Abstract
Mål
Lungekreft er fortsatt nummer én årsak til kreft dødsfall på verdensbasis. Cellesyklus deregulering spiller en viktig rolle i patogenesen av ikke-småcellet lungekreft (NSCLC). CDC25A representerer en kritisk cellesyklusregulator som forbedrer cellesyklusprogresjon. I denne studien ønsket vi å undersøke hvilken rolle en roman CDC25A transkripsjonen variant, CDC25A
Q110del, på regulering av CDC25A protein, og dens innvirkning på prognose fra NSCLC pasienter.
Metodikk /hovedfunnene
Her rapporterer vi en roman CDC25A transkripsjon variant med kodon 110 (Glutamin) sletting, som vi kalte CDC25A
Q110del i NSCLC celler. I 9 (75%) av de 12 NSCLC cellelinjer, sto CDC25A
Q110del uttrykk for mer enn 20% av CDC25A transkripsjoner. Biologiske effekter av CDC25A
Q110del ble undersøkt i H1299 og HEK-293F celler ved hjelp av UV-stråling, flowcytometri, cykloheksamid behandling, og konfokalmikroskopi. Sammenlignet med CDC25A
vekt, CDC25A
Q110del protein hatt lenger halveringstid; celler som uttrykker CDC25A
Q110del var mer motstandsdyktig mot UV-stråling og viste mer mitotisk aktivitet. Taqman-PCR ble brukt til å kvantifisere CDC25A
Q110del uttrykk nivåer i 88 primær NSCLC kreft /normal vev par. Hos pasienter med NSCLC, Kaplan Meier-kurver viste svulster som uttrykker høyere nivåer av CDC25A
Q110del forhold til de tilstøtende lunge vev å ha betydelig dårligere total overlevelse (
P
= 0,0018).
betydning
Her identifiseres vi CDC25A
Q110del som en roman transcriptional variant av CDC25A i NSCLC. Sekvensen spesifikke natur abnormitet kan være en prognostisk indikator i NSCLC pasienter, samt en kandidat mål for fremtidige terapeutiske strategier
Citation. Younis RH, Cao W, Lin R, Xia R, Liu Z, Edelman MJ, et al. (2012) CDC25A
Q110del: A Novel Celledeling Cycle 25A isoform abnormt Uttrykt i ikke-småcellet lungekreft. PLoS ONE 7 (10): e46464. doi: 10,1371 /journal.pone.0046464
Redaktør: Sumitra Deb, Virginia Commonwealth University, USA
mottatt: 11 juni 2012; Godkjent: 30 august 2012; Publisert: 05.10.2012
Copyright: © Younis DDS, MDS, PhD, et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Arbeidet ble støttet delvis av NIH tilskudd R01 CA126818 og R01 CA136635. Den Funder hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. Ingen ekstra ekstern finansiering ble mottatt for denne studien
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft er fortsatt den ledende årsak til kreft. -relaterte dødsfall på verdensbasis til tross for fremskritt i terapeutiske metoder [1]. Ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) er den vanligste typen lungekreft og er et resultat av akkumulerte molekylære endringer som fører til deregulering av flere cellulære prosesser, inkludert cellesykluskontroll [2]. I NSCLC er flere cellesyklus regulatorer som spiller en avgjørende rolle i cellesyklus sjekkpunkt kontroller endret, noe som gjør at kreftceller omgå forskjellige sjekkpunkter, spesielt på G1 /S og G2 /M med påfølgende ukontrollert celleformering [3] – [ ,,,0],7].
Celledeling syklus 25A (CDC25A) er et medlem av CDC25 familien av to spesifikke fosfataser og spiller en avgjørende rolle i cellesyklusprogresjon [8], [9]. CDC25A funksjoner for å fjerne de inhiberende fosfater fra treonin og tyrosin-rester i det ATP-bindende områder av CDK, fremmer cellesyklusprogresjon [10], [11]. CDC25A er også et nedstrøms mål for Chk1-mediert sjekkpunkt vei: aktivering av Chk1 av DNA skadelige forhold mål CDC25A for proteasome degradering, som hindrer cellene med kromosomavvik fra framdrift gjennom cellesyklusen [10], [12], [13]. Mens CDK1 spiller en avgjørende rolle for CDC25A stabilisering under mitose [8], [10], [11]. CDC25A ofte overuttrykt i kreft inkludert NSCLC. Dette overekspresjon er forbundet med en mer aggressiv klinisk oppførsel og dårligere overlevelsen [7], [8], [12] – [19]. Selv CDC25A er blitt grundig undersøkt for sin rolle i tumorprogresjon og som et potensielt mål for behandling av kreft, mekanismer for CDC25A overekspresjon i kreft, gjenstår å undersøkes [12]. Noen studier har vist at overekspresjon av CDC25A i kreft kan skyldes post-transkripsjonelle dereguleringer [20], for eksempel overekspresjon av DUB3 ubiquitin hydrolase [21], inaktivering av glykogen-syntase-kinase-3beta (GSK-3P) som fosforylerer CDC25A å fremme dens proteolyse i tidlige cellesyklusfaser [22], aktivering av LIN28A som regulerer CDC25A uttrykk ved å hemme biogenesis av la-7 miRNA [23], og mikroRNA-21 som negativt regulerer CDC25A, slik at dens under uttrykk resultater i CDC25A overekspresjon i tykktarm kreft [24].
Her er vi rapportere identifisering av en roman, alternativt skjøtes CDC25A isoform som resulterte i sletting av kodon 110 betegnes CDC25A
Q110del. Vi viser at CDC25A
Q110del blir uttrykt ved høye nivåer i 75% av NSCLC-cellelinjer. CDC25A
Q110del protein hadde høyere stabilitet og mer kjernekraft distribusjon. Celler som uttrykker høyt nivå av CDC25A
Q110del var mer resistente overfor UV-bestråling. Hos pasienter med NSCLC, ble høyere CDC25A
Q110del nivåer i svulstene assosiert med dårlig klinisk utfall. Våre data tyder på at CDC25A
Q110del uttrykk er vanlig i NSCLC og kan spille en rolle i lunge tumorigenesis og kreft progresjon.
Materialer og metoder
Cellelinjer
HEK293 og NSCLC-celler ble erholdt fra ATCC (Manassas, VA), og holdt i DMEM – 5% føtalt bovint serum. Udødeliggjort menneskelige bronkial epiteliale cellelinjer (HBEC), HBEC2, HBEC3, HBEC4 og HBEC5 (gave fra dr. John Minna og Jerry Shay ved University of Texas Southwestern Medical Center, Dallas, Texas) [25], ble opprettholdt i keratinocyte serum- frie (KSF) medium med rekombinant human epidermal vekstfaktor (rEGF) og bovint hypofyse-ekstrakt (Invitrogen, Carlsbad, CA). Plasmid transfeksjon ble utført ved anvendelse av lipofektamin 2000 (Invitrogen).
Western-blotting
Cellene ble høstet i RIPA-buffer med protease inhibitor (Roche Bioscience), og separert ved SDS-PAGE. Primære antistoffer mot CDC25A (klonene 144 og F-6), cdc2 p34 (H-297), Chk1, GAPDH (Santa Cruz Biotechnology, California), fosfo-Chk1 (Ser345) (Cell Signaling Biotechnology, Danvers, MA), fosfo CDK1 (Tyr15) (Calbiochem EMD kjemikalier Inc, Gibbstown, NJ) ble brukt. NE-PER protein utvinning kit (Pierce Biotech, Rockford, IL) ble brukt for å fraksjonere cytosolic og nukleære proteiner. Cykloheksamid (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) ble rekonstituert i DMSO.
RNA ekstraksjon, revers transkripsjon og real-time PCR
Total RNA ble ekstrahert ved hjelp TRIzol reagent, og konvertert til cDNA ved hjelp av Super III First-Strand Synthesis kit (Invitrogen). Full lengde CDC25A cDNA ble forsterket ved hjelp iProof Høy Fidelity DNA polymerase (Bio-Rad, Hercules, CA), og klonet inn pEF6 /V5 Hans (Invitrogen, Carlsbad, California) eller pEGFP-N1 (Clontech laboratorier, CA) for standardisering real Time PCR reaksjoner, UV stråling, CHX behandlinger, sekvens analyse og restriksjonsenzym fordøyelse, pEGFP-N1 smeltet til EGFP eller m-Cherry ble brukt for bildebehandling og flowcytometri analyse eller der det er angitt Alle DNA-manipulasjoner ble utført i biosikkerhet nivå 1 eller 2 laboratorier.
For å kvantifisere den totale CDC25A avskrift, real-time PCR-analyse ble satt sammen ved å bruke termin primer 5′-GCTCCTCCGAGTCAACAGAT -3 «, reverse primer 5’TGGACTACATCCCAACAGCTT-3», og FAM ™ dye-merket probe 5 «-ATTCTCCTGGGCCATTGGACA-3′; å kvantifisere villtype CDC25A transkript ble analysen satt sammen ved hjelp av forover primer 5»–GCTCCTCCGAGTCAACAGAT -3 «, revers primer 5′-ACTACATCCCAACAGCTTCTG- 3′ og FAM ™ fargestoff-merket probe 5»-ATTCTCCTGGGCCATTGGACA-3 «. Analysen ble kjørt i tre eksemplarer med TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems, Carlsbad, California) i Applied Biosystems 7900HT Fast Real Time PCR system. I alle reaksjoner, ble GAPDH Fast TaqMan analysen VIC dye-merket probe lagt til som RNA lasting kontroll.
Når det totale uttrykket av CDC25A er utpekt som den endogene referansen genet, overflod av CDC25A
Q110del kan være beregnes som ΔCt = Ct
wt-Ct
tot. Derfor er den relative overflod av CDC25
vekt i sammenkoblet tumor mot normalt vev beregnet av 2
-ΔΔCt metode, hvor ΔΔCt = ΔctTumor- ΔctNormal (User Bulletin # 2 Applied Biosystems). Hvis uttrykket nivåer av CDC25A
Q110del og CDC25
wt er likeverdige i den tilsvarende tumor og den tilstøtende normalt lungevev, den beregnede relative overflod verdi vil være 1. En verdi mindre enn 1 indikerer at tumoren uttrykker et høyere nivå av CDC25A
Q110del enn paret normalt lungevev. Motsatt vil en verdi . Indikerer en at den normale lungevev uttrykker et høyere nivå av CDC25A
Q110del enn den sammenkoblede svulst
Sekvensanalyse og restriksjonsenzymdigestion
DNA-kloner ble sekvensert på University of Maryland Baltimore sekvense anlegget eller Genewiz Inc., (South Plainfield, NJ). Justering ble utført mot CDC25A henvisning NM_001789. CDNA-klonene brukes for funksjonelle analyser ble amplifisert fra NSCLC-cellelinjer (tabell S1). For enzymatisk fordøyelse analyse ble et 292 bp fragment av CDC25A cDNA amplifisert ved anvendelse av primere: 5′-sende CACTGGAGGTGAAGAACAACAG-3 «og 5′-revers CAGCCACGAGATACAGGTCTTA-3», spaltet med restriksjonsendonuklease Bpu10I (New England Biolabs, Ipswich, MA) deretter separert på agarosegel.
UV-bestråling
for UV-behandling av dyrkede celler, ble mediet fjernet, cellene ble vasket to ganger med fosfat-bufret saltvann, og deretter bestrålt i udekkede vevskulturskåler med 254 nm UV-lys (UVC) i Stratalinker UV Kryssbindings (Stratagene, La Jolla, CA). Frisk dyrkingsmedium ble lagt tilbake, og cellene ble videre inkubert i de beskrevne tidspunkter.
Cell syklus analyse
Cellene ble høstet, fiksert i 70% etanol, suspendert i PI /RNase farging Buffer (BD Pharmingen ™, San Jose, CA) inneholdende 0,1% natriumsitrat og 0,1% Triton X-100. Dataanalyse ble gjort i University of Maryland Baltimore Medical Center, flowcytometri Core og analysert med FlowJo programvare.
Imaging analyse
Celler som uttrykker CDC25A
vekt eller CDC25A
Q110del- smeltet sammen med mCherry eller EGFP ble løst i 2% paraformaldehyde, permeabilized med 0,5% tritonX-100, farget med DAPI. Bildene ble tatt med en Zeiss LSM 510 Meta Laserskanning konfokalmikroskop med DAPI, FITC og rhodamin fiters. Histogrammet representant for FITC og rhodamine uttrykk ble produsert ved hjelp av
bilde J
programvare.
Celleviabilitet analysen
Celleviabilitet ble målt ved hjelp av Cell Proliferation Reagens WST-1 ( Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN).
Pasienter og vev
Primær NSCLC tumorer og deres tilsvarende ikke-ondartede tilstøtende lunge vev fra 88 personer med patologisk stadium jeg å IIIa NSCLC ble evaluert. Alle pasientene ble behandlet med kirurgi alene unntatt de med stadium IIIa sykdom som kanskje også hadde fått postoperativ strålebehandling og adjuvant kjemoterapi, ved University of Texas MD Anderson Cancer Center (MDACC) fra 1995 til 2000. Prøvene ble umiddelbart frosset og lagret ved -80 ° C. Valget av disse pasientene var basert på tilgjengeligheten av arkivert frisk svulst og tilsvarende normale lungevev for etterforskerne. Klinisk informasjon og oppfølging informasjon for studien var basert på diagram gjennomgang og skjema rapporter fra MDACC svulst registret service. Informert samtykke til bruk av rest resected vev for forskning ble innhentet fra alle pasienter inkludert i studien.
Etikk uttalelse
Skriftlig informert samtykke til bruk av rest resected vev for forskning ble innhentet fra alle pasienter inkludert i studien. Samtykket prosedyre og bruk av disse materiale og klinisk informasjon ble gjennomgått og godkjent av University of Texas MDACC overvåking komiteen.
Statistisk analyse
Student
t
-test ble brukt for statistisk analyse av de funksjonelle analyser. Survival analyse Kaplan Meier-kurver ble generert med log rank analyse utnytte Proc Lifetest i SAS 9.2. Alle testene er tosidige og P-verdier og lt; 0,05 regnes som statistisk signifikant
Resultater
Identifikasjon av CDC25A
Q110del i NSCLC
For å undersøke mulige endringer av. CDC25A på mRNA-nivå, sekvensert vi CDC25A cDNA-kloner avledet fra et panel av 10 NSCLC-cellelinjer. Blant totalt 16 cDNA-kloner fra de 10 cellelinjer, observerte vi en spesifikk trinukleotidet delesjon i 7 av de 16 kloner fra 5 av de 10 cellelinjer (Fig. 1A) (tabell S1). Slettingen finner på posisjoner 328-330 i henvisninger til NM_001789.2, CDC25A avskrift 1, som spår en glutamin sletting ved kodon 110 (Fig. 1B). Dette aminosyrerest ligger innenfor regelverkets domenet av CDC25A, og er konservert blant flere virveldyr (Fig. 1C og D). Vi kaller romanen CDC25A isoform med kodon 110 sletting som CDC25A
Q110del. Denne slettingen er sannsynligvis et resultat av alternativ RNA-spleising, siden ingen endring av genomisk DNA-sekvens ble funnet i NSCLC-cellelinjer (data ikke vist) (fig. 1E) For å bekrefte tilstedeværelsen av CDC25A
Q110del i NSCLC-cellelinjer og primære NSCLC tumorvev, undersøkte vi cDNA fra 4 NSCLC-cellelinjer og primære 5 NSCLC tumorvev ved hjelp av restriksjonsendonuklease spaltning ved Bpu10I, som kan spalter sekvensen 5′-CCTNAGC, et unikt område i CDC25A
Q110del sekvens, for å produsere en kortere spaltede DNA band. Alle prøvene viste kortere spaltede DNA-bånd ved forskjellige tettheter (fig. S1).
A. Nukleinsyresekvens av triplikat delesjon CDC25A-CAG (328-30) i NSCLC-cellelinjer. B. CDC25A-CAG (328-30) oversettes til Q110 sletting (CDC25A
Q110del). C. Aminosyre Q110 av CDC25A er evolusjonære konservert i andre organismer. D. Q110 ligger i den regulatoriske domene, nærmest CDK1 mitotisk stabilisering fosforylering nettsted (S116) og Chk1 degredation fosforylering hotellet (S124). Red: CAG (328-30) nukleinsyre sletting og tilsvarende aminosyre Q110, skygge: serin fosforyleringsseter (S116 og S124). E. Skjematisk illustrasjon av foreslått alternativ spleising nettstedet. Alternative donor området: en 5 «spleise (donor stedet), endring av 3» grensen av oppstrøms ekson, ville produsere CDC25A
wt avskrift, mens en alternativ akseptor stedet: en 3 «spleise (akseptor stedet) endre 5 «grensen av nedstrøms ekson, ville produsere CDC25A
Q110del karakterutskriften.
neste utviklet en real-time PCR-analyse (fig. 2A) for å vurdere mengden av CDC25A
Q110del blant de totale CDC25A transkripsjoner i NSCLC-cellelinjer og vevsprøver, for å demonstrere at analysen kan kvantitativt måle den relative overflod av CDC25A isoformer, konstruerte vi et Ct kurve ved anvendelse av renset plasmid-DNA inneholdende enten CDC25A
wt eller CDC25A
Q110del cDNA inn. Resultatet viste en nesten lineær sammenheng med forskjellige villtype og Q110del forhold (fig. 2B) .Dette fremgangsmåte ble deretter brukt til å asses CDC25A
Q110del ekspresjon i cellelinjer og vev. I løpet av 4 HBEC cellelinjer, CDC25A
Q110del ekspresjon var påvisbar, men på generelt mindre enn 20% av de totale CDC25A-transkripter (fig. 2C). Det bør bemerkes at disse cellelinjer ble avledet fra immortaliserte humane bronkiale epitelceller hos pasienter med lungekreft. Til sammenligning, 9 (75%) av de 12 NSCLC-cellelinjene uttrykte CDC25A
Q110del større enn 20% av de totale CDC25A transkripsjonene inkludert 3 (20%) av de cellelinjene uttrykte CDC25A
Q110del på nesten 50% nivå (fig. 2C). Forskjellen på CDC25A
Q110del uttrykk nivåer mellom HBEC cellelinjer og NSCLC cellelinjer var statistisk signifikant (
P
= 0,003). Interessant, H596 og H549 cellelinjer som viser CDC25A
Q110del på 50% av total CDC25A, har et høyt modal kromosomnummer på en høy prosentandel, NCI-H596 modal rekke = 71; range = 65 til 75.This er en nær triploid human cellelinje. Mens A549 er et hypotriploid human cellelinje med den modale kromosomantall på 66, som forekommer i 24% av cellene (i henhold til «American Type Culture Collection»). Dette tyder CDC25A
Q110del å spille en rolle i genomisk ustabilitet og kumulative maligne endringer [26]. En korrelasjon mellom CDC25A
Q110deland akkumulering av hyperploid celler er beskrevet nedenfor i cellesyklusfordeling.
A. Real-time PCR-analyse for å vurdere mengden av CDC25A
Q110del i forhold til de totale CDC25A transkripsjoner i NSCLC cellelinjer og vevsprøver, «Total» real time-PCR-analyse bestemmer total CDC25A mal i reaksjon (Ct
tot ) mens «vekt» real time-PCR-analyse bestemmer målet genet som er CDC25A
wt mal (Ct
wt), deretter beregne CDC25A
Q110del = ΔCt = (Ct
vekt- Ct
tot). B. Standard kurve som illustrerer Ct-verdiene som svarer til ulike prosenter av CDC25A
wt: CDC25A
Q110del, pEF6-V5-His-CDC25A
wt og pEF6-V5-His-CDC25A
Q110del ble innlemmet sammen på flere forhold som mal i hver Uniplex sanntid PCR reaksjon, kjøre i tre paralleller, så CDC25A
Q110del beregnet (CDC25A
Q110del = ΔCt = Ct
wt-Ct
tot). C. 50% av NSCLC viser CDC25A
Q110del verdiene som svarer til 30-50% av de totale CDC25A maler i referanse til standardkurven (B), mens den HBEC cellelinjer som uttrykker ~ 20% av de totale CDC25A maler (
P
= 0,003).
CDC25A
Q110del protein stabilitet og Cell overlevelse
CDC25A er en labil protein, strengt regulert gjennom flere fosforylering hendelser i sin regulatoriske domene [8]. For å undersøke effekten av Q110 sletting på skjebnen til CDC25A protein regulering, testet vi nedbrytningshastigheten for CDC25A
Q110del hjelp cykloheksamid (CHX) behandling. I H1299 celler behandlet med CHX, observerte vi at CDC25A
Q110del har en lengre halveringstid sammenlignet med CDC25A
wt (fig. 3A). Videre, når CDC25A
vekt og CDC25A
Q110del var kotransfektert, mer CDC25A
Q110del ble akkumulert enn CDC25A
vekt på 72 timer etter transfeksjon (fig. S2) i både H1299 og 293F celler.
A. Tidsforløpet cykloheksamid (50 ug /ml) behandling av H1299 celler transfektert med pEGFPN1-CDC25A
wt eller pEGFPN1-CDC25A
Qdel henhold uaffisert forhold viste økt halveringstid på CDC25A
Q110 (~15 minutter) versus CDC25A
vekt. B. UV-stråling, etterfulgt av 30 minutters inkubasjon av 293F-celler i 37 ° C, CDC25A
Q110del viste bedre stabilitet sammenlignet med CDC25A
wt. C. 293F celler belagt på lik celletetthet og transfektert med lik mengde EGFP merket CDC25A
Q110del eller CDC25A
vekt. Etter 72 timer med transfeksjon, flowcytometri analyse gating likt antall EGFP uttrykker celler for hver isoform. Histogram viser intensiteten i uttrykket av CDC25A
Q110del-EGFP (gjennomsnitt 59,2) versus CDC25A
wt-EGFP (gjennomsnitt 40,5) (t-test
P
= 0,05). D. Det samme populasjon av celler gated for EGFP-CDC25A uttrykk ble undersøkt for cellesyklus distribusjon. Den CDC25A
wt-EGFP viste å arrestere i posten G2 fasen ( G2 /M) sammenlignet med kontrollgruppen (p = 0,055). De EGFP-CDC25A
Q110del uttrykker celler viste mindre opphopning av hyperploid cellepopulasjon på G2 /M fase og akselerert cellene mer gjennom mitose i forhold til EGFP-CDC25A
wt uttrykker celler (p = 0,0047). E. Celleviabilitet analysen av H1299 uttrykke CDC25A
vekt versus CDC25A
Q110del etter 24 timer av flere doser av UV-stråling. CDC25A
Q110del uttrykk reddet H1299 følsomhet for UV-stråling i forhold til kontrollgruppen.
I 293F celler transfektert med enten CDC25A
vekt eller CDC25A
Q110del og behandlet med 10 og 20 j /m
2 UV-stråling, celler transfektert med CDC25A
Q110del viste en økt proteinstabilitet 30 minutter etter UV-bestråling, men ikke cellene transfektert med CDC25A
wt (fig. 3B).
for å få en mer kvantitativ måling av CDC25A
Q110del og CDC25A
wt nivåer, målte vi fluorescentintensiteten av CDC25A-EGFP fusjonsproteiner gating likt antall 293F celler uttrykker CDC25A
wt-EGFP eller CDC25A
Q110del-EGFP og observert et betydelig høyere nivå av fluorescerende intensitet i CDC25A
Q110del-EGFP transfekterte celler (fig. 3C). Den cellesyklusanalyse av den samme gated populasjon av celler, viste økt post G2 populasjon (hyperploid celler) av CDC25A
wt-EGFP uttrykkende celler i forhold til CDC25A
Q110del-EGFP, mens den CDC25A
Q110del -EGFP akselerert cellene mer gjennom innlegget G2-fasen (mitose) sammenlignet med CDC25A
wt (p = 0,0047) (fig. 3D). Dette tyder på at CDC25A
Q110del kan oppheve G2 /M sjekkpunkt i forhold til CDC25A
vekt, kjøring cellene mer gjennom mitose [26], [27].
For å undersøke om CDC25A
Q110del kan påvirke overlevelsen av NSCLC cellene under forstyrrede forhold, H1299 celler transfektert med CDC25A
Q110del ble behandlet med UV-stråling i forskjellige doser, H1299 uttrykker CDC25A
Q110del var mer motstandsdyktig mot UV indusert celledød sammen til cellene transfektert med kontroll vektor eller CDC25A
vekt, spesielt ved høye UV-doser (fig. 3E).
Cellular lokalisering og mitotisk aktivitet av CDC25A
Q110del
i H1299 celler, viste CDC25A
Q110del betydelig økning i kjernefysiske lokalisering enn CDC25A
vekt (fig. 4A). 24 timer etter UV-bestråling, cellene transfektert med CDC25A
Q110del viste høyere proteinstabilitet riktignok økt fosforylering av oppstrøms DNA skade respons (DDR) markør pChk1-ser345 (Fig. 4B). Som nye bevis peker CDC25A som CDC25 familiemedlem som kreves for full aktivering av kjernefysisk CDK1 [11], [28], [29], og siden Q110del er nærmest S116 – den CDK1 fosforylering nettstedet avgjørende for å stabilisere CDC25A i en feedback loop under mitose – [11], i tillegg til våre funn som viste CDC25A
Q110del å drive cellene mer gjennom mitose i forhold til CDC25A
wt (fig. 3D), gått vi for å undersøke effekten av CDC25A
Q110del på mitotisk aktivitet og på CDK1 aktivering. Etter transfeksjon av 293F-celler med CDC25A
Q110del-EGFP, vi har observert en økning i andelen av celler i mitotisk fase, et fenomen som ikke ble observert i cellene transfektert med CDC25A
wt-EGFP (fig. 4C). Sammenlignet med de celler transfektert med CDC25A
wt-EGFP, cellene transfektert med CDC25A
Q110del-EGFP viste en lavere grad av fosforylering ved CDK1- Tyr15, 24 timer etter transfeksjon (fig. 4D), som er konsistent med tilstedeværelse av mer aktiv CDK1 for å fremme G2 /M fase overgang (fig. 3D). Nedgangen i total CDK1 i CDC25A
wt og CDC25A
Q110del-transfekterte celler sammenliknet med kontroll- er forventet, ettersom arrest i cellesyklus G2 /M fase (Fig. 3D), kan føre til undertrykkelse av CDK1 ekspresjon på transkripsjonsnivået i en tid og celletype avhengig måte [30].
A. Immunoblot av H1299 celler viste CDC25A
Q110del å lokalisere mer i kjernen i forhold til CDC25A
vekt. B. 24 timer etter UV-bestråling, viste CDC25A
Q110del mer stabilitet i H1299 og korresponderte med mer fosforylering av DDR markør Chk1-ser345. C. Konfokalmikroskopi av 293F celler etter 24 timer av transfeksjon: CDC25A
Q110del uttrykk viste hyppige mitotiske tall (metafase «tynne piler»). Co-uttrykk for CDC25A
vekt og CDC25A
Q110del på (1:01) ratio, mitotisk aktivitet ble likevel lagt merke til (cytokinese, «dristige piler»). Histogrammet er representativ for pikselantallet for FITC per tilstand og rhodaminfamilien. D. pCDK1-Tyr15 defosforylering som nedstrøms leseren for relativ økt fosfatase aktivitet av CDC25A
Q110del forhold til CDC25A
vekt etter 24 timer av transfeksjon i 293F celler.
CDC25A
Q110delexpression i NSCLC og sin tilknytning til kliniske parametre
for å avgjøre om det er en potensiell effekt av CDC25A
Q110del uttrykk i svulster hos pasienter med NSCLC, kvantifisert vi CDC25A
Q110del uttrykk i primærsvulster og deres tilstøtende sammenkoblede lunge vev fra 88 NSCLC pasienter. CDC25A
Q110del uttrykk varierte fra undetectable til nær 100% av den totale CDC25A transkripsjoner i svulstene, med 50% av svulstene uttrykker CDC25A
Q110del i overkant av 20% av de totale CDC25A transkripsjoner. Interessant, mange av de tilstøtende normalt lungevev fra de samme lungekreftpasienter også uttrykkes CDC25A
Q110del, noe som tyder på at dette er en tidlig begivenhet i lunge karsinogenese.
så analysert sammenhengen mellom ekspresjonsnivåer av CDC25A
Q110del i svulstvev og kliniske patologiske parametere. Med unntak av en marginal sammenheng med adenokarsinom histologi (
P
= 0,068), ble ingen annen tilknytning observert (tabell S2 og S3). Nærmere bestemt, var det ingen sammenheng med scene, kjønn eller røyking historie. Men pasienter med tumorer hadde høyere CDC25A
Q110del uttrykk nivåer viste en ikke-signifikant trend mot dårligere total overlevelse (
P
= 0,074 ved Log-rank test) (figur 5A;. Tabell S2). Interessant, når man tar i betraktning CDC25A
Q110del uttrykk i de tilstøtende normale lungevev, vi observert at pasienter med tumorer uttrykt betydelig høyere CDC25A
Q110del enn sine sammenkoblede tilstøtende normale lungevev hadde signifikant dårligere total overlevelse (
P
= 0,0018 av Log-rank test) (figur 5B;. Tabell S4 og S5)
A.. Kaplan Meier overlevelseskurver viste CDC25A
Q110del i svulstvev å korrelere med dårlig total overlevelse av NSCLC (log rank
P
= 0,074). B. Kaplan Meier overlevelseskurver viste at når CDC25A
wt er høyere i tumor mot normalt vev pair, det korrelert med bedre total overlevelse (log rank
P
= 0,0018). Relativ Kvantifisering av målgen «CDC25A
wt» i NSCLC tumorvevet i forhold til normalt vev par av NSCLC i henhold til formelen: 2
-ΔΔct. CDC25A mal av svulst eller normal ble kjørt i tre paralleller av Uniplex reaksjon for hver av de Ct
wt og Ct
tot analyser, og gjennomsnittet ble beregnet for hver analyse.
Diskusjoner
CDC25A nivået er strengt regulert, slik at cellesyklusprogresjon, og sjekkpunkt overgang holdes i fysiologiske betingelser [20], [26], [31] – [35]. Tidligere rapporterte vi at CDC25A er ofte over uttrykt i NSCLC på transkripsjonsnivå [7]. I denne studien rapporterer vi identifisering av en roman CDC25A isoform, CDC25A
Q110del, som følge av en alternativ RNA-spleising. Vi fant at CDC25A
Q110del ble uttrykt i de fleste av NSCLC-cellelinjer, så vel som primære svulster. I tillegg opplever at histologisk normalt vev ved siden av kreft ofte uttrykt CDC25A
Q110del tilsier at dette er en tidlig hendelse og kan spille en viktig biologisk funksjon i lungene tumorigenesis.
CDC25A
Q110del mangler glutamin i posisjon 110 som er tilstøtende til 2 konservert serin-fosforyleringsseter i posisjonene 116 og 124 (fig. 1). S116 kan fosforylert av Cdk1 å stabil CDC25A i mitose via en positiv feedback loop, mens S124 kan fosforyleres av Chk1, Chk2, og MAPKAPK-2 til å akselerere CDC25A omsetning [11], [14], [27], [36] . Ioniserende stråling kan indusere fosforylering av S124 gjennom Chk1 og Chk2 kinaser [37], [38]. I et transgent dyr med modell S124 erstattet med alanin, ble CDC25A funnet lokalisert i centrosomes og at CDC25A nivåene ble ikke redusert etter ioniserende bestråling [39]. I denne studien ble det observert at CDC25A
Q110del har en forlenget protein halveringstid enn CDC25A
vekt, spesielt etter UV-bestråling, noe som tyder på at CDC25A
Q110del uttrykk kan påvirke cellulær respons overfor skade forårsaket av ioniserende bestråling . I samsvar med denne oppfatningen, fant vi at celler transfektert med CDC25A
Q110del er motstandsdyktig mot UV-indusert celledød enn cellene transfektert med kontroll-vektor eller CDC25A
vekt (Fig. 3E), i samsvar med en dypere aktivering av Cdk1 (fig. 4D).
CDC25A fosfatase reguleres hovedsakelig ved proteindegradering [8], [21], [31]. Fosforylering av spesifikke serin eller treonin-rester av proteinkinaser, hovedsakelig Chk1, p38 og GSK-3β, er nødvendige for dens ubiquitin-formidlet proteolyse [22], [37], [40], mens fosforylering på S18 og S116 ved CDK1 kan stabilisere CDC25A [11]. Fosforylering regulerer også beslaglegging av CDC25A etter 14-3-3 protein [41]. I vår studie, observerte vi at CDC25A
Q110del protein har et lavere omsetningshastighet, selv etter UV-bestråling (Fig. 3B og 4B), og mer kjernekraft akkumulering. To muligheter kan forklare disse observasjonene. For det første kan Q110 sletting i polypeptidet produsere betydelige konformasjonsendringer i umiddelbar nærhet og /eller naboregionen, som endrer bindende affinitet med sine kinaser, som fører til et lavere omsetningshastighet på CDC25A
Q110del. For det andre kan CDC25A
Q110del protein har en annen evne til shuttle mellom cytoplasmatiske og kjernefysiske avdelinger via 14-3-3 proteiner [42]. Aminosyresekvensen umiddelbart foregående Q110, RRIHSLP, utgjør en konsensus 14-3-3 bindingssete, (R) RxxSxP [43]. Siden bindingen av 14-3-3 til målet er fosforylering avhengig og er påvirket av sekvens sammenheng, dette øker interessant mulighet for at en ukjent protein kinase kan fosforylere dette nettstedet og påvirke smugling av CDC25A. Disse funn har potensiell betydning i sammenheng med motstandsevnen mot DNA-skade i celler med ectopically uttrykker CDC25A
Q110del (fig. 3E). Ytterligere undersøkelser vil være nødvendig for å fastslå om svulster med høyere CDC25A
Q110del er mer motstandsdyktig mot DNA-skadelige stoffer eller strålebehandling og hvis målretting CDC25A
Q110del vil bevisstgjøre disse svulstene til disse behandlingene [44].
en interessant observasjon er uttrykk for CDC25A
Q110del i normalt utseende lunge vev ved siden av NSCLC, noen ganger med høy overflod, noe som tyder på unormalt tidlig hendelse i løpet lunge kreftutvikling [44].
