverlevelsesprosenten ble beregnet ved anvendelse av følgende formel: celleoverlevelse% = (absorbans verdi av behandlede celler /absorbans verdi av ubehandlede kontrollceller) x 100%. Seks gjentatte prøver ble evaluert for hver konsentrasjon.
Tumorene ble etablert ved injisering av SW620-celler subkutant inn i høyre flanke av nakne mus. Når tumorer nådde 100-130 mm
3, ble musene tilfeldig delt i tre grupper (n = 8) og ble behandlet daglig med påfølgende intratumorale injeksjoner fire ganger over Onyx-015, Ad · (EGFP) · CEA · E1A ( Δ24) eller Ad · (ST13) · CEA · E1A (Δ24) på 5 × 10
8 PFU /dag og PBS. A. tumorstørrelse ble målt av målepunkter, og tumorvolumet ble beregnet ved anvendelse av følgende formel: tumorvolum (mm
3) = 0,5 x lengde x bredde
2. B. overlevelseskurve for dyrene i løpet av observasjonsperioden. Dataene er presentert som gjennomsnitt ± SD (feilfelt). En log-rank test har blitt brukt til å analysere overlevelse i de ulike gruppene. Statistisk signifikans: a, p 0,001, sammenlignet med PBS; b, p 0,01, sammenlignet med ONYX015; c, p 0,05, sammenlignet med Ad * (EGFP) * CEA * E1A (Δ24). C. hekson og ST13 uttrykk
in vivo.
Tumor deler avledet fra PBS eller ulike adenovirus narkotika behandlet 4 dager ble analysert for hekson og ST13 uttrykk ved immunhistokjemi. Original forstørrelse 400x.
flowcytometrisystemer Analysis
Menneske kolorektal kreft SW620 celler ble sådd i 6-brønners plater i en tetthet på 5 × 10
5 per brønn og ble dyrket ved 37 ° C med 5% CO
2 i en fuktet inkubator. Etter dyrking over natten ble cellene behandlet med enten Onyx-015 eller Ad · (ST13) · CEA · E1A (Δ24) ved en MOI på 5. Cellene ble trypsinert og høstet 48 timer etter behandling. Cellene ble deretter farget med annexin V-fluorescein-isotiocyanat (FITC) og propidiumjodid (PI) i en bindingsbuffer, som beskrevet i annexin V-FITC apoptose deteksjon settprotokollen (BioVision, Palo Alto, CA). Etter farging ble cellene analysert for apoptose med fluorescens-aktivert celle sortering. (FACS, Becton Dickinson)
Etikk erklæringen og dyreforsøk
Mann BALB /c naken mus (4-uke- gamle) ble opprettholdt og brukt i en lys og temperaturkontrollert rom i en AAALAC akkreditert studio og gitt vann og lab chow
ad libitum.
Alle eksperimentelle prosedyrer ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité Shanghai institutt for biokjemi og cellebiologi henhold protokollen IBCB-SPF0029. Xenopodet mus ble brukt som modellsystem for å studere den cytotoksiske effekten av SW620 celler (Chinese Academy of Sciences, Shanghai, Kina)
in vivo
. SW620 celler (5 × 10
6/100 mL) ble injisert subkutant i nedre høyre flanke av kvinnelige naken mus for å etablere svulsten xenograft modell. Tumorvolumet (V), som var basert på kalibermålinger, ble beregnet ved anvendelse av formelen V (mm
3) = lengde (mm) x bredde (mm)
2/2. Etter at tumorene nådde 100-130 mm
3 i størrelse, ble musene tilfeldig delt inn i kontroll- og behandlingsgrupper (n = 8). Behandlingsgruppene ble administrert intratumorally på sammenhengende daglige doser på 5 × 10
8 plakkdannende enheter (PFU) /100 mL av enten ONYX-015, Ad · (EGFP) · CEA · E1A (Δ24), Ad ( ST13) · CEA · E1A (Δ24) i fire dager. Kontrollgruppen ble behandlet med påfølgende intratumorale injeksjoner fire ganger med det samme volum av PBS
Tumor deler av HCT116 CRC ble analysert for nekrose av hematoksylin-eosin (H E). Flekker, for apoptose av TdT-mediert dUTP-biotin nick-ende merking (TUNEL), og for morfologiske observasjoner av transmisjons-elektronmikroskop (TEM) analyse. (B1), apoptose i tumorceller. (B2), For klarhet, ble en enkelt svulst observert for apoptose.
Immunohistokjemiske og histopatologiske Eksperimenter
For immunhistokjemisk evaluering, ble to mus per gruppe tilfeldig valgt 4 dager etter virus administrasjon. Under aseptiske betingelser ble tumorvev høstet og kuttet i biter på omtrent 1 kubikkmillimeter i størrelse. Den friske vev ble umiddelbart nedsenket i 4% paraformaldehyd, hvor den ble holdt i 48 timer ved romtemperatur og ble deretter innleiret i parafin. Etterpå ble prøvene kuttet i 4-mikrometer tykke seksjoner. Immunhistokjemi ble utført med en anti-adenovirus hekson eller anti-ST13 antistoff (Biodesign International, Saco, ME) ved hjelp av immuno kit i henhold til produsentens protokoll. I tillegg ble det patologiske forandringer i tumorvevet undersøkes etter hematoxylin og eosin (H E). Beising og TUNEL-farging, så vel som ved transmisjons elektrisk mikroskopi (TEM)
Statistical Analysis
Alle data er presentert som gjennomsnitt ± SD og ble behandlet ved hjelp av SPSS 10,1 statistisk programvare. Hver kvantitative eksperiment ble utført minst tre ganger, og statistisk signifikans ble tildelt for P-verdier ≤0.05.
Etter Ad · (ST13) · CEA · E1A (Δ24) infeksjon, på den ene siden, fosforylert P38, ATF2 og oppregulering av CHOP uttrykk ble oppdaget. På den annen side, ble bøddelen caspase-3 aktivert.
Resultater
Anleggs og karakterisering av Ad · (ST13) · CEA · E1A (Δ24)
Annonse · (ST13) · CEA · E1A (Δ24) vektor ble vellykket konstruert ved å erstatte den opprinnelige E1A arrangøren med colorectal cancer-spesifikk CEA promoter, slette 24 bp i Ad · E1A (923-946 bp) og skjuler antitumor ST13 -genet, som vist i fig. 1A. Identifiseringen av ST13 og CEA-ekspresjon ved PCR ble vist i fig. 1B. For å bestemme E1A (Δ24) og ST13 uttrykk for ulike virus, ble CRC SW620 cellelinje infisert med enten Ad · (ST13) · CEA · E1A (Δ24), Ad · (EGFP) CEA · E1A (Δ24), eller den typiske onkolytisk virus Onyx-015 ved en MOI på 5. Western blot analyser ble anvendt for å detektere E1A (Δ24) og ST13 protein. Resultatene viste at Ad · (ST13) · CEA · E1A (Δ24) vektor indusert bestemt ST13 uttrykk og den største E1A (Δ24) uttrykk (Fig. 1C) i påvisbare CRC celler.
CRC-spesifikke Antitumor effekt av Ad · (ST13) · CEA · E1A (Δ24)
in vitro
CEA-positive CRC cellelinjer (SW620, HCT116 og HT29), og tre CEA-negative kreftcelle linjer (brystkreft Bcap37 cellelinje, Nasopharynageal carcinoma CNE cellelinje og livmorhalskreft HeLa cellelinje) og to normale cellelinjer (QSG7701 og WI38) ble infisert med enten Ad · (ST13) · CEA · E1A (Δ24), Ad · ( EGFP) · CEA · E1A (Δ24), eller ONYX-015 når den angitte mois (0,1, 1, 5 eller 10). Etter 96 timer ble cellelevedyktigheten analysert ved anvendelse av MTT-analysen.
Som vist i fig. 2A, den onkolytiske effekten av annonsen (ST13) · CEA · E1A (Δ24) behandling viste en overlegen antitumor effekt enn gjorde behandlingen med Ad · (EGFP) · CEA · E1A (Δ24) eller ONYX-015 på en MOI av fem eller 10. Videre er inhiberingen var doseavhengig. Den Bcap37, CNE og HeLa-celler viste et lavere nivå av inhibering enn de tre CRC-cellelinjer, og det var ingen inhibering i QSG7701 eller WI38 normale cellelinjer.
Som vist i fig. 2B, et tidsforløp for behandling med de rekombinante virus ble også undersøkt. Celler ble infisert med enten Ad · (ST13) · CEA · E1A (Δ24), Ad · (EGFP) · CEA · E1A (Δ24) eller ONYX-015 på en MOI på 10 for ulik tid (24, 48, 72 eller 96 h), og cellelevedyktigheten etter infeksjon ble bestemt ved anvendelse av MTT-analysen. Resultatene indikerte at cellulær inhibering var tidsavhengig. Den antitumor effekt etter Ad (ST13) · CEA · E1A (Δ24) behandling var bedre enn følgende annonse · (EGFP) · CEA · E1A (Δ24) og ONYX-015 behandling i hver av cellelinjer undersøkt (Fig. 2B) . Etter 96 timer, levedyktigheten av Ad · (ST13) · CEA · E1A (Δ24) -infected celler ble betydelig redusert. Igjen cytotoksisitet av Ad · (ST13) · CEA · E1A (Δ24) på tre kolorektal kreft viste større antitumor effekt enn for tre CEA-negativ kreft, mens ingen cytotoksisitet i to normale celler.
Disse resultatene indikerte at Ad · (ST13) · CEA · E1A (Δ24) hatt en større spesifikk antitumor effekt på tre CEA-positive kolorektal kreft celler enn for tre CEA-negativ kreft.
for ytterligere å bekrefte om antitumor effekt Ad (ST13) · CEA · E1A (Δ24) var CEA spesifikk eller tykktarm-spesifikke, sammenlignet vi dens virkning på CEA-negative tykktarmskreft cellelinje (Colo-320) og CEA-positive ikke-tykktarmskreft cellelinje (A549 , MCF-7), slik som vist i fig. 3C. Våre funn antydet at Ad (ST13) · CEA · E1A (Δ24) var mer konkret på CEA-positive kreftceller.
Morfologiske endringer og apoptose indusert av virus behandling og analysert flyt eytometryMorphological endringer i kreftceller og normale celler behandlet med ulike virus ved en MOI på 10 etter 72 timer ble observert ved mikroskopi. Som vist på fig. 3A, en cytopatisk effekt ble observert i CEA-positive kolorektal kreft celler infisert med enten Ad · (ST13) · CEA · E1A (Δ24), Ad · (EGFP) · CEA · E1A (Δ24) eller ONYX-015 sammenlignet med CEA-negative HeLa celler. Resultatene viste at det var flere betydelige morfologiske endringer i Ad · (ST13) · CEA · E1A (Δ24) -infected kreftceller enn i Ad · (EGFP) · CEA · E1A (Δ24) -infected eller ONYX-015-infiserte celler , for eksempel celle krymping og utseendet av små cellulære fragmenter. Videre ble det ikke observert morfologiske endringer i normal QSG7701 levercellelinje. Disse resultatene ble ytterligere bekreftet av resultatene av MTT-analyser.
For å avgjøre om apoptose var involvert i annonse · (ST13) · CEA · E1A (Δ24) -indusert celledød, apoptose ble evaluert ved hjelp av flowcytometri analyse. SW620 celler ble infisert med enten ONYX-015 eller Ad · (ST13) · CEA · E1A (Δ24) ved en MOI av fem i 48 timer. Cellene ble deretter underkastet annexin V-farging for å identifisere tidlige stadium apoptose og PI-farging for å identifisere sent stadium apoptose ved flowcytometrisk analyse. Som vist på fig. 3B, prosenter av Ad · (ST13) · CEA · E1A (Δ24) -infected tumorceller i tidlig stadium og sent stadium apoptose var 7,13% og 22,22%, henholdsvis. Summen av celle prosenter for tidlig- og sen-stadium apoptose, som er vist i fig. 3C, var 29,35% for Ad · (ST13) · CEA · E1A (Δ24), 8,85% for ONYX-015 og 3,9% for mock-infiserte celler. Disse dataene viste at Ad (ST13) · CEA · E1A (Δ24) behandling kan effektivt indusere kreft celledød ved spesifikt å indusere apoptose.
Apoptose oppdaget av caspase Relaterte Enzyms
Apoptose er ofte ledsaget av dramatiske endringer i nivåene av kaspase-relaterte enzymer og proteiner. Tidligere forskning har vist at ZD55-ST13 behandling indusert apoptose via mitokondrie vei [18]. Derfor ble flere apoptose-relaterte proteiner fra SW620-celler analysert ved hjelp av western blot. Som vist på fig. 4A, nivået av anti-apoptotiske protein Bcl-XL ble redusert, noe som ville støtte den rolle for mitokondrielle apoptose. I tillegg, kløyvde caspase-9, kløyvde caspase-3 og spalting av PARP, ble alle markert økt i Ad · (ST13) · CEA · E1A (Δ24) -infected celler. Det var klart at Ad · (ST13) · CEA · E1A (Δ24) behandling indusert apoptose mer effektivt enn at behandling med enten Ad · (EGFP) CEA · E1A (Δ24) eller ONYX-015.
p38 signaltransduksjonsbane, et mitogen-aktivert proteinkinase (MAPK) reaksjonsveien, spiller en viktig rolle i regulering av mange cellulære prosesser, herunder inflammasjon, celledifferensiering, cellevekst og død. I tillegg p38 transduces også signaler til andre cellulære komponenter for gjennomføring av ulike cellulære responser. ATF2, et substrat for p38, kan danne heterodimerer med medlemmer av juni familien av transkripsjonsfaktorer, og kan dermed direkte forbinder med AP-en bindingssetet [24]. CHOP, et medlem av C /EBP familie av transkripsjonsfaktorer, er også referert til som vekst arrest og DNA-skader-induserbar genet 153 (GADD153) og er involvert i regulering av cellevekst og differensiering [25]. Som vist på fig. 4B, uttrykket av fosforylert p38 ble betydelig økt etter Ad · (ST13) · CEA · E1A (Δ24) behandling. I mellomtiden, aktivert p38 økt nivå av fosforylert ATF2 og ekspresjon av CHOP. Disse resultatene indikerte at p38 kan være involvert i en apoptotisk reaksjonsvei som ble indusert av CRC spesifikk onkolytisk adenovirus husing ST13 (CTGVT-CRC). De tilsvarende resultater om apoptose relaterte proteiner ble påvist i human kolorektal kreft celle linjer HCT116. (Fig. S1).
Antitumor effekt av Ad · (ST13) · CEA · E1A (Δ24) i hårløse mus
SW620 xenograft modell for menneske kolorektal tumorer ble etablert i atymiske nakne mus å vurdere potensielle antitumor effekt av Ad · (ST13) · CEA · E1A (Δ24)
in vivo.
Som vist i figur. 5A, svulstene vokste raskt i PBS-behandlede gruppen, mens ulike grader av tumorvekst undertrykkelse ble observert i ONYX-015-, Ad · (EGFP) · CEA · E1A (Δ24) – og Ad (ST13) · CEA · E1A (Δ24) -behandlet grupper. Den gjennomsnittlige volumet av Ad · (ST13) · CEA · E1A (Δ24) -behandlet SW620 svulster var ca 170 mm
3 på 30 dager etter behandling, som representerte en økning på bare 40-70 mm
3 sammen med den innledende tumorvolum på 100-130 mm
3. Det endelige tumorvolum av PBS-behandlede gruppen var omtrent 2500 mm
3, noe som indikerer at det var omtrent 98% tumorvekst-inhibering hastigheten i disse dyrene, noe som ville tyde på at en nesten fullstendig inhibering ble observert i de eksperimentelt behandlede dyr . Dette potent og spesifikk hemming av CRC bruker CTGVT-CRC strategien hadde ikke tidligere blitt rapportert.
I tillegg ble dyr overlevelse overvåkes inntil 54 dager etter behandling, og alle musene overlevde i annonse · (ST13) · CEA · E1A (Δ24) gruppe. I de andre gruppene, ble de overlevelse signifikant redusert i ulik grad, som Ad · (EGFP) · CEA · E1A (Δ24 group) ble 50% overlevelse, ONYX-015 gruppen var 37,5% overlevelse, og PBS-behandlede konsernet hadde bare en 12,5% overlevelse (fig. 5B). Disse resultatene antydet at CTGVT-CRC strategi ved hjelp av Ad · (ST13) · CEA · E1A (Δ24) kan effektivt forbedre overlevelse av mus.
For å studere mekanismen av Ad · (ST13) · CEA · E1A (Δ24) virkning, immunhistokjemisk undersøkelse for hekson ekspresjon av adenovirus og ST13 genekspresjon nivå
in vivo
ble utført. Som vist på fig. 5C i annonse · (ST13) · CEA · E1A (Δ24) -behandlet gruppe, hekson proteinnivået var høyere enn i de villtype virus-behandlede grupper, og ST13 ble tilsvarende sterkt uttrykt. Som vist på fig.
