Abstract
Angiogenese er en kritisk hendelse i utvikling, progresjon og spredning av ulike menneskelige kreft, inkludert lungekreft. Molekylære mekanismer som ligger til grunn for komplekse regulering av angiogeneprosesser er dårlig forstått. Men en økende mengde bevis indikerer mirnas som viktige regulatorer av tumor angiogenese. Tang biopsier ble samlet inn fra svulstvev, omkringliggende vev, og ikke-svulstvev fra 50 NSCLC pasienter. Lung vevsprøver fra personer med ingen kliniske tegn på kreft sykdom fungerte som kontroller. Immunhistokjemisk farging for faktor VIII ble anvendt for å evaluere microvessel tetthet (MVD). TaqMan® primer-probe sett ble brukt i kvantitative real-time RT-PCR reaksjoner for å bestemme uttrykk nivåer av la-7b, MIR-126, MIR-9, og MIR-19a. Vi demonstrerte betydelig høyere MVD og redusert uttrykk nivåer av la-7b og MIR-126 i tumorvev og omkringliggende vev i forhold til tilsvarende ikke-tumorvev eller lungevev fra kontrollgruppen. I tillegg ble det ikke observert noen forskjeller i MVD og uttrykk nivåer av både mirnas mellom svulstvev og omkringliggende vev fra NSCLC pasienter. Lav uttrykk for både mirnas korrelerte med høy MVD og verre progresjonsfri overlevelse og total overlevelse. Disse observasjonene sterkeste at lignende molekylære vekslinger i svulstvev og omkringliggende vev som utgjør en bestemt mikromiljøet. Lav uttrykk for skuffelse 7b og MIR-126 ser ut til å ha en mulig anti-angiogen rolle i lunge svulstvev og betydelig korrelerer med dårligere overlevelse utfall for lungekreftpasienter. Videre kan reguleringen av la-7b og MIR-126 uttrykk ha terapeutisk potensial fordi det kan redusere tumor angiogenese, og derfor undertrykke tumorvekst hos lungekreftpasienter
relasjon:. Jusufović E, Rijavec M, Keser D, Korosec P, Sodja E, Iljazović E et al. (2012) la-7b og MIR-126 Er nedregulert i svulstvev og Correlate med microvessel Tetthet og Survival Outcomes in Non-småcellet lungekreft. PLoS ONE 7 (9): e45577. doi: 10,1371 /journal.pone.0045577
Redaktør: Giuseppe Viglietto, Universitetet Magna Graecia, Italia
mottatt: 5 april 2012; Godkjent: 22 august 2012; Publisert: 24.09.2012
Copyright: © Jusufović et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Disse forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft er den ledende årsak til kreft-relaterte dødsfall på verdensbasis, er ofte diagnostisert i avansert stadium; derfor kjemoterapi kombinert med thorax strålebehandling representerer bærebjelken i behandlingen. Men en terapi som forstyrrer spesifikke molekylære mål har store løftet i å forbedre kliniske resultater i lungekreft behandling [1], [2].
Utvikling, progresjon, og metastasering av ulike kreft hos mennesker er sterkt avhengig av angiogenese, en fysiologisk prosess som involverer genereringen av nye blodkar fra pre-eksisterende vaskulatur. En utvikler solid svulst er vanligvis i en oksygenfattige eller hypoksisk tilstand, som utløser differensial uttrykk for meklere som enten fremmer eller hemmer angiogenese [3]. Angiogene faktorer (for eksempel familien av vaskulær endotelial vekstfaktorer [VEGFs] og deres reseptorer) som styrer denne komplekse prosessen har vært fokus for arbeidet med å identifisere nye terapeutiske mål og utvikle behandlingsstrategier for å hemme angiogenese og undertrykke ukontrollert spredning av utviklings svulster [2]. Derfor belyse de molekylære mekanismene som regulerer angiogenese kunne være av stor betydning for å redusere kreftrelatert dødelighet [3], [4].
microRNAs (mirnas) er korte (i snitt 19 til 25 nukleotider lang) regulatoriske RNA molekyler med en primærfunksjon i den stanse av genekspresjon, som er hovedsakelig basert på posttranskripsjonelt undertrykkelse av mål-mRNA ved å undertrykke oversettelse og /eller ved å fremme mRNA degradering [5], [6]. Eldre mirnas styrer uttrykket av mange gener som regulerer grunnleggende biologiske prosesser, inkludert angiogenese [6]. Mange mirnas regulerer angiogenese, selv om deres spesifikke roller i angiogene prosess er dårlig karakterisert. Deres potensielle tumor-undertrykkende eller onkogen rolle i denne prosessen er blitt foreslått i forskjellige humane cancere [7] – [11]. Videre, samler bevis foreslår mirnas som attraktive mål for å utvikle behandlingsstrategier som vil oppnå bedre kliniske resultater hos kreftpasienter [12] – [14]
Flere forfattere demonstrerte redusert uttrykk for la-7 miRNA familien, inkludert. la-7b, i enten tumor vev eller tumorcellelinjer i forhold til deres normale motstykker [13], [15], [16] tyder på at medlemmer av la-7-familien er viktige regulatorer av cellulære prosesser som er involvert i initiering og progresjon av ulike kreft hos mennesker. I ikke-ondartede celler, la-7b undertrykker oversettelse av flere proteiner involvert i lungekreft utvikling, noen av dem med en potensiell rolle i angiogenese (for eksempel C-MYC og K-RAS) [17], [18].
en annen miRNA ofte nedregulert i flere humane kreftformer er MIR-126 [9], [12], [19], som retter seg mot uttrykk for VEGFA og andre molekylære mål med en potensiell rolle i blod-fartøy dannelse ( f.eks VCAM1, EGFL7, og PIK3R2) [19] – [21]. Liu et al. [12] fant redusert uttrykk av MIR-126 og økt uttrykk av VEGFA i ulike lungekreft cellelinjer, og viste at innføringen av MIR-126 inn i kreftceller ved hjelp av en lentiviral vektor kunne ned-regulere uttrykk for VEGFA.
medlemmer av MIR-17-92 klynge er kjent for å opptre som onkogener i utvikling av lungekreft [14], [22]. Det er blitt vist at ekspresjon av MIR-17-92 klynge blir direkte aktivert av onkogenene c-myc og N-myc [23], [24]. Den derav følgende høy ekspresjon av dens medlems, MIR-19a, ble funnet å korrelere med redusert ekspresjon av flere anti-angiogene faktorer som trombospondin-1 (TSP-1) og bindevev vekstfaktor (CTGF) [23], [25] .
Opplysningene om rollen til MIR-9 i lungekreft utvikling og angiogenese mangler fortsatt. Ved hjelp av mikromatriseanalyse, nedregulering av MIR-9 i lungetumorvevet i forhold til tilsvarende ikke-svulstvev ble rapportert [15]. På den annen side synes ekspresjonen av MIR-9 til å bli oppregulert i brystkreft, hvor det reduserer E-cadherin ekspresjon som fører til øket ekspresjon av VEGFA og fremming av angiogenese [10].
Formålet denne studien var å undersøke graden av vaskularisering bestemmes av microvessel tetthet samt uttrykk for utvalgte mirnas (spesielt, la-7b, MIR-126, MIR-9, og MIR-19a) i lunge svulstvev, omkringliggende vev, og tilsvarende ikke-tumorvev hos pasienter med squamous celle lungekreft (SCC) og lunge adenokarsinom (ADC) så vel som i lungevev fra kontrollpersoner uten kliniske tegn på ondartet sykdom. Sammenhengene mellom miRNA uttrykk nivåer og overlevelses utfall (PFS og OS) etter 1 års oppfølging ble også vurdert. Resultatene av denne studien kan forbedre den molekylære iscenesettelse av lungekreft og kan tilby verdifull innsikt i å identifisere potensielle antiangiogen målrettet terapi i lungekreft.
Resultater
microvessel tetthet (MVD)
MVD i svulstvev (median [utvalg]: 48 [17-123]) og omkringliggende lungevevet (median [utvalg]: 49 [14-120]) var signifikant høyere i forhold til tilsvarende ikke-svulstvev ( median [utvalg]: 26 [12-89]) eller kontroll lungevev (median [utvalg]: 34 [5-87], figur 1). Det ble ikke observert forskjeller i MVD mellom svulstvev og omkringliggende vev eller når pasientene ble stratifisert etter stadium av sykdommen, type lungekreft eller sex. Tilsvarende ble ingen forskjeller i MVD oppdaget i kontrollgruppe av personer med ulike patologiske funn (data ikke vist). Figur 2 viser representative tilfelle av MVD (Faktor VIII) farging i FFPE- vevsprøver.
Data er presentert som median med interkvartilt område.
Piler indikerer blodkar.
miRNA uttrykk og sammenhenger med microvessel tetthet
uttrykk for utvalgte miRNAs ble bestemt i alle vevsprøver og normalisert til en prøve fra kontrollgruppen. Det ble ikke observert signifikante sammenhenger mellom uttrykk av utvalgte miRNAs og enten klinisk stadium av sykdommen, type lungekreft eller pasientens kjønn.
Vi har funnet betydelig redusert uttrykk for enten la-7b eller MIR-126 i svulstvev og omgivende vev sammenlignet med tilsvarende ikke-tumor lungevev eller lungevev fra kontrollgruppen (la-7b /MIR-126:
p
0,001; figur 3A og 4A, henholdsvis). Det ble ikke observert forskjeller i uttrykk av enten la-7b eller MIR-126 mellom svulstvev og omkringliggende vev. Ingen forskjeller i la-7b uttrykk ble også registrert mellom ikke-svulstvev og kontroll lungevev. På den annen side, ble signifikante forskjeller i MIR-126 uttrykk funnet mellom begge vevstyper. Videre fant vi en høy negativ sammenheng mellom la-7b (figur 3B-E) eller Mir-126 uttrykk (figur 4B-E) og MVD i alle vevsprøver hvor den samlede r
S korrelasjonskoeffisient var -0,784 og – 0,752, henholdsvis.
data er presentert som median med rekkevidde og interkvartilt område. Korrelasjon mellom la-7b relative uttrykk og MVD i lungekreftpasienter «tumorvev (B), omgivende vev (C), og ikke-tumor lungevev (D), så vel som i lungevev fra kontrollpersoner (E).
data er presentert som median med rekkevidde og interkvartilt område. Sammenheng mellom MIR-126 relativt uttrykk og MVD i lungekreftpasienter «svulstvev (B), omkringliggende vev (C), og ikke-tumor lungevev (D), så vel som i lungevev fra kontrollpersoner (E).
på den annen side, ingen vesentlige endringer i MIR-9 uttrykk nivåer blant alle undersøkte vevsprøver ble observert (figur 5A).
data er presentert som median med rekkevidde og indre kvartilområdet .
Vi har observert betydelig lavere uttrykk for MIR-19a i svulstvev i forhold til å kontrollere lungevevet (figur 5B). Uttrykket av MIR-19a var høyere i omkringliggende vev skjema ADC pasienter i forhold til omkringliggende vev fra SCC pasienter (
p
0,001; data ikke vist).
Siden uttrykk nivåer av MIR -9 og MIR-19a ikke varierer betydelig mellom svulstvev og tilsvarende ikke-svulstvev, ble ytterligere korrelasjoner med MVD ikke evaluert.
Survival analyserer
Bare mirnas med sterke statistiske forskjeller i uttrykket nivåer mellom svulstvev versus tilsvarende ikke-svulstvev (la-7b og MIR-126) ble inkludert i overlevelsesanalyse.
median PFS for hele gruppen av pasienter var 154 dager, mens median OS var 236 dager. Det ble ikke observert signifikante forskjeller i PFS eller OS for hele gruppen av pasienter når pasientene ble stratifisert etter histologisk type lungekreft eller sykdomsstadier (data ikke vist).
PFS og OS ifølge enten MVD status eller miRNA uttrykk for lungekreftpasienter er presentert i tabell 1 og figurene 6-7. Kort fortalt var lav uttrykk for la-7b, MIR-126 eller begge mirnas kombinert korrelert med korte PFS eller OS i hele gruppen av lungekreftpasienter. Ved å vedta signifikansnivået på 0.01, sammenhengene forble viktig i en undergruppe av SCC pasienter, mens en trend mot kortere PFS eller OS ble observert i en undergruppe av ADC pasienter.
progresjonsfri overlevelse i hele gruppen av NSCLC pasienter (A), hos pasienter med plateepitelkarsinom lungekreft (B) og adenokarsinom (C). Total overlevelse i hele gruppen av NSCLC pasienter (D), hos pasienter med plateepitelkarsinom lungekreft (E) og adenokarsinom (F).
progresjonsfri overlevelse i hele gruppen av NSCLC ( A), i pasienter med squamous celle lungekreft (B) og adenokarsinom (C). Total overlevelse i hele gruppen av NSCLC pasienter (D), hos pasienter med plateepitelkarsinom lungekreft (E) og adenokarsinom (F).
Diskusjon
Molekylære mekanismer som danner grunnlaget for den komplekse regulering av tumor angiogenese er dårlig forstått. Men en økende mengde bevis i de senere år indikerer mirnas som viktige regulatorer av fysiologisk og patologisk angiogenese. For å evaluere angiogen rolle utvalgte miRNAs ble deres uttrykk nivåer bestemt og korrelert med MVD i NSCLC pasienter. Vi viste en betydelig redusert uttrykk for to mirnas (la-7b og MIR-126) og høyere grad av MVD i svulstvev og omkringliggende vev i forhold til tilsvarende ikke-svulstvev. Ingen forskjeller ble observert i MVD og uttrykk nivåer av både mirnas mellom svulstvev og omkringliggende vev fra NSCLC pasienter. Ekspresjonen av både mirnas også negativt korrelert med MVD og er signifikant assosiert med sykdomsprognosen. Disse observasjonene sterkt at et mulig antiangiogene rollen la-7b og MIR-126 i lungekreft utvikling. Videre kan reguleringen av la-7b og MIR-126 uttrykk ha terapeutisk potensial fordi det kan redusere tumor angiogenese, og derfor undertrykke tumorvekst hos lungekreftpasienter.
Angiogenese kan evalueres ved forskjellige arbeidsmåter. I vår studie har vi brukt MVD som en indikator på angiogene potensialet i vevsprøver. Våre resultater tyder på høy MVD i tumorvev og omkringliggende vev i forhold til ikke-tumorvev fra NSCLC eller kontrollgruppen. Vi fant ingen signifikante forskjeller mellom svulstvev og omkringliggende vev. Disse observasjonene stemmer overens, selv om de ikke er direkte sammenlignbare med resultatene av andre studier, antyder at mikromiljøet av omgivende vev utøver en viktig potensial for tumorutvikling, vedlikehold, og progresjon [26] – [28]. Så langt har flere studier rapportert høy uttrykk for enten pro-angiogene faktorer (for eksempel transkripsjonsfaktor HIF-1α, vekstfaktorer VEGF og bFGF) eller faktorer involvert i vaskulær utvikling og ombygging (f.eks endoglin CD105) i svulster og /eller rundt vev [26], [28] – [30]. Forskjellige typer av stromale celler, så som endotelceller, glatte muskelceller, fibroblaster og infiltrerende celler i immunsystemet i løpet av svulsten mikromiljøet er blitt funnet å produsere disse pro-angiogene mediatorer, og dermed fremme viktige hendelser i tumorvekst og angiogenese [27 ], [31], [32].
Denne studien viste en betydelig lavere ekspresjon av la-7b og MIR-126 i tumorvev sammenlignet med enten ikke-svulstvev fra NSCLC eller lungevev fra kontrollgruppe. Våre resultater er konsistente med andre publiserte studier, hvor redusert uttrykk for skuffelse 7 familien, inkludert la-7b [13], [15], [16] eller MIR-126 [9], [12], [15], [ ,,,0],19], [20], [33] i tumor vev eller tumorcellelinjer av forskjellige humane cancerformer er blitt rapportert. Ekspresjonsnivåene av både la-7b og MIR-126 var også signifikant lavere i omgivende vev, hvor ingen tumorceller til stede. Så vidt vi vet, har direkte sammenligning av la-7 eller Mir-126 uttrykk nivåer mellom svulstvev og omkringliggende vev ikke blitt rapportert. På grunnlag av våre resultater, kan man konkludere med at tilsvarende molekylære forandringer er til stede i tumorvev og det omkringliggende vev. Videre er en sterk negativ korrelasjon mellom MVD, en indikator på vev angiogen potensial og ekspresjon av la-7b eller MIR-126 i alle undersøkte vevsprøver ble observert, noe som tyder sterkt deres rolle i å undertrykke angiogene prosesser. Videre disse observasjonene indikerer igjen den store betydningen av svulsten mikromiljøet i kreftutvikling og sitt engasjement i tumor angiogenese.
Videre overlevelse analyse av begge mirnas viste at NSCLC pasienter med lavt uttrykk av enten individuelle miRNA eller begge mirnas kombinert (la-7b og MIR-126) ble sterkt forbundet med dårlig overlevelse utfall (PFS og OS). Men foreningene var viktig i en undergruppe av SCC pasienter, selv om ADC pasienter med lavt uttrykk av både miRNAs i svulstvevet tendens til å ha kortere PFS eller OS. Denne sterke effekten av la-7 eller Mir-126 uttrykk på sykdomsprognose har blitt rapportert av andre forskningsgrupper [13], [15], [34] – [36]. Flere studier korrelert redusert uttrykk for la-7 i svulstvev med dårlig overlevelse resultatene av lungekreftpasienter [13], [15]. På samme måte er forholdet mellom lav MIR-126-ekspresjon i tumorvevet, og verre sykdomsprognosen er rapportert i glioblastom [34], brystkreft [35] og magekreftpasienter [36]. Som motsatt til våre resultater, Dønnem et al. [37] viste at høy Mir-126 uttrykk i tumorprøver korrelerer med kortere overlevelse av NSCLC pasienter, særlig hos pasienter med plateepitelkarsinom. Enda mer interessant ble det observert en positiv korrelasjon mellom MIR-126 og VEGFA uttrykk, noe som antyder en mulig positiv regulerende rolle MIR-126 i tumor angiogenese [37].
Enda viktigere, takamisawa et al. [13] har vist at veksten av lungekreftceller kan bli inhibert ved innføring av ekspresjonskonstruksjoner overekspresjon la-7. Til sammen kan disse funnene kan potensielt brukes til å utvikle nye kreft målrettet terapi, noe som ville begrense bivirkninger, senere bedre livskvalitet og forlenge generelle overlevelse.
Denne studien fant ingen signifikante forskjeller i MIR-9 uttrykk nivåer blant alle undersøkte vevsprøver og ingen tilknytning til MVD. Likevel er større studier garantert å fastslå den eksakte rollen MIR-9 uttrykk i tumor angiogenese, ettersom bare et begrenset antall studier i lungekreft har blitt publisert så langt [15], [38].
resultatene indikerer en lavere ekspresjon av MIR-19a i tumorvevet i forhold til andre vevsprøver. Disse funnene er motstridende og motsette seg pro-angiogene rollen MIR-19a rapportert av de fleste studier publisert så langt [14], [23], [25], [39], [40]. Men flere forfattere rapportert at enkelte medlemmer av MIR-17-92 klynge, inkludert MIR-19a, kan ha ulike funksjoner i kreftcellevekst og angiogenese [14], [39], [40]. Videre TSP-1, som har blitt beskrevet som en av de viktigste mål for MIR-19a, kan enten redusere [23] eller, etter binding med celleoverflatereseptorer griner, selv fremme angiogenese [41]. Likevel er videre undersøkelser av enkelte medlemmer av MIR-17-92 klynge og deres engasjement i angiogeneprosesser nødvendig.
I konklusjonen, våre resultater tyder på at betydelig redusert uttrykk for skuffelse 7b og MIR-126 i tumor vev har en innvirkning på prognose fra NSCLC pasienter. Disse funnene kan gi oss et viktig skritt mot å forstå de komplekse trasé som er nødvendige for utvikling og progresjon av lungekreft. Videre mirnas er foreslått som attraktive mål for å utvikle behandlingsstrategier som vil oppnå bedre kliniske resultater hos kreftpasienter. Men de foreliggende resultatene gir bare for konklusjoner basert på samsvarende analyse og videre validering gjennom mekanistiske studier synes obligatorisk.
Materialer og metoder
Pasienter og vevsprøver
Denne multi- sentriske studien ble påbegynt etter at den ble godkjent av human forskningsetiske komité for Bosnia og Hercegovina og den tilsvarende organisasjonen i Serbia og alle pasientene ga sin informert skriftlig samtykke. Innsamling og påfølgende bevaring (formalin fiksering, parafin embedding) av vevsprøver fra de deltakende pasienter og kontroller, samt immunhistokjemisk evaluering ble utført på General Hospital Tešanj (Bosnia-Hercegovina) og Klinikk for lungesykdommer i Kruševac (Serbia). Molekylære laboratorieprosedyrer inkludert RNA ekstraksjon, revers transkripsjon og real-time PCR uttrykk analyse på vevsprøver ble utført ved University Clinic Golnik (Slovenia).
50 pasienter med ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) , inkludert SCC og ADC (tabell 2), og 45 alders- og kjønns matchet personer med ingen kliniske tegn på ondartet sykdom (kontrollgruppen) ble inkludert (tabell 3).
for patologisk undersøkelse, immunhistokjemi, og miRNA analyse, tang biopsi av svulstvev, omkringliggende vev (2 cm radius rundt primær svulstvev uten ondartede celler), og pasientenes ikke-tumor lungevev ble tatt fra pasienter med lungekreft. Diagnosen SCC eller ADC i alle kreft vevsprøver ble bekreftet av en erfaren patolog før innmelding i studien. Vi inkluderte tumor vevsprøver med minst 70% tumorvev, som bekreftet av pathohistology, og omgivende vev, så vel som ikke-tumor lungevev med noen patologiske synger av eventuelle celle maligne forandringer. En tang biopsi ble tatt fra kontrollpersoner uten kliniske tegn på kreft sykdom (kontrollgruppen). Vevsprøver ble umiddelbart formalinfiksert og enn parafin forankret ved hjelp av standard prosedyrer.
Immunohistochemistry
Deler av fem mikrometer ble kuttet fra parafininnstøpte vevsblokker. Fra hver vevsprøve, ble seksjonene farget med hematoksylin-eosin brukes for morfologisk undersøkelse og kvalitetsvurdering. Immunhistokjemisk analyse av vaskularisering ble utført ved anvendelse av analysesystem og det monoklonale antistoff mot faktor VIII (DAKO, Glostrup, Danmark). I korthet ble 5 um tykke seksjoner FFPE-snitt, plassert på objektglass belagt med 3-triethoxysilylpropylamine (Sigma, St. Louis, Missouri, USA), og fast ved 37 ° C over natten. Etter deparaffinizing i xylen og rehydrating gjennom graderte alkoholer, ble platene inkubert i H
2o
2 for å blokkere endogen peroksidase aktivitet. Deretter seksjoner ble inkubert i 1 time med primært monoklonalt antistoff mot faktor VIII (fortynning 1:1200) ved romtemperatur. Etter vasking, ble seksjonene inkubert med biotinylert geit-anti-kanin-immunoglobulin (fortynning 1:300, Vector Laboratories, Burlingame, California, USA), vasket igjen, og etter tilsetning av 3,3′-diaminobenzidin tetrahydroklorid peroksidase-aktivitet ble visualisert. Hematoxylin ble benyttet som en teller flekk.
Graden av vaskularisering ble målt med det gjennomsnittlige antall av Faktor VIII-positive mikrokar i tre forskjellige områder ved 200 gangers forstørrelse og registrert som microvessel tetthet (MVD). Kort fortalt, de Factor VII farget seksjonene ble først skannet ved lav effekt (100 ganger forstørrelse) og de områdene som har høyest antall microvessels (hot spots) ble valgt. Deretter ble microvessel telling utført i tre forskjellige områder i 200-gangers forstørrelse, og den midlere verdi ble anvendt for videre analyse. Enhver tydelig farget endotelceller eller cellegruppene ble vurdert som en enkelt tellbar microvessel, om tilstedeværelse av lumen og store fartøy ble automatisk ekskludert fra analysen.
Valg av spesifikke miRNA involvert i angiogenese
Slik velger mirnas involvert i kreft angiogenese regulering, tilgjengelige publikasjoner og flere mål prediksjon programmer /databaser ble søkt, inkludert Miranda (https://cbio.mskcc.org/cgi-bin/mirnaviewer/mirnaviewer.pl), TargetScan (http: //www.targetscan.org/), PicTar (https://pictar.mdc-berlin.de/), og miRbase (https://microrna.sanger.ac.uk/). Basert på disse funnene, fire mirnas (spesielt, la-7b, MIR-9, MIR-19a, og MIR-126) ble valgt. Valgte mirnas ble vist å ha roller i angiogenese, enten direkte eller indirekte undertrykke translasjonen av avgjørende angiogene faktorer som VEGFA, TSP-1, CTGF, vaskulær celleadhesjonsmolekyl 1 (VCAM-1), fibroblast vekstfaktor (FGF), E -cadherin (CDH1), MMP (matriksmetalloproteinaser) og tumorvekstfaktor (TGF).
RNA ekstraksjon, revers transkripsjon og real-time PCR
Total RNA ble ekstrahert fra 10 FFPE vevssnitt fem mikrometer tykke bruker miRNeasy FFPE Kit (Qiagen GmbH, Hilden, Tyskland) etter produsentens anvisninger. Total RNA konsentrasjon ble vurdert ved hjelp av Quanti-iT RNA-analysesett (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). To trinn real-time PCR ble brukt for å analysere ekspresjon av utvalgte miRNAs. I det første trinnet total RNA ble revers transkribert ved hjelp av miRNA-spesifikke RT primere (RNU6B, HSA-la-7b, HSA-MIR-9, HSA-MIR-19a, og HSA-MIR-126) og en TaqMan® mikroRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Foster City, California, USA). RT-reaksjonen ble utført i 10 ul volum inneholdende 1 pl Taqman RT-buffer (10 x), 0,10 pl 100 mM dNTPs, 0,67 ul MultiScribe revers transkriptase (50 enheter /ul), 0,13 ul RNase-inhibitor (20 U /ul), 2 pl spesifikke miRNA primer, 3,33 mL av RNA, og nuklease fritt vann for å gjøre den endelige volum 10 pl. Produkter av RT reaksjon ble brukt i en real-time PCR reaksjon med TaqMan miRNA analyser (Applied Biosystems) og TaqMan Universal Master Mix II, ingen UNG (Applied Biosystems), i henhold til produsentens instruksjoner. Kort fortalt ble 1,33 mL cDNA blandet med 5 mL TaqMan Universal Master Mix II, ingen UNG (2 x), 0,5 mL TaqMan miRNA analysen og 3,17 mL nukleasefritt vann. Alle prøver ble kjørt i triplikat. Den RNU6B (Applied Biosystems), ble anvendt som en endogen kontroll for normalisering av mål-mirnas og en prøve fra kontrollgruppen ble brukt som en kalibrator. Relativ uttrykk ble beregnet ved hjelp av ΔΔCt metoden. RQ ble bestemt av to
-ΔΔCt, hvor ΔCt = (gjennomsnitt av tre eksemplarer Ct
Target miRNA-gjennomsnitt tre eksemplarer Ct
RNU6B) og ΔΔCt = (ΔCt
Prøve-ΔCt
Prøve fra kontrollgruppe). Real-time PCR ble utført på ABI PRISM 7500 Real-Time PCR System (Sequence Detection System instrument utstyrt med SDS versjon 1.3.0 programvare; Applied Biosystems).
Statistiske analyser
Fordelingen av data ble bestemt ved hjelp av D’Agostino og Pearson omnibus normalitet test. Styrken i sammenhengen mellom miRNA uttrykk nivåer, MVD og andre kliniske variabler ble analysert med Mann-Whitney U-test, uparet t-test eller Fishers eksakte test som passer. Den Spearman rank korrelasjonstest ble brukt for å analysere graden av lineær sammenheng mellom MVD og relative uttrykk for individuell miRNA. Pasientene ble dikotomisert i grupper med høy /lav MVD eller høy /lav uttrykk for utvalgte mirnas i svulstvev i henhold til cut-off verdier (median MVD eller median relativ uttrykk, henholdsvis). Alle pasientene i denne studien ble observert for 1 år; Etter denne tid overlevelsessannsynlighet (PFS og OS) ble beregnet fra den dagen diagnosen til tidspunktet for hendelsen (fremgang eller død, henholdsvis) eller tap til oppfølging ved hjelp av Kaplan-Meier metoden og log-rank test ble brukt til å sammenligne ulike kategorier. Statistiske analyser ble utført med GraphPad Prism 5-programvaren (San Diego, California, USA) og sannsynlighets verdier av
p
0,01 ble akseptert som betydelig etter Bonferroni korreksjon for 5 tester. Statistisk signifikante forskjeller presenteres som: **
p
0,01; ***
p
. 0,001
Takk
Vi er takknemlige for alle pasienter som deltok i denne studien, og til I. Kern (universitetsklinikken Golnik) for hans dyktig hjelp og uvurderlige råd i pathohistological prosedyrer.
