Abstract
metastatisk potensial av celler er en viktig parameter i utformingen av optimale strategier for personlig behandling av kreft. Ved hjelp av atomkraftmikroskopi (AFM), viser vi, i samsvar med tidligere studier utført i andre typer epitelisk kreft, som eggstokkreft celler er vanligvis mykere og vise lavere iboende variabilitet i celle stivhet enn ikke-maligne ovarian epitelceller. En detaljert undersøkelse av svært invasiv eggstokkreft celler (HEY A8) i forhold til sine mindre invasive foreldreceller (HEI), viser at formbarhet er også en nøyaktig biomarkør av metastatisk potensial. Sammen genuttrykk analyser tyder på at redusert stivhet av høyt metastatiske HEY A8 celler er assosiert med aktin cytoskjelettet ombygging og mikroskopisk undersøkelse av aktin fiberstrukturen i disse cellelinjene er i samsvar med denne spådommen. Våre resultater tyder på at celle stivhet kan være en nyttig biomarkør for å evaluere den relative metastatisk potensialet i eggstokkene og kanskje andre typer kreftceller
Citation. Xu W, Mezencev R, Kim B, Wang L, McDonald J, Sulchek T (2012) Cell Stivhet Er en biomarkør av metastatisk potensial for eggstokkreft celler. PLoS ONE 7 (10): e46609. doi: 10,1371 /journal.pone.0046609
Redaktør: Surinder K. Batra, University of Nebraska Medical Center, USA
mottatt: 21 april 2012; Godkjent: 04.09.2012; Publisert: 04.10.2012
Copyright: © Xu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne takker NSF (prosjektnummer CBET-0932510) for økonomisk støtte til dette prosjektet. Forfatterne takker også presidentens Graduate forskningspris (PURA) program og Petit Scholars Program ved Georgia Tech for å gi støtte til BK. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Den mekaniske integriteten av celler som er regulert av et dynamisk nettverk av strukturelle, tverrbinding, og signalmolekyler [1]. Derfor kan endringer av mekaniske egenskaper av individuelle celler avslører viktig informasjon om endringer i disse nettverkene. Undersøkelser av en rekke sykdommer som benytter forskjellige eksperimentelle teknikker har vist at abnormiteter i de elastiske egenskapene til cellene er forbundet med sykdoms patogenese og progresjon [2], [3], [4], [5], [6], [7] , [8], [9], [10], [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17]. For eksempel, invasiv tumorceller mekanisk mykne og modifisere deres adhesjon til ekstracellulær matriks, noe som forbedrer deres evne til å unnslippe primærtumor [5], [17], [18]. Målinger av kreftcelle stivhet, kvantifisert av Youngs modul, har vist en sterk sammenheng mellom celle formbarhet og celle malignitet [5]. På lignende måte ble stivheten av metastatiske kreftceller isolert fra pleural fluidene i brystkreftpasienter rapportert å være mer enn 70% lavere, med et standardavvik over fem ganger smalere enn benigne reaktive mesothelial celler [3].
fordelingen av aktin nettverk spiller en viktig rolle i å bestemme de mekaniske egenskapene til enkeltceller [19], [20], [21]. Som celler forvandle fra ikke-ondartet til krefttilstander, deres cytoskeletal strukturen endres fra en organisert til en uregelmessig nettverk, og denne endringen reduserer senere stivheten av enkeltceller [5], [22]. Studiene av mekaniske egenskaper hos cancerceller som er omtalt ovenfor antyder at endring av stivheten av enkeltceller kan indikere tilstedeværelse av malignitet [15], [16], [23], [24].
Behovet for effektive biomarkører for sykdommer er spesielt viktig i tilfellet med eggstokkreft, som er den mest dødelige av gynekologiske kreftformer. Eggstokkreft ble rangert som nummer fem blant viktigste årsakene til kreft-relaterte dødsfall av amerikanske kvinner i 2007 og sin fem års overlevelse var 46% for alle tilfeller diagnostisert i 1999-2005 [25]. På grunn av at det ikke pålitelig screening i klinisk praksis og asymptomatisk kurs gjennom tidlige stadier av sykdommen, er de fleste av eggstokkreft tilfeller (68%) diagnostisert som metastatisk sykdom med dårlig overlevelse [26].
I denne studien av de mekaniske egenskaper for celler fra flere forskjellige ovarian cancer cellelinjer og ikke-maligne immortaliserte ovarian overflate epitelceller (IOSE), viser vi at cellen stivhet ikke bare utmerker eggstokkreft celler fra ikke-maligne celler, men også kan skille mer tumorigene /invasive kreftceller fra mindre tumorigen /invasive typer. Våre funn tyder på at måling av celle stivhet i eggstokkene og kanskje andre typer kreftceller kan ikke bare bidra til en bedre forståelse av de fysiske og molekylære mekanismer bak tumorprogresjon, men kan også fungere som et nyttig klinisk verktøy i vurderingen av metastatisk potensial .
Materialer og metoder
ovarian cellelinje Vekst og Prøvepreparering
udødelig eggstokkene overflaten epitelceller (IOSE) ble sjenerøst gitt av Dr. N. Salzburg (University of British Columbia, Vancouver, Canada) og dyrket i 199/105-medium (01:01) supplementert med 15% føtalt bovint serum (FBS, Atlanta Biologicals, Atalanta, GA) og 1% antibiotisk-antimykotisk oppløsning (Mediatech-Cellgro, Manassas, VA ). Eggstokkreft HEI og Hei A8 cellelinjer ble gitt av Dr. G. Mills (MD Anderson Cancer Center, Houston, TX, USA) og dyrket i RPMI-1640 supplert med 10% FBS og 1% antibiotisk-antimykotisk oppløsning (R10 medium). Den eggstokkreft OVCAR-3 og OVCAR-4 cellelinjer ble anskaffet fra Developmental Therapeutic Program (DTP) av National Cancer Institute (NCI) (Bethesda, MD). Før AFM eksperimenter ble cellene sådd ut i en Fluorodish (World presisjonsinstrumenter, Sarasota, FL) med en første tetthet på 10000-20000 celler /cm
2.
Atomic Force Mikros
Vi gjennomførte atomic force mikroskopi (AFM) mekaniske målinger [27], [28] på enkelt eggstokkene epitelceller. AFM brukt i våre forsøk er MFP-3D (fra Asylum Research, Santa Barbara, California) med en samlet Nikon Ti invertert optisk mikroskop (Nikon, Melville, NY) som brukes til optisk justere sonden til cellene. Sondene brukt i denne studien var MCST-AUHW (Bruker, Camarillo, CA) med en nominell våren konstant på 0,03
N Twitter /
m
. For å forenkle kontakt geometri og minimalisere påkjenninger i sideretningen av prøven i løpet av innrykk, er cantilever spissen modifisert ved å feste et vanlig silika-mikrokule med en diameter på 4,7 um. Målinger ble utført i cellekulturmedium ved romtemperatur, med celler belagt på glass bunnen av Fluorodish. For å eliminere konfunderende effekter av nabocellene på cytoskjelettet arrangement og morfologi, ble enkeltceller målt.
Før celle målinger ble cantilever kalibrert på glasset bunnen av Fluorodish hjelp av termiske vibrasjoner metoden [29] med den resulterende termiske spektrum utstyrt med Lorentzian funksjon for å bestemme den fjærkonstant. Cellene ble rykket tilnærmet over perinukleære region av individuelle celler. Innrykket dybde ble valgt til å være minst 1 pm for bedre å kunne simulere deformasjoner som forekommer fysiologisk. Angir kraft som funksjon innrykkskurver fra hver måling ble analysert ved bruk av en Hertzian kontakt modell [30], [31] for å oppnå den Youngs modulus for hver celle. En skisse av det eksperimentelle oppsettet er vist i fig. 1
en
. Scanning elektronmikrografi av perlespissen som brukes i dette eksperimentet er vist i fig. 1
b
. Eksempler på optiske bilder som oppnås i løpet av celle hakk er vist i fig. 1,
c.
–
g
(A) Skisse av målinger på celler med AFM,
δ
er innrykk, (B) SEM bilde av den perle spissen, stivhet målinger av enkeltceller med AFM for (C) IOSE, (D) OVCAR-4, (E) HEI, (F) OVCAR-3 og (G) HEI A8 celler. Samme cantilever ble brukt; armen av cantilever har en bredde på 20 mikrometer og fungerer som en målestokk.
Fluorescens Imaging og analyse av F-aktin
Vi avbildes den merkede F-aktin nettverk av hver cellelinje ved hjelp av fluorescens mikroskopi. Celler ble dyrket på et dekkglass til en tetthet på 5000 celler /cm
2. Dekkglass med belagte celler ble plassert i en brønn i en 6-brønns plate med 2 ml cellekulturmedier. Cellene ble inkubert ved 37 ° C over natten og deretter farget med fluorokromkonjugerte konjugert phalloidin. Cellene ble farget med første fikserings med 1 ml 4% formaldehyd i PBS (pH 7,4) i 10 minutter og permeabilizing med 1 ml 0,2% TX-100, blokkering med 1% BSA i 20 minutter og inkubering i en time med 01:20 Alexa Fluor 546 phalloidin (Life Technologies, Grand Island, New York) i 1% BSA. Alle trinn under fargeprosessen ble utført ved romtemperatur i et mørkt rom. Etter farging ble cellene klemt mellom dekkglass og en glassplate som er montert med forlenge gull og forseglet med neglelakk. Flere bilder av hver cellelinje ble tatt med et Nikon Ti mikroskop (Nikon, Melville, NY) med TRITC eksitasjon /emisjon filtersett. Analysen var begrenset til enkeltceller som ikke var i kontakt med andre celler.
De strukturelle karakteristika for aktin nettverket ble analysert ved hjelp av kvantifisering av en orienteringsparameter for aktin filamenter. En to-dimensjonal Fast Fourier Transform (FFT) ble brukt til de opprinnelige fluorescens bilder ved hjelp av Matlab rutiner (De MathWorks, Natick, MA). Fra de transformerte bildet, tilpasset MATLAB-kodene beregnes vinkel amplituden av FFT ved å summere kvadratet av FFT-komponenter, fra hvilken orienteringen fordeling av aktin filamenter ble bestemt som en funksjon av vinkel. De matematiske algoritmer for beregning av retningen fordelingsfunksjonen var basert på de som tidligere er rapportert i litteraturen [32]. Fremgangsmåten er illustrert i fig. S1 i underlagsmaterialet med et representativt fluorescens bilde av en IOSE celle.
Migrasjon og Invasion Analyser
CytoSelect 24-brønn celle migrasjon og invasjon analysen kit (Cell Biolabs, San Diego, CA ) ble brukt i henhold til produsentens instruksjoner. For overføringen analysen, 1,5 x 10
5-celler i serumfritt DMEM /F12 medium inneholdende 0,5% BSA, 2 mM CaCl
2 og 2 mM MgCl
2 ble anbrakt i individuelle ubelagte innsatser med ca. 8 um pore størrelse. Innsatsene ble plassert i en 24-brønners plate inneholdende RPMI-1640 medium supplert med 10% FBS. Etter 3 timers inkubasjon ved 37 ° C i fuktet luft med 5% CO
2, cellene som migrerte til undersiden av innsatsene ble løsnet, lysert og kvantifisert ved hjelp av CyQuant GR fluorescerende fargestoff på en plateavleser ved 480 nm /520 nm (Synergy 4, BioTek, Winooski, VT). Invasjons analyser ble utført på identisk måte med 32 timers inkubering ved hjelp av basalmembran matriks-belagte innsatser. Alle analyser ble utført i tre paralleller med en innledende tidsforløp studie gjennomført for å nå betydelige sjelevandring.
microarray og Pathway berikelse analyse
RNA ble ekstrahert fra to ikke-løpende kulturer av HEY og HEY A8 celler dyrket i R10 medium ved hjelp av Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit (Applied Biosciences, Carlsbad, California) i henhold til produsentens instruksjoner og RNA integritet ble bekreftet ved hjelp av en Bioanalyzer RNA Pico Chip (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). mRNA ble merket med IVT Merking Kit (Affymetrix, Santa Clara, CA) og biotin-merket mRNA ble hybridisert på Genechip Probe Arrays U133 Plus 2.0 (Affymetrix). Affymetrix.CEL filene ble behandlet med Affymetrix Expression Console Software versjon 5.0 med RMA 3′-uttrykk arbeidsflyt. De 4,746 funksjoner med lavest 10% verdier av logaritmen av signalintensitetene i alle 4 chips ble fjernet og de resterende 49,929 egenskaper ble analysert ved å bruke Betydningen Analyse av mikromatriser (SAM) versjon 4.0 [33] med følgende parametere: Responstype: to-klasse uparet; Test statistikk: T-statistikken; Antall permutasjoner: 500; Dataene i log2 skala; Ingen median sentre. Gener ble rapportert som uttrykt forskjellig mellom HEY og HEY A8 klasser dersom de møtte følgende kriterier:. (I) False funnrate = 1,1% og (ii) absolutte ganger endring (FC) ≥1.5
Biologiske tolkninger av differensial genuttrykk data ble utført av veien berikelse analyse ved hjelp MetaCore 5,2 (GeneGO, St Joseph, MI). Betydelig forstyrrede trasé og nettverk ble identifisert ved kartlegging oppregulert og nedregulert gener (kombinert og individuelt) på GeneGO kanoniske pathway kart (samling av manuelt kuratert signalisering og metabolske veier) og GeneGO prosessnettverk (manuelt kuratert nettverksmodeller av hoved cellulære prosesser ) [34].
GeneGO kanoniske sti kart og prosessnettverk ble rangert i henhold til deres relevans til inngangen sett av gener ved hjelp av p-verdier beregnet basert på en hypergeometrisk fordeling. Multippel testing korreksjon ble utført ved hjelp av falske funnrate med adaptiv terskelen satt til å tillate mer enn en sti /nettverk feilaktig spådd så mye beriket.
Slik forlenger biologisk tolkning av differensial genuttrykk data, den topologiske betydning analyse (TSA) av genekspresjon profilen ble utført ved hjelp av nettbaserte verktøyet som GeneGO Inc (https://topology.genego.com/zcgi/topology_scoring.cgi). Dette verktøyet maps forskjellig uttrykt gener mot en GeneGO proprietær database av protein-protein interaksjoner og identifiserer proteiner som opptar topologisk betydelige posisjoner i forhold til forskjellig uttrykt gener [35], [36]. Topologisk betydelige gener (p 0,01) ble identifisert for alle gener oppregulert i HEY A8 celler i forhold til HEY celler ved hjelp av «transkripsjonsaktiveringsveier fra alle noder» algoritme og deretter tilordnet GeneGO kanoniske pathway kart som beskrevet ovenfor
.
qPCR
Valgte gener (PRKAA2, TWF1 og Mylk), identifisert av microarray analyse som signifikant forskjellig uttrykt mellom HEY A8 og HEY celler, ble validert ved hjelp av forhåndsdefinerte TaqMan® genuttrykk analyser (Life Technologies, Grand Island , New York). RNA ble ekstrahert fra 3 ikke-konfluente kulturer av HEI og HEI A8-celler (Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit) og revers-transkribert og amplifisert ved anvendelse Applause 3′-Amp system (Nugen Technologies, Inc., San Carlos, CA) ifølge produsentens instruksjoner. qPCR ble utført for hvert gen og hver prøve i 4 gjentak med termiske sykkelforhold anbefales for TaqMan® Gene Expression Master Mix og brett endre verdier mellom Hey A8 og Hey celler ble bestemt ved bruk av 2
-ΔΔCt metoden bruker GAPDH-genet som intern kontroll.
Statistical Analysis
Totalt statistisk signifikans av forskjeller i gjennomsnittlig stivhet blant celletyper ble testet ved hjelp av Kruskal-Wallis test. Betydningen av forskjellene mellom alle par av celler ble testet ved hjelp av Dunns innlegg test. Betydningen av forskjellene i migrasjon og invasjon blant IOSE, HEY og HEYA8 celler ble testet av ANOVA, etterfulgt av Tukey test for parvise sammenligninger (* p 0,05, ** p 0,01; *** p. 0,001 Kruskal-Wallis test, ANOVA og alle posttester ble utført med GraphPad Prism versjon 5.02 for Windows (GraphPad Software, San Diego, California). Sammenhenger mellom celle stivhet og celle invasivitet, celle stivhet og celletrekkegenskaper, og cellen stivhet og grad av co-justering av F-aktin ble testet ved hjelp av Pearsons produkt-moment korrelasjon og Spearmans rang korrelasjon og uttrykt som korrelasjonskoeffisienter (r og ρ, henholdsvis). korrelasjonsanalyse ble utført ved hjelp av gratis statistisk programvare R [37].
Resultater og diskusjon
Cell Stivhet er en biomarkør for Metastatisk (trekkende /invasivitet) Potensielle
Representative kraft-skår kurver innhentet fra mekanisk sondering av individuelle celler er plottet i fig. 2
et
. Hver kurve representerer den påførte kraften er nødvendig for å rykke inn en individuell eggstokkreft celle fra IOSE og HEY cellelinjer. Sondekontakter i cellen ved et innsnitt fra 0 um. Da skråningen på et punkt av hver kraft-innrykk kurve er knyttet til den celle stivhet, variasjon av bakker for hver undersøkt celle i en gitt cellelinje indikerer variasjon av stivhet mellom de enkelte celler fra samme kultur. Generelt kurver tilsvarende ikke-maligne IOSE celler har større bakker enn de tilsvarende eggstokkreft HEY celler og er derfor stivere.
(A) Box-and-whisker plott av stivhet av enkeltceller for ulike celle linjer, prosentilene er 10%, 25%, 50%, 75% og 90%, det innfelte viser representative kraft kurver av IOSE og HEY. Totalt forskjell mellom midler er signifikant (p-verdi 2,2 × 10
-16, Kruskal-Wallis); parvise forskjeller av betydning mellom IOSE og hei, hei A8 og OVCAR-3 celler, mellom HEY A8 og HEY celler og mellom HEY A8 og OVCAR-4 celler (p 0,05, Dunns innlegg test); (B) Migrasjon og invasjons tester for IOSE, hei og hei A8 celler. F (480/520) er en fluorescens intensitet på 480 nm eksitasjon og 520 nm emisjon, som er proporsjonal med antall trekkende eller invadere celler.
force kurver ble analysert med en Hertzian kontakt modell for å bestemme den tilsvarende elastisitetsmodul av individuelle celler. Vi har fastslått at Youngs modul for forskjellige ovarie epiteliale cellelinjer, inkludert ikke-ondartet IOSE og en rekke kreftcellelinjer (OVCAR-3, OVCAR-4, HEI og HEI A8). Fordelingen av Youngs modulus av individuelle celler fra forskjellige cellelinjer er avbildet i boksen og whisker plott (fig. 2
en
). IOSE viste høyere gjennomsnittlig stivhet enn noen av eggstokkreft. Den totale forskjell mellom cellelinjer var signifikant (p 2,2 x 10
-16) med følgende parene viser signifikante forskjeller (p 0,05): IOSE vs OVCAR-3, IOSE vs HEI, IOSE vs HEI A8, OVCAR- 4 vs HEY A8, og HEY vs HEY A8. De midlere Youngs modul- og standardavvik av disse cellene er oppsummert i tabell 1. De ikke-maligne IOSE celler demonstrerte høyere iboende variasjon i celle stivhet enn celler fra en hvilken som helst eggstokk-kreft cellelinje, som er konsistent med det som tidligere er rapportert høyere variasjon i stivheten godartede celler i forhold til brystkreft celler isolert fra pleural væsker [3].
spesielt, HEY og HEY A8 celler avledet fra samme tumor prøven viste [38] signifikante forskjeller i stivhet, med HEY A8 celler å være mer kompatibel (fig. 2
en
). Dette funnet er viktig i at disse isogene celler også ulik tumorigenicity i nakne mus, der HEY A8 celler er mer tumorigent etter intraperitoneal injeksjon til hårløse mus [38]. For å utforske forholdet mellom mekaniske egenskapene til disse eggstokkene cellelinjer og deres metastatiske potensial, undersøkte vi de trekkende og invasive egenskapene til HEY og HEY A8 celler i forhold til IOSE bruker
in vitro
analyser. HEY A8 celler vises størst invasiv og vandrende aktivitet etterfulgt av HEY celler og IOSE kontrollcellene (fig. 2
b
) indikerer at relativ stivhet er omvendt korrelert med indikatorene på metastatisk potensial (migrasjon og invasivitet). Disse funnene, oppsummert i fig. 3 og Tabell 2, er i samsvar med tidligere rapporter knytte mobil formbarhet med virusets tumorgene styrke og metastatisk potensial [5], [7], [33].
Datapunktene er utstyrt med strøm lov for klarhet. Feilfelt: standard feil av midler
Gene Expression profilering av HEY og HEY A8 Cells Links Økt metastatisk potensial med endringer i Actin-mediert cytoskeletal Ombygging Pathways
Etter å ha etablert. at kjøpet av redusert stivhet i HEI A8-celler i forhold til HEY celler som er korrelert med en økning i metastatisk potensial (dvs. cellemigrering og invasivitet), utførte vi en komparativ analyse av genuttrykk (DNA mikroarray) av disse to cellelinjene for å kunne få innsikt i den mulige molekylære grunnlaget for den oppkjøpte fenotype.
Ved hjelp Betydningen Analyse av mikromatriser (SAM) vi identifisert 3,641 forskjellig uttrykt funksjoner mellom disse cellelinjer (File F1) og funnet ut at 1,258 gener var oppregulert og 1,272 nedregulert i HEY A8 i forhold til HEY celler (15 gener som vises uharmoniske endringer i uttrykk mellom HEY og HEY A8 celler for redundante probe sett). Vesentlig beriket GeneGO baner (tabell 3) og prosessnettverk (tabell 4) svarende til vår sett av differensielt uttrykte gener tyder på at forskjeller mellom HEI og HEI A8 celler innbefatter endringer i den mitotiske fase av cellesyklusen (spindelenheten /kromosom separasjon, spindel mikrotubuli) , regulering av epitelial til mesenchymale overgang (EMT), cytoskeletal ombygging, celle adhesjon, og regulering av CFTR (cystisk fibrose transmembrane konduktans regulator)
Røde termometer:. gener transcriptionally opp- regulert i HEY A8 celler; blå termometer: gener transcriptionally nedregulert i HEY A8 celler; gule termometer: proteiner topologisk relevante for settet av oppregulert gener
(A) IOSE, (B) OVCAR-4, (C) HEY, (D) OVCAR-3 og (E. ) HEY A8.
(A) representant orientering fordelingsfunksjon for hver cellelinje, (B) stivhet versus grad av coalignment av F-aktin, representerer standard feil av gjennomsnittet (SEM) error bar.
for ytterligere å undersøke mulighetene biologiske betydningen av forskjellene i genuttrykk mellom HEY og HEY A8 celler, vi ansatt topologisk betydning analyse (TSA). Ved hjelp av denne tilnærmingen vi identifisert 1.108 unike Entrez Gene IDer tilsvarer topologisk relevante proteiner assosiert med up-regulerte gener i HEY A8 celler (Entrez genet IDer konverteres til 1,199 offisielle genet symboler er presentert i File S2). Betydelig beriket GeneGO trasé for disse topologisk relevante proteiner (360 trasé på FDR = 0,26%) foreslår betydelige biologiske forskjeller mellom HEY og HEY A8 celler, inkludert de som ikke kunne identifiseres på transkripsjonsnivået (Fil S3). En full diskusjon av disse resultatene er utenfor rammen av dette papir, og vil bli presentert et annet sted. Her vil vi begrense oss til disse endringene er mest relevante for de observerte forskjellene i cellen stivhet omtalt ovenfor.
Den øverste ledelsen GeneGO vei for topologisk relevante proteiner (File S3) er «TGF, WNT og cytoskeletal ombygging sti «(fig. 4). Denne veien ble også identifisert som betydelig beriket for genene nedregulert i HEY A8 celler (tabell 3). Disse funnene tyder på at forskjeller i stivhet mellom HEY og HEY A8 celler er relatert til cytoskeletal ombygging. Våre funn støtter tidligere forutsigelser at grunnlaget for redusert stivhet i forbindelse med kreft [39] og sterkt invasive celler [40] kan være forbundet med cytoskeletal remodeling. Ytterligere støtte for denne konklusjonen kommer fra TSA som finnes forskjellige isophorms av aktin-superfamilien topologisk betydning for gener oppregulert i HEI A8-celler (Fil S2), så vel som fra differensialuttrykk analyse, som fant at aktin-monomer-bindende proteiner CFL2 , TWF1 og PFN1 som regulerer inkorporering av actin monomerer i filamenter [41] er overexpressed i HEY A8 celler. Overekspresjon av cofilin-2 (CFL2) øker frekvensen av aktin filament omsetningen med depolymerisering filamenter på sine spisse ender [42] mens twinfilin (TWF1) fungerer som en aktin-monomer-sequestering protein som også kutter aktin filamenter for å fremme filament demontering
in vitro Hotell og dens rask omsetning
in vivo product: [43]. Det faktum at myosin lettkjede-kinase (Mylk), som fremmer en aktin-aktivert myosin motorisk aktivitet og spenning generasjon [44], er betydelig nedregulert i HEI A8 cellene ytterligere støtter rollen av stress fibre i observerte forskjell i celle stivhet. Interessant, BDM og ML-7, er inhibitorer av Mylk, er tidligere blitt rapportert å forårsake mykning av fibroblast-cellelinjer [45]. Fosforylering av myosinlettkjedefosfatase, stress fiberdannelse, og påfølgende økning i celle stivhet kan også induseres via RhoA /Rho-kinase pathway [46], som blir inaktivert av cAMP-avhengig proteinkinase (PKA) [47]. Vi fant ut at regulatoriske (PRKAR2A, PRKAR2B) og katalytisk (PRKACB) subenhetgenene av PKA er betydelig overuttrykt i HEY A8 i forhold til HEY celler som tyder PKA-avhengig inaktivering av RhoA /Rho kinase vei i HEY A8 celler. qPCR validering av differensial genuttrykk data fra microarray eksperiment bekreftet overekspresjon av PRKAA2 og TWF1 gener med respektive fold endringer 3,89 og 2,63 og redusert uttrykk av Mylk genet med ganger endring -2,0 i HEY A8 celler i forhold til HEY celler (fig. S2).
Mikroskopiske analyser av eggstokkreft og kontrollceller Bekreft at Actin-mediert cytoskeletal ombygging er assosiert med endring i metastatisk potensial
Siden våre molekylære analyser indikerte at aktin-mediert cytoskeletal ombygging kan være en viktig bidragsyter til de observerte forskjellene i cellen stivhet mellom HEY og de mer invasive /tumorigene HEY A8 celler, testet vi hypotesen ved å undersøke cytoskeletal strukturen HEY og HEY A8 celler i forhold til andre eggstokkreft celler (OVCAR-3, OVCAR-4) og ikke -malignant udødeliggjort på eggstokkene overflaten epitelceller (IOSE). Resultatene presentert i fig. 5 skjerm tettere, godt justert F-aktin med lengre stresset fiber i IOSE forhold til alle de eggstokkreft celler. Dette er i overensstemmelse med tidligere rapporterte sammenligninger mellom normale celler og kreftceller [5], [20].
I tillegg er graden av ko-justering av F-aktin fibrer blant de forskjellige undersøkte cellelinjer korrelert med den observerte forskjellen i celler stivhet. For eksempel, for stivere IOSE cellene, blir de aktin filamenter fordelt gjennom cellelegemet, med de fleste F-aktin bunter innrettet langs lengdeaksen av cellen med veldefinerte spennings fibre og fokale kontakter. I motsetning til dette, aktin filamenter i de mykere eggstokkreft celler er mindre organisert og F-aktin bunter er orientert tilfeldig med forstyrret, korte segmenter. I OVCAR-4-celler, blir aktin filamenter innrettet bare lokalt og danner et sammenfiltret nettverk. I HEY celler, aktin filamenter bryte seg inn i kortere segmenter og vise redusert co-justering. F-aktin i OVCAR-3-celler opprettholder en cortical struktur med de fleste filamenter som ligger i den perifere region av cellen, selv ved en forholdsvis lav densitet. HEY A8-celler viser lignende karakteristikker av F-aktin fordeling i Hey-celler, men med en lavere tetthet. Siden aktin cytoskjelettet bidrar til de mekaniske egenskapene til cellene, observerte variasjonene er i samsvar med forskjeller i celle stivhet og med tidligere rapporter [8], [19].
analysert kvantitativt graden av ko-innretting av F-aktin i alle de fem cellelinjer ved å benytte orientering fordelingsfunksjonen. Resultatene er vist i fig. 6
en
. En parameter
D
, definert som ble anvendt for å kvantifisere graden av ko-justering av F-aktin fra den orientering fordelingsfunksjoner, hvor
P (θ)
representerer orienteringen fordelingsfunksjonen, hvilken er sannsynligheten for en fiber orientert ved vinkelen
θ
i fluorescens bildet.
P
0 (θ)
er orienteringen fordelingsfunksjonen for det ekstreme tilfellet hvor F-aktin er helt tilfeldig fordelt og har derfor en verdi av
P
0 (θ) =
1/180. I det ekstreme tilfelle hvor alle aktin fibrene er orientert tilfeldig uten noen preferanse, bør retningen fordelingsfunksjonen være en konstant og uavhengig av vinkelen. Fra definisjonen av
D
, en høyere verdi av
D
indikerer en økende avvik fra tilfeldig innretting, og en høyere grad av co-justering av F-aktin. Orientering distribusjoner av F-aktin varierer blant de fem eggstokkcellelinjer (Fig. 6
en
). I ikke-maligne IOSE celler, ble det meste av F-aktin bunter innrettet langs lengdeaksen av cellen, som er ~135 °. I motsetning til dette, OVCAR-4-celler viser flere orienteringer av F-aktin, noe som indikerer at aktin filamenter er hverken jevnt på linje, heller ikke jevnt fordelt. Dette resultat er åpenbart fra den fluorescens bildet i fig. 5. Forholdet mellom graden av ko-justering av F-aktin og stivhet i én celle er plottet i fig. 6
b
, som viser sterk og signifikant positiv korrelasjon (r = 0,99834 med p-val = 8,064 × 10
-5 og ρ = 1 med p-val = 0,01667). Dette resultatet tyder på at endringer i ko-justering av F-aktin bunter kan også bidra til forskjeller i cellestivhet innenfor de undersøkte ovarie cellelinjer.
Konklusjoner
Vår analyse av ikke-ondartet IOSE og fire ovarialcancer cellelinjer indikerer at kreftcellene oppviser et lavere midlere stivhet i forhold til ikke-maligne forløperceller. Interessant, finner vi også at økningen i invasiv og vandrende kapasitet forbundet med HEI A8-celler i forhold til HEY celler er også korrelert med en signifikant reduksjon i celle stivhet. Komparativ analyse av genuttrykk av HEY A8 og HEY celler indikerer at det molekylære grunnlaget for reduksjonen i stivhet mellom disse cellene er reflekterende av omfattende molekylære endringer, inkludert endringer i aktin cytoskjelett ombygging veier. Mikroskopiske analyser av aktin cytoskjelettet i eggstokkreft og kontrollcellene er i overensstemmelse med denne hypotesen.
Siden våre målinger blir utført med kreftcellelinjer, vil videre studier være nødvendig for å se om lignende resultater er funnet i tilfellet med pasienten avledede celler. Etablering av den relative metastatisk potensial av kreftceller er en viktig faktor i utformingen av optimale strategier i personlig behandling av kreft [48]. For tiden er utstrakt molekyl profilering som kreves for å beregne den metastatisk potensial av kreftceller [49]. Kollektivt, våre resultater indikerer at mekanisk stivhet kan være et nyttig biomarkør i utvikling av nøyaktige og ikke-invasive kliniske metoder for å evaluere den relative metastatisk potensial av ovarier og kanskje andre typer kreftceller.
