Abstract
En rolle for mikrober har vært mistenkt i prostata kreft, men vanskelig å få bekreftet hos mennesker. Vi viser her at en gastrointestinal (GI) bakteriell infeksjon er tilstrekkelig til å forbedre prostata intraepitelial neoplasi (PIN) og mikroinvasiv karsinom i en musemodell. Vi fant at dyr med en genetisk forkjærlighet for feilregulering av
wnt
signalering,
Apc
Min /+
mutante mus, var betydelig utsatt for prostatakreft i en betennelse avhengig måte etter infeksjon med
Helicobacter hepaticus
. Videre observerte tidlig neoplasi i infisert
Apc
Min /+
mus var overførbart til infisert mus ved intraperitoneal injeksjon av mesenteriske lymfeknute (MLN) celler alene fra
H. hepaticus
-infected mutante mus. Overføringen av neoplasi ble forebygges ved forutgående nøytralisering av inflammasjon ved anvendelse av anti-TNF-antistoff α i infiserte MLN donor-mus. Samlet utgjør disse dataene bekrefter at systemisk betennelse utløst av GI kanalen bakterier spiller en sentral rolle i tumordannelse av prostatakjertelen
Citation. Poutahidis T, Cappelle K, Levkovich T, Lee CW, Doulberis M, Ge Z , et al. (2013) Patogene tarmbakterier Forbedre Prostate Cancer Development via systemisk aktivering av immunceller i mus. PLoS ONE åtte (8): e73933. doi: 10,1371 /journal.pone.0073933
Redaktør: Deyu Fang, Northwestern University Feinberg School of Medicine, USA
mottatt: 15 april 2013; Godkjent: 24 juli 2013; Publisert: 26 august 2013
Copyright: © 2013 Poutahidis et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av RO1CA108854 (SE) og en CEHS pilotprosjekt pris P30-ES002109 (SE). CEHS (Senter for Environmental Health Sciences) er et senter stipend tildelt MIT ved NIH-NIEHS (National Institute of Environmental Health Sciences). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Bare en liten andel av dysplastisk og tidlige neoplastiske lesjoner som oppstår i epitel i hele kroppen faktisk avansere til kreft [1-3]. Kreft som skjer når celler med malignt potensial oppnå alle stimuli som trengs for deres genetiske og epigenetisk evolusjon til malignitet [4]. Det er nå vel dokumentert at for mange typer kreft en viktig bidragsyter er celler og faktorer i immunsystemet [4-6]. I prostatakjertelen, flere linjer med bevis tyder på at kronisk betennelse driver prostatakreft prosessen [5,7,8] den, men dens kilde forblir unnvikende. Smittestoffer, kjemisk eller fysisk epitelial celleskade, hormonelle ubalanser og kostholdsfaktorer er foreslått som de mest sannsynlige årsakene til kronisk betennelse i prostata [8-10].
For å avgjøre om prostata kreft kan forebygges ved å målrette underliggende betennelse har særlig betydning siden det er en ledende årsak til kreft-relaterte uførhet og død blant menn. I det gastrointestinale (GI), infeksjoner med patogene mikrober, som for eksempel med
Helicobacter pylori
, fører til kronisk inflammasjon (gastritt) og kreft (gastrisk adenokarsinom) hos mennesker og hos mus [4]. På samme måte hos immunsupprimerte mus modeller relatert nedre tarmbakterien
Helicobacter hepaticus product: (
H. Hepaticus
) utløser inflammatorisk tarmsykdom (IBD) og tykktarmskreft (CRC) [11-13]. I prostatakjertelen, men noen dyremodeller eksisterer for å teste mulige direkte eller indirekte rolle patogene mikrober i prostata kreft [8,10,14].
Hos mennesket er adenomatosis polypose coli (APC) genet er en kritisk tumor suppressor gen som hindrer malignitet av prostata og annet vev [15]. Her bruker vi mutant mus som mangler en kopi av
Apc
genet (
Apc
Min /+
mus) og utstillingsfeilregulering av β-catenin og Wnt signalveien, og er ellers mye brukt som en modell av intestinal adenomer [16].
Apc
Min /+
mus spontant utvikler prostata intraepitelial neoplasi (PIN) og mikroinvasiv karsinom (mikroinvasiv CA) med økende alder, etterligne de første stadiene av prostatakreft sett hos mennesker i deres femte eller sjette tiår av livet [15,17]. Vi viser at orogastric dosering med
H. hepaticus
, et ikke-colitigenic for denne musemodell bakteriell tarm kolonisator [17], øker prostata kreft betraktelig. Viktigere, utvikling av prostatakreft var overførbart til friske dyr utelukkende ved overføring av mesenteriske lymfeknuteceller fra
H. hepaticus
-infected
Apc
Min /+
giver mus.
Resultater
Orogastric infeksjon med
Helicobacter hepaticus
øker risikoen for prostata kreft i mannlige
Apc
Min /+
mus
for å fastslå effekten av tarminfeksjon, vi brukte
Apc
Min /+
mus som var kreftfrie (ung mus i en alder av 12 uker hadde ingen prostata carcinoma eller tarmpolypper) [17]. Mus ble oralt dosert med
H. hepaticus
eller gikk humbug dosering med media på seks ukers alder. Ved 12 ukers alder,
Apc
Min /+
mus infisert med
H. hepaticus
vises funksjonene i prostata kreft i samsvar med det som ble observert i menneskelige hanner (figur 1A, 1B, Tabell S1).
H. hepaticus
-infected
Apc
Min /+
mus oppviste økt PIN (p 0,01) og microadenoCA (p 0,01) sammenlignet med sham-dosert matchet infisert kontroll
Apc
Min /+
mus (figur 1C og S1). Verken
H. hepaticus
-infected eller infisert 12 uker gammel
wt
mus viste betydelig prostata patologi. Sammen viser disse resultatene at infeksjon i mage-tarmkanalen med
H. hepaticus
raskt forbedrer prostata kreftutvikling hos genetisk disponerte mus.
A) I en alder av 12 uker,
Apc
Min /+
mus spontant utvikler fokale lav og høy klasse prostata intraepitelial neoplasi (LGPIN, hvit pil-head, HGPIN, svart pil-hode), men bare sjelden mikroinvasiv karsinom (a). Aged-matchet
Apc
Min /+
mus med
H
.
hepaticus
, utvikle betydelig mer PIN og microinvasiveCA lesjoner (stjerne) kjennetegnes av svært atypisk prostatakjertelen epitelceller som bryter gjennom basal lamina og infiltrere den tilstøtende stroma (b). Når mesenteriske lymfeknuteceller fra
H
.
hepaticus
-infected
Apc
Min /+
mus blir overført inn i bukhulen av
H
.
hepaticus
-fri
Apc
Min /+
mus mottaker mus utvikler preneoplastiske og tidlige neoplastiske lesjoner (microinvasiveCA-stjerne) sammenlignes med de som finnes i giver mus (c). Tappe TNF-α fra
H
.
hepaticus
-infected
Apc
Min /+
mus bringer prostata neoplastiske lesjoner (LGPIN, hvit pil-hode) forekomsten til nivået av
H
.
hepaticus
-fri mus (D). Hematoxylin og eosin. Barer = 50 mikrometer. B) Aberrant β-catenin og laminin farging mønster i microinvasiveCA lesjoner i prostatakreft. DLP fra
WT H
.
hepaticus-
positive mus (a og c),
H
.
hepaticus
-infected
Apc
Min /+
mus (b) og
H
.
hepaticus
-fri
Apc
Min /+
mus overført med mesenteriske lymfeknute celler fra
H
.
hepaticus
-infected
Apc
Min /+
donor (d). Normale DLP kjertler hadde en normal β-catenin lateral epitelial cellemembran fargemønster (a) og en intakt basal lamina (c). I motsetning til dette ble microinvasiveCA lesjoner karakterisert ved cytoplasmisk og kjerne (pilespisser) stabilisering av β-catenin (b) og fravær av laminin (asterisk) som tyder på basalmembranen nedbrytning i ondartet epitelceller foci av begynnende invasjon. Hematoxylin counterstain, DAB kromogen. Barer = 25 mikrometer. C) Bar graf som viser hyppigheten av PIN og microinvasiveCA i behandlingsgruppene. Den mest signifikant forhøyet prostatakreft forekomst er merket med stjerne. Standard feilfelt tilsvarer microinvasiveCA statistiske sammenligninger. D) DLP av
H
.
hepaticus
-fri
Apc
Min /+
mus overført med MLN celler fra en
H
.
hepaticus
-infected
Apc
Min /+
donor, HGPIN. De fleste myeloide forløper celler med ringformede kjerner bosatt i stroma har typisk granulocytic avstamning fenotype (svart pil-hode) mens færre synes å være myelo /monocytic i type (hvit pil-hode). Bar = 16 mikrometer.
Økning av inflammatoriske cytokiner skje uten åpenbar inflammatorisk sykdom i
H. hepaticus
-infected
Apc
Min /+
mus
Vi neste testet om
H. hepaticus
infeksjon fører til økt betennelsesreaksjoner som tidligere vist [13]. Vi fant ut at
H. hepaticus
-infected
Apc
Min /+
mus oppviste økt systemisk proinflammatoriske cytokiner inkludert tumornekrosefaktor (TNF) -α (p = 0,013), IL- 1α (p = 0,024), IL-3 (p = 0,0009) og eotaxin (p = 0,003) (figur 2A til venstre). Interessant, prostata fra
H hepaticus
-infected
Apc
Min /+
mus manglet åpenbar inflammatorisk sykdom, men viste en og annen mastceller, nøytrofile, og også myeloid forløper celler som bærer ringformede kjerner [18] (figur 1D).
A) Serum nivåer av proinflammatoriske cytokiner ble økt i
Apc
Min /+
mus etter
H
.
hepaticus
infeksjon. Eotaxin, IL-3, TNF-α og IL-1α ble signifikant forhøyet sammenlignet med alderstilpassede friske
Apc
Min /+
kontroller. Sammenlignet med
H
.
hepaticus
smittet
wt
mus, infisert
Apc
Min /+
mus hadde signifikant høyere IL-17, IL-1α, IL -3, eotaksin og IL-9-konsentrasjonen i deres blodserum. Bio-Plex cytokin analysen brukt sera av
n
= 5 mus per gruppe. *** P 0,001; * P 0,05. B) Paracortical områder i mesenteriale lymfeknuter.
H
.
hepaticus
smittet
Apc
Min /+
mus med høy risiko for prostatakreft hadde store mengder cytoplasma og ekstracellulære IL-17 som betydelig redusert etter uttømming av TNF-α. IL-17-spesifikke immunhistokjemi; Hematoxylin counterstain, DAB kromogen. Barer = 25 mikrometer. C) Morfometrisk vurdering av IL-17 i immunohistochemically farget deler av mesenteriale lymfeknuter. Begge
Apc
Min /+
genetiske status og tarminfeksjon av
H
.
hepaticus
betydelig korrelerer med en TNF-α-mediert økning av IL-17 uttrykk i mesenteric lymfeknuter. *** P 0,001; ** P 0,01; * P. 0,05
Nøytralisering av betennelse hemmer
H. hepaticus
indusert prostata carcinoma in male
Apc
Min /+
mus
Pro-inflammatoriske cytokin TNF-α ble funnet å være forhøyet (p = 0,013) i sera etter
H. hepaticus
infeksjon i seks uker i tre måneder gammel mann
Apc
Min /+
mus (Figur 2A). TNF-α er på toppen av en kaskade av kreftfremkallende pro-inflammatoriske hendelser [5]. For å teste om betennelse er nødvendig for GI kanalen bakterier-utløst prostata patologi, utførte vi systemisk nøytralisering av TNF-α ved hjelp av intraperitoneal injeksjon av anti-TNF-α-antistoff i 3 uker varighet som starter på 3 uker etter infeksjon (PI). Vi fant ut at anti-TNF-α behandling førte til betydelig mindre (p 0,01) prostata patologi i
H. hepaticus
-infected
Apc
Min /+
mus (Figur 1A, 1C og S1, Tabell S1). Tatt sammen med tidligere data, dette indikerte at
H. hepaticus
-triggered vert betennelsesreaksjoner forbedrede antineoplastiske virkninger i prostatavevet.
inflammatoriske cytokiner ble forhøyet i
H. hepaticus
-infected
Apc
Min /+
mus, men ikke i
H. hepaticus
-infected
wt
kull mus
En funksjon av denne musen modellen er at
H. hepaticus
-infected
Apc
Min /+
mus viste signifikant økt høygradig PIN (HGPIN) og prostata kreft; men matchet
H. hepaticus
-infected
wt
kull mus klarer å utvikle betydelige PIN eller karsinom lesjoner (figur 1B, 1C og S1, Tabell S1). Ved analyse av serum cytokin nivåer, oppdaget vi signifikante forskjeller i proteinnivå IL-1α (p = 0,02) og IL-17 (p = 0,0005) mellom
Apc
Min /+
og
wt
kull mus (figur 2A høyre). Likeledes
in situ
merking av IL-17 viste økt IL-17 + uttrykk nivåer i MLN i
H. hepaticus
-infected
Apc
Min /+
mus, men ikke i
H. hepaticus
-infected
wt
kontroller (figur 2B og 2C). Behandling av
H. hepaticus
-infected
Apc
Min /+
mus med anti-TNF-a antistoff betydelig redusert mRNA genekspresjon (p 0,01) og protein (p 0,001) nivåer av IL-17A i MLN (figur 2B og 2C). Til sammen reist disse akkumulerte data muligheten for at systemiske forskjeller som stammer fra bakterier-utløst betennelse i mage-tarmkanalen opprinnelse kan bidra til kreftfremkallende prosesser i fjerne vev som prostata.
prostata kreftrisiko er overførbart til uinfiserte mottakere ved hjelp av mesenteric lymfeknute (MLN) celler fra
H. hepaticus
-infected
Apc
Min /+
mus
Å vite at mage-tarmkanalen opprinnelse betennelsesreaksjon er nødvendig for prostatakreft i vår modell, vi en hypotese om at cellene i tarmassosiert lymfeknuter (MLN) kan være avgjørende i prostatakreft i denne modellen. For å teste denne hypotesen, benyttet vi celle overføring av MLN oppsamlet fra
H. hepaticus
-infected eller humbug-dosert donor
Apc
Min /+
eller
wt
kull mus (figur 3). For dette eksperimentet, alle mottaker dyrene var
Helicobacter
sp
-fri male
Apc
Min /+
eller
vekt
kullsøsken. Hannmus av alder 6-8 uker gikk ip injeksjon av 5×10
6 enkelt celle suspensjon i HBSS per mus av celler hentet fra mesenteriets lymfeknuter av
H. hepaticus
-infected eller humbug-dosert
Apc
Min /+
eller
vekt
mus.
Skjematisk illustrasjon av MLN celler overføring eksperimenter designet for å teste hypotesen om at lokale gI veisimmunnettverkshendelser føre til systematiske immun ubalanser som avgjør skjebnen til preneoplastiske lesjoner i topografisk fjerne epithelia slik som de av prostatakjertelen. Trials brukt 6 mus per gruppe. Forsøkene ble gjort i duplikat
Derfor fant vi betydelig økt lav (p 0,05). Og høy klasse (p 0,01) PIN i infisert
Apc
Min /+
mus som bare hadde fått MLN celler fra
H. hepaticus
-infected
Apc
Min /+
mus (Figur 1A, B, C og S1) ved 6 uker etter ip injeksjon, sammenlignet med MLN donorceller fra humbug-dosert
Apc
Min /+
mus. Disse ikke-infiserte
Apc
Min /+ Hotell som fikk celler fra
H. hepaticus
-infected
Apc
Min /+
vises funksjonene preneoplasia og karsinom i samsvar med det som ble observert i
H. hepaticus
-infected
Apc
Min /+
mus (figur 1A), og ligner de man ser i menneskelige hanner. I tillegg uinfiserte
wt
mottaker mus som fikk lymfeknuteceller fra
H. hepaticus
-infected
Apc
Min /+
donor mus også hadde økt LGPIN (p 0,001), HGPIN (p 0,001) og adenokarsinom (p 0,001) (figur 1C og S1, Tabell S1) sammenlignet med friske wT mus som fikk lymfeknuteceller fra
H. hepaticus
-fri
Apc
Min /+
giver mus viser at genetisk predisposisjon for prostata epitel ikke var spesielt nødvendig for kreftfremkallende effekten av
H. hepaticus
infeksjon. Denne overførbarhet funksjonen viste at
H. hepaticus
-aktiverte celler var tilstrekkelig for neoplastiske prosesser i ekstra-intestinale kjertler som prostata.
Nøytralisering av betennelse hindrer MLN celle smitte av prostatakreft risiko for infisert mus
Til slutt, vi testet om nøytraliserende betennelse var tilstrekkelig til å hemme MLN-celle mediert overføringen av prostatakreft i denne musemodellen. Vi utnyttet celle overføring av MLN hentet fra
H. hepaticus
-infected
Apc
Min /+
mus som var blitt behandlet med anti-TNF-a antistoff i 3 uker (figur 3). For dette eksperimentet, alle mottaker dyrene var
Helicobacter
sp
-fri male
Apc
Min /+
eller
vekt
littermate dyr. Hannmus av alder 6-8 uker gikk ip injeksjon av 5×10
6 enkelt celle suspensjon i HBSS per mus av celler hentet fra mesenteriets lymfeknuter av
H. hepaticus
-infected
Apc
Min /+
mus. Som spådd, fant vi ingen signifikante forskjeller mellom infisert
Apc
Min /+
mus vs infisert
Apc
Min /+
mus som hadde mottatt fra MLN anti-TNF-a-behandlede mus (p 0,05). Likeledes var det betydelig mindre LGPIN (p 0,01) og HGPIN (p 0,05) i infisert
Apc
Min /+
mottakere av MLN fra anti-TNF-behandlet
H. hepaticus
-infected mus sammenlignet med
Apc
Min /+
mottaker mus av MLN fra
H. hepaticus
-infected
Apc
Min /+
mus (figur 1C og S1, Tabell S1). Disse dataene indikerer at den pro-inflammatorisk rolle MLN cellene er den underliggende årsaken til den observerte prostatakreft risiko smitte.
Diskusjoner
I denne studien, tester vi unge mannlige
apc
Min /+
mus på en C57BL /6J bakgrunn som en eksperimentell modell for å sondere sammenslutninger av betennelse med kreftutvikling i prostata. Som med mennesker der prostatakreft risiko har en sterk genetisk komponent,
Apc
Min /+
mutant mus er genetisk disponert for å epitel neoplasi [13,16,17]. Vi og andre har vist i det siste at
Apc
Min /+
mus også gradvis utvikle prostatakreft på grunnlag av økte PIN lesjoner matching som sett i menneskets menn [15, 17]. I våre studier,
Apc
Min /+
mus utvikler tidlige neoplastiske lesjoner i dorsolateral prostata så tidlig som ved 3 måneders alder foregående tydelig intestinal polypper. På alders = 6 måneder, 40% av
Apc
Min /+
mus utvikler mikroinvasiv adenokarsinom mens 10-20% har også mer avanserte prostata kreft lesjoner [15]. Dette aspektet gir
Apc
Min /+
mus verktøyet som en modell for å undersøke utviklingen av pre-neoplastiske og tidlige neoplastiske lesjoner i den menneskelige prostata [1-3].
Et viktig funn i denne studien er at infeksjon med
H. hepaticus
, en bakterie som koloniserer hovedsakelig tykktarmen av C57BL /6
ApcMin
/
+
mus uten åpenbar typhlocolitis [13,19- 21], betydelig økt forekomst av PIN og mikroinvasiv adenokarsinom lesjoner i prostata. Som forventet, 3 måneder gammel
Apc
Min /+
mus infisert med
H. hepaticus
hadde verken overt IBD eller store adenomatøse polypper ennå dannet i deres innvoller (data ikke vist). Men selv på denne ung alder, disse mus gjorde oppviser øket systemisk pro-inflammatoriske cytokiner, slik som TNF-α, IL-1α, IL-3, eotaksin og IL-9, sammenlignet med sine ikke-infiserte kontroll motstykker, som tyder på immunsystemet aktivering. Disse data tatt sammen med tidligere bevis på at
H. hepaticus
infeksjon er i stand til å modulere tumorigenesis på ekstra-intestinale nettsteder [21,22], tyder på at klinisk stille GI veisimmunnettverkshendelser utløst av gut microbiota kan føre til systematiske immun ubalanser. I sin tur, kan disse ubalansene påvirke skjebnen til preneoplastiske lesjoner i topografisk fjerne epithelia slik som de av prostatakjertelen.
De beslektede roller forhøyet proinflammatoriske cytokin miljø og inflammatorisk celle komponent som finnes i prostata kreft utsatt
H. hepaticus
-infected
Apc
Min /+
mus er interessant. Innenfor prostata, PIN og mikroinvasiv adenokarsinom omtalt mastceller, nøytrofile og myeloide forløper celler som bærer ringformede kjerner. TNF-α ble tidligere påvist avgjørende i mastcelle rekruttering og tumorigenesis i
Apc
Min /+
mus [13,17,23]. Frigjøringen av faktorer, inkludert TNF-α og forskjellige proteaser fra mastceller som oppholder seg i prostata stroma kan ha en viktig rolle i tumorgenese [10].
TNF-α og IL-1α er sammen innblandet i et NF -κB-mediert signal kaskade som hemmet apoptose og økt spredning av epitelceller i human prostata preneoplasia og kreft [24]. I tillegg fremmer IL-1α unormal proliferasjon av humane prostata epitelceller gjennom insulin vekstfaktor og fibroblast vekstfaktor-7-relaterte vekstsignaler [25,26]. Eotaxin og IL-3 regulerer benmarg modning, slipp og vev smugling av myeloide forløperceller [27] slik som de sett i prostata kjertler av
H. hepaticus
-infected
Apc
Min /+
mus. Potensielle roller eotaxin, IL-3 og tilknyttede myeloide forløper celler i epitel kreft garanterer videre etterforskning. Den kraftige pro-inflammatorisk rollen til IL-9 er i økende verdsatt. Th9 celler utgjør det siste tilskuddet utvide T-hjelper subtype array. IL-9 stimulerer veksten av hematopoetiske celler, spesielt mastceller og sekresjonen av flere kjemokiner som rekrutterer ytterligere celler i betent vev [28]. Den viktige rollen IL-9 i autoimmunitet og allergi [28] kan gi viktige ledetråder, særlig i lys av nylige hypoteser som kobler prostata betennelse med kreft. Prostata epiteliale celleskade kan da føre til tap av toleranse for normale prostata- antigener og dermed føre til en selvforsterkende autoimmun reaksjon [10]. I den foreliggende undersøkelse, vårt funn at nøytralisering av TNF-α var tilstrekkelig til å motvirke prostata kreftrisiko forbedring i en musemodell tyder på at dette cytokin har en sentral rolle i å skape en pro-tumorigen systematisk inflammatoriske makro miljø som gjør utviklingen av kreft i prostatakjertelen.
en annen pro-inflammatorisk cytokin fant vi signifikant forhøyet ved å sammenligne
H. hepaticus
-infected
Apc
Min /+
mus med
H. hepaticus
-infected
wt
kull mus var Il-17A. De betydelige forskjeller i Il-17 var av spesiell interesse fordi vi tidligere har vist IL-17 + celler i mesenteriske lymfeknute (MLN) hos mus etter infeksjon med
H. hepaticus product: [20]. Likeledes har IL-17 vært innblandet i infeksjonsutløst tarmkreft utvikling i
Apc
Min /+
mus [29,30]. Korrelasjonen av
Apc
Min /+
mus genotype med systematisk og MLN forhøyede Il-17 uttrykk kan ha en genetisk basis, siden Il-17-assosiert underskudd i immunceller funksjon av denne musen modellen har blitt rapportert [30]. Viktigere, nyere bevis fra både preklinisk mus [31] og kliniske studier på mennesker støtte en betydelig rolle for Il-17 i prostata kreftutvikling [32,33].
Å gi eksperimentelle bevis for denne hypotesen og beholde komplekset immunologiske samspillet mellom de ulike cellepopulasjoner vi valgte å overføre forvaltnings MLN cellepopulasjoner i mus. Immunologiske aktiviteter innenfor systemisk lymfeknute vev [20] kan være av koblingen som forbinder GI mikrobiell flora med universelt pro-tumorigene systematiske endringer av immunsystemet. Overraskende, fant vi at økt prostata kreftrisiko er overførbart til infisert
Apc
Min /+
mottakere av MLN celler bare tatt fra
H. hepaticus
-infected
Apc
Min /+
givere. Det var ingen tegn på
H. hepaticus
organismer i prostatavevet av transplantasjonsmottaker mus ved hjelp av PCR eller ved å
in situ
undersøkelse ved hjelp av sølv flekk (data ikke vist), men translokasjon av
H. hepaticus
organismer eller deres antigener fra tarmen til lymfeknuter forbli en mulig medvirkende faktor. Våre funn som MLN celler hentet fra anti-TNFa-behandlet
H. hepaticus
-infected
Apc
Min /+
mistet prostatakreft fremme effekter gir bevis for at betennelse forbedret denne kreftfremkallende prosessen.
I konklusjonen, en mulig rolle for mikrober i prostata kreft har vært mistenkt [9] men forble uprøvd før nå. Her har vi vist at inntak av
H. hepaticus
alene forbedret prostata kreftutvikling i
Apc
Min /+
mus. Våre funn at betennelse forbedret denne kreftdannende prosess legger mekanistiske støtte til godt dokumenterte fordeler av ikke-steroide antiinflammatoriske midler (NSAIDs) i humane pasienter. Bemerkelsesverdig, infiserte mus som bare fikk lymfeknuteceller ble svært utsatt for prostatakreft. Denne observasjonen at prostata kreft er induserbar med destillert celler fra et annet organ kan forklare hvorfor etiopathogenesis av prostatakreft i mennesker har vært vanskelig å belyse. Det gjenstår å definitivt avgjort om andre GI veis mikrober hos mennesker, som for eksempel
H pylori
, kan ha en lignende effekt i prostata og andre ikke-gastrointestinale kreft i mennesker.
Materialer og Metoder
Forsøksdyr
Alle dyr ble huset og håndtert i Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC) -accredited anlegg med dietter, eksperimentelle metoder, og boliger som er spesielt godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee. MIT CAC (IACUC) spesielt godkjent studiene samt boliger og håndtering av disse dyrene.
Apc
Min /+
mus på en C57BL /6J bakgrunn ble opprinnelig hentet fra Jackson laboratorier og oppvokst i-huset for å gi
Apc
Min /+
mus og
hvete product: (
wt
) kullsøsken for eksperimentelle mottakere og givere.
Helicobacter
-fri status av musene ble bekreftet ved PCR ved hjelp av
Helicobacter
genus-spesifikke primere som tidligere beskrevet [20].
Experimental
Helicobacter hepaticus
infeksjon
totalt 44 eksperimentelle mus ble dosert ved 6 ukers alder med
H. hepaticus
(stamme 3b1, ATCC # 51449) og deretter plassert separat i en bio-containment område innenfor samme dyret anlegget.
H. hepaticus
ble dyrket under microaerobic forhold, forberedt, og bekreftet ren som beskrevet andre steder [11,20]. Eksperimentelle mus mottok 0,2 ml friskt podestoff ved gastrisk gavage annenhver dag i totalt tre doser. Cecum, mesenterisk lymfeknute (MLN), og prostata ble samlet 6 uker etter smitte ved obduksjon og analysert ved PCR for å bekrefte (tarm) eller utelate (MLN, prostata) kolonisering.
Eksperimentell design
totalt 96
Apc
Min /+
mus og 60 vekt mus ble inkludert i forskjellige behandlingsregimer eller som eksperimentelle kontroller. Forsøk ble utført ved bruk av to separate forsøk med 5-6 mus hver, som angitt i tabell S1. Sixty
Apc
Min /+
mus og 40 vekt mus 6 ukers alder ble injisert intraperitonealt med 5 x 10
6 MLN celler suspendert i HBSS. De celle donor mus var mannlige
H. hepaticus
-infected seks uker tidligere, eller
Helicobacter
-fri C57BL /6
wt
eller
Apc
Min /+
mus.
TNF-α nøytralisering
Det er totalt 24
H. hepaticus
smittet
Apc
Min /+
eller
wt
mus i en alder av 9 uker (starter på 3 uker etter
H. hepaticus
infeksjon) mottok anti-TNF-α antistoff (klon XT-3;. BioExpress, Lebanon, NH) ved 200 ug per mus tre ganger ukentlig i tre uker, som beskrevet tidligere [13]
Påvisning av systemisk cytokin proteinekspresjon
Serum cytokinnivåer av 5-6 dyr i hver forsøksgruppe ble analysert ved hjelp av Bioplex Pro Mouse cytokine assay-system (Bio-Rad, Hercules, CA) i henhold til produsentens protokoll. Kort sagt ble serumprøver fortynnet med prøvefortynningsmiddel kit, inkubert med antistoff-belagte kuler, etterfulgt av et sekundært antistoff inkubasjon og analysert i duplikat på en Bio-Plex 200 system (BioRad, Hercules, CA).
Histologisk evaluering og Immunohistokjemi
De formalinfiksert vev ble behandlet og parafin innebygd 5 um vev-seksjoner ble farget av H E, Warthin-Starry sølv beis eller IHC og evaluert for prostata lesjoner av veterinær patolog blindet å prøve identitet. De preneoplastiske og tidlige neoplastiske prostata lesjoner, oppdages basert på nyere konsensus rapportkriteriene [34], ble kvantitativt vurdert som tidligere beskrevet av Poutahidis et al (2009) [17].
Rabbit primære antistoffer som brukes for immunhistokjemi inkludert anti -β-catenin (Thermo Fisher Scientific /Lab Vision, Fremont, CA), anti-laminin (Thermo Fisher Scientific /Lab Vision, Fremont, CA) og anti-IL17 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, California). Antigener ble hentet med Protease 1 (Roche Diagnostics /Ventana Medical Systems, Tucson, AZ) for laminin gjenkjenning. Heat-indusert antigen henting ble utført med citratbuffer pH 6 for β-catenin eller med EDTA buffer pH 8 for IL17 deteksjon. Primært antistoff-binding ble påvist med geite-anti-kanin HRP Zytochem Plus Polymer (Zytomed Systems, Berlin, Tyskland). Signal ble påvist med diaminobenzidin (Invitrogen, Camarillo, CA) og vevene ble motfarget med hematoksylin.
For kvantifisering av IL-17-ekspresjon i MLN, tretti 40x høy effekt feltbilder av IHC-fargede seksjoner ble tatt per behandlingsgruppen. Ti bilder fra hver gruppe ble tilfeldig valgt for teller. Automatisk beregning av antallet av bildeelementer som tilsvarer IL-17 i bildene dukket opp i et histogram etter behandlingen hvert bilde med terskel farge plug-in av den ImageJ bildebehandling og analyseprogram (NIH, Bethesda, MD). Morfometriske tellinger ble registrert som antall IHC merket piksler per bilde.
Statistiske analyser
Utbredelsen av LGPIN, HGPIN og mikro-adenoCa mellom grupper ble sammenlignet med Kruskal-Wallis enveis ANOVA og Dunns post-test. Direkte sammenligninger ble gjort ved hjelp av Mann-Whitney U test. Serum cytokin dataanalyse ble utført ved hjelp av to-tailed t-test.
