Abstract
PBX1 er en fortelling homeodomain transkripsjonsfaktor som er involvert i organ og tumorigenesis. Selv om det er blitt vist at ovarie, bryst, melanoma og kreftceller er avhengige av PBX1 for cellevekst og overlevelse, den molekylære mekanismen for hvordan PBX1 fremmer tumorgenese er fortsatt uklar. Her har vi brukt en integrert tilnærming ved å overlappe PBX1 ChIP-chip mål med PBX1 regulerte transkriptomet i eggstokkreft celler for å identifisere gener som transkripsjon var direkte regulert av PBX1. Vi er fast bestemt videre hvis PBX1 målgener identifisert i eggstokkreft celler ble co-overexpressed med PBX1 i carcinoma vev. Ved å analysere TCGA genekspresjon microarray datasett fra eggstokkene serøs karsinom, fant vi co-oppregulering av PBX1 og et betydelig antall av sine direkte målgener. Blant de PBX1 målgener, ble en homeodomain protein MEOX1 hvis DNA-bindingsmotiv ble beriket i PBX1-immunoprecipicated DNA-sekvenser valgt for funksjonell analyse. Vi demonstrerte at MEOX1-proteinet reagerer med PBX1 protein og hemming av MEOX1 gir en lignende veksthemmende fenotype som PBX1 undertrykkelse. Videre ectopically uttrykt MEOX1 funksjonelt reddet PBX1-trukket effekt, noe som tyder MEOX1 formidler cellevekst signal om PBX1. Disse resultater viser at MEOX1 er en kritisk målgen og kofaktor PBX1 i ovariekreft
relasjon:. Thiaville MM, Stoeck A, Chen L, Wu R-C, Magnani L, Oidtman J, et al. (2012) Identifisering av PBX1 målgener i kreftceller av Global Kartlegging av PBX1 bindingssteder. PLoS ONE 7 (5): e36054. doi: 10,1371 /journal.pone.0036054
Redaktør: Jindan Yu, Northwestern University, USA
mottatt: 9 desember 2011; Godkjent: 26 mars 2012; Publisert: 02.05.2012
Copyright: © 2012 Thiaville et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av American Cancer Society stipend RSG-08-174-01-GMC og NIH /NCI tilskudd: R01CA148826, R01CA103937, R01CA129080, og U24CA160036. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Pre-B-celle leukemi homeobox-en product: (
PBX1
) tilhører tALE (tre-amino-syre sløyfe forlengelse) familie av atypiske homeodomain proteiner, som medlemmer er preget av en tre-rest innsetting i første helix av homeodomain [1]. PBX1-proteinet reagerer med andre homeodomen-inneholdende kjerneproteiner så som HOX og MEIS for å danne heterodimere komplekser transkripsjon. Biokjemiske undersøkelser har vist at PBX1 og HOX kommuniserer gjennom kontakter mellom PBX1 homeodomain og en konservert heksapeptid sekvens i HOX-proteinet [2]. Røntgenkrystallografiske undersøkelser har videre vist at PBX1-HOXB1 dimerisering formidles ved binding av HOX heksapeptid til en lomme i PBX1 plassert mellom tre-rest innsetting og den tredje spiralen av den PBX1 homeodomain [3]. Den heterodimerisering av PBX1 og HOX samarbeide regulerer affinitet og spesifisitet av deres binding til målet DNA-sekvenser [4], [5].
Gitt sin kritiske rolle i transkripsjonsregulering, kommer det ikke som noen overraskelse at PBX1 er involvert i en rekke biologiske prosesser fra celle skjebne bestemmelse under organ til utviklingen av humane cancere [6], [7], [8]. Ekspresjon av PBX1 er tid og rom reguleres for å kontrollere organutvikling av milt, bukspyttkjertel, nyre, binyre, og skjelett [9], [10], [11], [12], og er implisert i utviklingen av Mullerian kanalen som senere utvikler seg til det kvinnelige kjønnsorgan [13].
Emerging resultater har antydet en rolle PBX1 i menneskelig kreft. Den PBX1-HOX-heterodimer-komplekset ble funnet å bidra til onkogene aktivitet i brystkreft og melanom. En dominant negativ PBX1-protein eller HOX heksapeptid motiv som avbrutt interaksjonen mellom PBX1 og HOX ble funnet å redusere spredning av disse kreftceller [14], [15], [16], [17]. Dessuten fungerer PBX1 som en pioner faktor i brystkreft, ombygging kromatinet å favorisere rekruttering av østrogen reseptor alfa (ERA) [18]. PBX1 har også blitt vist å være en nedstrøms effektor av Notch signalveien, som ofte aktivert i ovarie, cervix, og visse typer av brystcarsinomer [8], [19], [20]. I lys av den potensielle rolle PBX1 i ulike krefttyper, identifisere PBX1 transkripsjon målgener i kreftceller er avgjørende for å belyse sine onkogene mekanismer. I denne studien, utførte vi en integrert analyse for å identifisere gener som promotorene ble okkupert av PBX1 protein og hvis ekspresjon nivåer ble regulert ved PBX1. Vi har fokusert på en PBX1 direkte målet genet,
MEOX1
, og viste sitt engasjement i PBX1-mediert tumorcellevekst samt sin direkte interaksjon med PBX1.
Resultater
Global kartlegging av PBX1 bindingsseter i eggstokkreft celler
Siden PBX1 er en kjernefysisk transkripsjon faktor som binder seg til spesifikke arrangører, vi søkt å identifisere PBX1 bindingsseter i menneske kreft genom hjelp chIP-chip analyser. En ovarial cancer-cellelinje, OVCAR3, ble valgt fordi denne cellelinjen ble tidligere rapportert å overuttrykke PBX1, og var avhengig av PBX1 uttrykk for cellenes overlevelse [8]. PBX1 bundne DNA-fragmenter beriket av Chip ble hybridisert til et menneske promoter array som inneholder 18,028 genet arrangører, som representerer totalt 24,659 transkripsjoner. IgG ble anvendt som en negativ kontroll i en parallell immunutfelling. Eventuelle positive topper overlappende de fra IgG-kontroll ble ekskludert fra PBX1 topp listen. Ved hjelp av en falsk funn ratio (FDR) ≤0.2 identifiserte vi 2299 unike arrangører som viste betydelige PBX1 forpliktende signaler (Tabell S1). Brikken-chip data ble deretter anvendt for å beregne PBX1 toppen bindingsfordeling over hele promotorområdene, og vi har funnet at PBX1 bindingssetene fant sted over hele promotorområdene (fig. 1). Vi utførte også spon chip for å bestemme fordelingen av RNA-polymerase II, H3K4me3, og H3K27me3 i promoter-regioner (fig. 1), og testet for deres promoter samtidig forekomst med PBX1 mål. Resultatene indikerte at PBX1 promoter binding samtidig forekom med alle tre testede markører, med PBX1-RNA-polymerase II er den mest betydnings samtidig forekomst par (tabell S2). Det var ingen signifikant samtidig forekomst mellom H3K4me3 og H3K27me3, noe som indikerer at disse to histon merkene er bundet til promoterene fra et distinkt sett av gener.
histogrammer viser fordelingen av toppen binding frekvens med hensyn til deres posisjon på arrangører (x-aksen). Binding frekvens som vist på y-aksen er bestemt av antallet av topp bindende hendelser på bestemte steder promotor. TSS. Transkripsjon start stedet
Potensielle kofaktorer samarbeider med PBX1
Ved å analysere DNA-sekvenser beriket av PBX1 chip, cis-regulatoriske kofaktorer av PBX1 kunne identifiseres ved å skanne DNA bindende motiver av de tidligere karakteriserte transkripsjonsfaktorer. Den web-basert applikasjon Cistrome ble ansatt for denne analysen (https://cistrome.dfci.harvard.edu/ap/). Den kanoniske PBX1 bindende motiv ble funnet å være blant de betydelig beriket sekvensmotiver (figur 2 . Tabell S3). En opptegning av avstanden mellom PBX1 binding og dens forutsagte motiv avslørte en normal (klokkeformet) fordeling (fig. S1). I tillegg til PBX1 motiv, ble GATA1, FOSL1, og JUNB transkripsjonsfaktorer motiver betydelig beriket, noe som tyder på sitt potensial engasjement med PBX1 i transkripsjon regulering. Videre er det motiv av MEIS1 som er et velkjent kofaktor PBX1 og «TAATTA» motiv for både MEOX1 og HOX var også anriket på PBX1 chiped sekvenser.
Utvalgte eksempler på transkripsjonsfaktorbindende motiver som er statistisk beriket i PBX1 immunopresipitert DNA-sekvenser
PBX1 direkte-regulert transkriptomet
Transkripsjonsfaktorer faktorer~~POS=HEADCOMP kan fungere direkte samt av lang eller indirekte mekanismer.; dermed, for å identifisere gener som transkripsjon var direkte regulert av PBX1, overlappet vi PBX1 regulerte transkriptomet med PBX1 ChIP-chip målgener. Den PBX1 transkriptomet ble identifisert ved å sammenligne uttrykk microarray data mellom PBX1 siRNA-behandlede og kontroll siRNA-behandlede OVCAR3 celler. Knockdown effektiviteten av PBX1 siRNA ble validert av Western blot (fig. S2). Vi identifiserte 2,094 unike gener hvis uttrykk nivåene ble betydelig regulert av PBX1 (FDR 0,01). De kanoniske signalveier beriket i PBX1 transkriptomet inkluderer Wnt signal, insulin receptor signalering, og caveolar endocytose signale (tabell S4).
Overlappende PBX1 ChIP-chip målgener og PBX1 transkriptomet identifisert 195 gener som var potensielle PBX1 direkte målgener (fig. 3A og tabell S5). Vi har videre analysert fordelingen av PBX1 brikke målgener med hensyn til endringer i transkriptomet i OVCAR3 celler behandlet med PBX1 siRNA. Vi var i stand til å vise en betydelig berikelse av PBX1 chip mål bare blant genene nedregulert etter PBX1 siRNA behandling (fig. 3B). Derimot ble PBX1 Chip målene ikke beriket i up-regulert gener eller gener som uttrykk var uendret (FDR 0,01). For å avgjøre potensialet transkripsjon co-regulering for PBX1 målgener, ble de 195 identifiserte gener kledde med chip datasett inneholder modifiserte histone merker (se ovenfor). Resultatene viste at de fleste (~70%) av PBX1 målgen promotorer inneholdt også H3K4me3 men bare ca. 2% av PBX1 målgen promotere inneholdt H3K27me3 (fig. S3 og Q kolonne i tabell S5). Statistiske tester viste at 195 presumptive PBX1 målgener vesentlig co-forekom med H3K4me3 og RNA-polymerase II, men ikke med H3K7me3 (tabell S2). Samlet utgjør disse resultatene indikerte at PBX1 var nødvendig for aktivt uttrykk av målet gener og arrangører av sine mål gener ble ofte opptatt med H3K4me3, en histon mark forbundet med aktivt å transkriberte gener
A:. Venn-diagram av PBX1 chIP-chip målgener og PBX1 transkriptomet avslører et sett med overlappende gener som er direkte målgener av PBX1. Den fullstendige listen over de overlappende gener er vist i tabell S5. Forsøk ble utført i OVCAR3 celler. B: Gene sett anrikning analyse ble utført for å bestemme om PBX1 brikke mål blir anriket på PBX1 transcriptome. Gener nedregulert ved PBX1 siRNA er betydelig anriket i PBX1 ChIP målet sett.
Syv representative kandidater, basert på deres kjente funksjoner i kreft biologi, ble valgt ut fra de 195 kandidat PBX1 mål for godkjenning ved qPCR. Resultatene bekreftet spesifikk binding av PBX1 til promoterne analysert (fig. 4A), og bekreftet utskrift ned-regulering i respons til PBX1 knockdown for hver av disse analyserte genene (Fig. 4B).
A. Syv gener ble valgt fra PBX1 ChIP målet genet liste, og innkvartering av hver arrangøren av PBX1 ble validert av Chip-qPCR analyse. Brikken ble utført ved anvendelse av enten IgG eller anti-PBX1-antistoff, og immunutfelt DNA ble underkastet qPCR-analyse ved anvendelse av primere som flankerer toppen av PBX1 bundet regionen. B. Transkripsjonell regulering av disse målgener ved PBX1 eller MEOX1 ble vurdert ved hjelp av siRNA og RT-qPCR analyse. Uttrykk for alle syv mål gener er betydelig nedregulert ved PBX1 siRNA i forhold til å kontrollere siRNA (Student
t
-test,
p
0,01). Bortsett ZHX2, MEOX1 siRNA betydelig nedregulert uttrykk for de testede genene (Student
t
-test,
p
0,01). C. ChIP-qPCR validering av GATA1 og MEOX1 bindende nær PBX1 bundne sekvenser. Brikken ble utført ved anvendelse av IgG, anti-GATA1, eller anti-MEOX1 antistoff og immuno-DNA ble underkastet qPCR ved hjelp av samme primere som ved A. Med unntak for binding av MEOX1 til
ZHX2
promoter, binding av GATA1 eller MEOX1 til genet arrangører er betydelig høyere enn binding av IgG til de samme arrangører (Student
t
-test,
p
0,01).
for å finne ut hvis potensielle PBX1 kofaktorer identifisert fra motivet analysen beskrevet ovenfor co-skje med PBX1 bindende i promotorområdene, utførte vi chip qPCR for GATA1 og MEOX1 bruker PCR primere flankerer toppen bindende sekvenser av PBX1. Western blot analyse viste at begge transkripsjonsfaktorer ble uttrykt i OVCAR3-celler (fig. S4A). ChIP-qPCR viste at GATA1 bundet til alle de testede arrangører og MEOX1 var til stede i seks av syv testet arrangører (Student
t
– test,
p
0,01; fig 4C.).
Korrelasjon av PBX1 og målet genuttrykk i eggstokkreft vev
for å ekstrapolere den biologiske betydningen av PBX1 målgener identifisert i OVCAR3 cellelinje med hensyn til menneskelige kreft vev, utførte vi
i silico
analyse ved hjelp av en offentlig tilgjengelig uttrykk mikromatriser datasett [21] for å finne ut om PBX1 uttrykk var korrelert med sine målgener i 9 forskjellige typer karsinom vev. Totalt 86 kandidat PBX1 målgener ble identifisert i microarray datasettet [21], og disse genene ble spørres i Oncomine. Resultatene viste at ovarialcancer har et høyt nivå av PBX1 ekspresjon sammenlignet med de andre 8 typer kreft (Fig. 5). Videre er 28 av de 86 spørres genene var signifikant oppregulert i eggstokk-kreft i forhold til andre karsinomer (
p
0,05).
Oncomine meta-analyse ble utført på en tidligere publisert genuttrykk mikromatriser datasett som inneholder ni forskjellige krefttyper. Gener ble rangert etter sin over-uttrykk i eggstokkreft og de beste 18 gener ble plottet.
Den nylig tilgjengelig TCGA eggstokkreft serøs kreft datasett tillatt oss å utføre statistisk analyse for å fastslå co-oppregulering av PBX1 og dets mål gener i eggstokkene karsinomer. Blant 195 potensielle PBX1 målgener, ble utført videre analyse på totalt 137 for hvem genuttrykk data var til stede i alle de tre forskjellige microarray plattformer tilgjengelig fra cBio Cancer Genomics Portal (https://www.cbioportal.org/public-portal /). Blant disse 137 PBX1 målgener, 53 gener viste en tendens mot co-oppregulering med PBX1 (odds ratio 1,5), hvorav 18 (13,1%) var signifikant (
p
0,05). Dette er høyere enn det som forventes ved en tilfeldighet (
p
= 0,013, Chi-square test), for å påføre den samme analyse for hele settet med 11,201 gener som er tilgjengelige for analyse viste at kun 873 (7,8%) gener viste både en odds ratio større enn 1,5 og
p
0,05. Den odds ratio og betydning (
p
-verdi) for co-oppregulering av PBX1 og dets mål gener er vist i tabell S5 kolonner H og I, henholdsvis.
MEOX1 samhandler direkte med PBX1 og redder PBX1-trukket effekt
Vi har valgt
MEOX1
, en av de direkte målene for PBX1, for ytterligere funksjonelle studier. Som PBX1, er MEOX1 en homeodomain protein og kan potensielt samhandle med PBX1 å danne heterodimere transkripsjons komplekser. Derfor spurte vi om MEOX1 og PBX1 fysisk interaksjon i cellene. En co-immunoprecipitation Forsøket ble utført i HEK293 celler transfektert med PBX1-V5 og MEOX1-FLAG cDNA ekspresjonsvektorer. Resultatene viste at PBX1 pull-ned ved hjelp av en V5-antistoff vesentlig anriket MEOX1 protein påvises ved hjelp av Western blot med et FLAG antistoff (Fig. 6A). Gjensidig samarbeid immunoprecipitation bekreftet at MEOX1 co-immunopresipitert med PBX1 (Fig. 6A).
A. HEK293 celler ble transfektert med PBX1-V5 og /eller MEOX1-FLAG ekspresjonsvektorer. Immunutfelling og Western blot ble utført ved anvendelse av epitop tag-spesifikke antistoffer. B. Venstre panel: OVCAR3 celler ble transfektert med MEOX1 ekspresjonsvektor eller kontroll vektor. Western blot ble utført for å teste MEOX1 uttrykket (øverst). De samme celler som ble transfektert med PBX1 siRNA eller kontroll siRNA og Western blot ble utført for å teste nedregulering av PBX1 protein (i midten). Påvisning av GAPDH-protein ble anvendt som en lastekontroll (nederst). Høyre panel: Relative celletall ble målt i OVCAR3 celler transfektert med MEOX1 cDNA, PBX1 siRNA, kontroll plasmid (pLPC), og kontrollere siRNA (siLuc). Elevens
t
-test ble benyttet for å bestemme betydningen mellom MEOX1 over-uttrykt gruppen og kontrollgruppen.
Vi har også testet et panel av PBX1 regulerte gener for å avgjøre om MEOX1 var involvert i å regulere deres transkripsjon. Ved hjelp MEOX1 siRNA, fant vi at uttrykk for seks av de sju PBX1 regulerte gener var også avhengig av MEOX1. I tillegg fant vi at
PBX1
transkripsjon var avhengig MEOX1, som MEOX1 siRNA redusert
PBX1
mRNA nivå. Gjensidig,
MEOX1
mRNA nivået ble nedregulert av PBX1 knockdown. Tidligere studier har vist at PBX1 var avgjørende for cellevekst i eggstokkreft celler inkludert OVCAR3; her, utførte vi siRNA knockdown for å fastslå om MEOX1 knockdown produsert en fenotype som ligner på PBX1 knockdown. Resultatene viste at MEOX1 knockdown cellevekst betydelig redusert i OVCAR3 celler, en fenotype som ligner PBX1-trukket effekt (Fig. S5).
For å teste om MEOX1 mediert cellevekst funksjon PBX1, uttrykte vi MEOX1 konstitutivt (drevet av en CMV promoter) og undertrykte PBX1 uttrykk ved hjelp siRNA. Vi fant ut at konstituerende MEOX1 uttrykk delvis beskyttede celler fra PBX1 tilbaketrekking-indusert veksthemming, som betydelig større antall celler ble observert i MEOX1-transfekterte celler sammenlignet med kontroll plasmid-transfekterte celler (Fig. 6B). Disse funnene tyder på at MEOX1 er en viktig formidler av den PBX1 relaterte vekst signal, selv om uttrykk for MEOX1 seg selv er ikke tilstrekkelig for å stimulere celledeling (Fig. S6).
Diskusjoner
homeobox genfamilie, som er kritisk i transkripsjonsregulering, koder for kjerneproteiner som inneholder høyt konserverte DNA- bindende homeodomains [22]. Homeobox proteiner er involvert i kritiske aktiviteter under utvikling og tumorigenesis. I denne rapporten har vi fokusert på en av de homeobox gener, PBX1, som ble funnet å spille en avgjørende rolle i eggstokkreft, med den hensikt å identifisere og karakterisere sin transcriptional nettverk i kreftceller. Integrering analyse av genet arrangører bundet av PBX1 og PBX1 transkriptom mulig for oss å identifisere gener direkte regulert av PBX1.
robusthet av vår genome-wide ChIP-chip-analysen er dokumentert av den observasjon at den kanoniske PBX1 motivet er høyanriket i PBX1 chiped sekvenser. Vi har vist at 195 PBX1 Chip mål betydelig overlappet med arrangøren belegg av RNA polymerase II og H3K4me3, en histon mark knyttet til aktiv transkripsjon, men ikke med H3K27me3, en histon mark i forbindelse med transkripsjon undertrykkelse. I tillegg fant vi at chip målene ble betydelig beriket bare blant gener hvis transkripsjon er støttet av PBX1 (nedregulert ved PBX1 siRNA), men ikke blant gener hvis transkripsjon er undertrykt eller ikke påvirket av PBX1. Disse data tatt sammen støtter det syn at PBX1 fungerer først og fremst som en transkripsjonen aktivator i stedet for en repressor i eggstokkreft celler.
Den aktuelle studien også avdekket potensielle cis-regulatoriske kofaktorer av PBX1, som inkluderer GATA1, FOSL1, MEIS1 , JUNB, og en «TAATTA» motiv for MEOX1 [23] og HOX [24]. Motivene av disse transkripsjons kofaktorer ble betydelig anriket i PBX1-bundet sekvenser, noe som tyder på at disse proteinene kan fungere i samspill med PBX1 å lette transkripsjonsregulering. Interessant, flere av disse potensielle PBX1 kofaktorer, inkludert BCL6 og MEOX1, ble også identifisert som blir direkte regulert av PBX1, noe som tyder på en auto-regulerende transkripsjonen kontroll av disse genene. Den aktuelle studien fokusert på MEOX1 å vurdere sin co-binding og co-regulerende aktivitet med PBX1. Ytterligere eksperimenter skal utføres for å finne ut om andre kofaktorer tjene som co-regulatoriske forhold med PBX1 i kreftceller.
Et annet spennende funn i denne studien er identifisering av en ny rolle MEOX1 i kreft patogenesen. Selv MEOX1 er godt etablert som en av de viktigste transkripsjons regulatorer under embryoutvikling, våre resultater viser at MEOX1 er også involvert i kreftutvikling gjennom deltakelse i PBX1 transcriptional nettverk. Det faktum at MEOX1 er ko-oppregulert med PBX1 i en undergruppe av ovariekarsinomer (fig. 5) antyder at en PBX1-MEOX1 molekyl aksen er involvert i den transkripsjonelle regulering av disse karsinomer. Basert på denne begrunnelsen, utførte vi en «redde» analysen av ectopically uttrykke MEOX1 i kreftceller med PBX1 knockdown. Vårt resultat viser at MEOX1 uttrykk snudd den veksthemmende virkning av PBX1 knockdown antyder at MEOX1 formidler vekst bærende funksjon PBX1 i eggstokkreft celler. Både PBX1 og MEOX1 tilhører homeodomain familie, hvis medlemmer vanligvis samhandle med andre homeodomain proteiner for å generere heterodimere proteinkomplekser som er de funksjonelle mediatorer av transkripsjonsregulering. Faktisk vår co-immunoprecipitation eksperiment viste samspill av PBX1 og MEOX1 proteiner, noe som tyder på at MEOX1 kan være en kritisk homeodomain kofaktor PBX1. Således synes PBX1 å virke ikke bare som et oppstrøms-regulator, men også som et bindende kofaktor MEOX1. Dette funnet er minner om en tidligere studie som viser at PBX1 og HOXB1 samarbeide i regulering HOXB1 uttrykk aktivitet i mus vev [25]. Det kan tenkes at denne positive auto-reguleringssløyfe opererer for å sikre vedvarende transkripsjonen aktivitet av andre PBX1 regulert gener.
Resultatene som presenteres her representerer et første skritt mot å forstå den komplekse regulatoriske nettverk av PBX1 i karsinomer. Som rolle PBX1 i humane solide svulster vokser frem, vil målgener direkte kontrollert av PBX1 rapportert her tjene som fotspor for å tyde hvordan PBX1 bidrar til kreftutvikling. Denne studien reiser også flere viktige spørsmål som ennå ikke er adressert. For eksempel ville det være interessant å teste om PBX1 regulert gener identifisert i ovarialcancer deles med maskiner i drift i løpet av organutvikling. Siden overekspresjon av PBX1 og MEOX1 er relativt spesifikk for eggstokkreft sammenlignet med andre solide tumorer (Fig. 5), den biologiske betydningen av PBX1 og MEOX1 co-uttrykk og deres samarbeid i transkripsjonsregulering er sannsynlig å være kontekst og vev-avhengige . Fra dette perspektivet, vil det være viktig å finne ut om MEOX1 modulerer selektivitet og målsekvens bindende affinitet av PBX1 transkripsjon kompleks i eggstokkreft, og til slutt, ville det være interessant å finne ut hvordan PBX1 /MEOX1 kompleks formasjon fremmer onkogenese.
Materialer og metoder
celle~~POS=TRUNC linjer~~POS=HEADCOMP
De cellelinjer som brukes i denne studien inkluderte en eggstokkreft cellelinje, OVCAR3, og en embryonale nyre epitel cellelinje, HEK293. Begge cellelinjer ble kjøpt fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, Virginia). Cellelinjene ble opprettholdt i RPMI1640 supplert med 5% føtalt bovint serum og antibiotika. Det var ingen tegn på mycoplasma forurensning basert på en PCR-analyse.
Chromatin Immunpresipitasjon (chip) Analyse
For hver immunoprecipitation, ca 12 × 10
6 OVCAR3 celler ble brukt. Celler ble sådd ut i 150 mm skåler og dyrket til 80% sammenflytende. Celler ble fiksert ved tilsetning av formaldehyd (1% sluttkonsentrasjon) til dyrkingsmedier og inkubering i 10 min. Reaksjonen ble stanset med 125 mM glycin i 5 min. Celler ble vasket i DPBS, ble atomkjerner svellet i kjerner svellende buffer (5 mM PIPES pH 8,0, 85 mM KCl, 0,5% NP 40), og lysert i kjerner lyseringsbuffer (1% SDS, 10 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl , pH 8,0). Lysert kjerner ble ultralydbehandlet i en Fisher modell 100 ultralyd i 5 sykluser med 40 sek konstant puls med 2 min is inkubasjon i mellom pulser. Sonikerte lysater ble fortynnet i ChIP fortynningsbuffer (0,01% SDS, 1,1% Triton X-100, 1,2 mM EDTA, 16,7 mM Tris-HCl, pH 8,0, 167 mM NaCl) og inkubert med protein G Sepharose (Invitrogen) i 1 time. Kulene ble fjernet, og vulsten erte lysater ble inkubert med antistoffer mot PBX1, GATA1, eller MEOX1 (Santa Cruz sc-899, SC-265 x, og Epitomics T2204, henholdsvis) over natten med rotasjon ved 4 ° C. En 01:01 oppslemming av BSA-blokkerte Protein G-Sepharose ble tilsatt til antistoff inkubert lysatene og rotert ved 4 ° C i 2-3 timer. Antistoff-proteinkomplekser som er bundet til kulene ble vasket en gang med lav saltbuffer (0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl), en gang med LiCl-buffer (0,25 M LiCl, 1% NP 40, 1% natriumdeoksykolat, 1 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl, pH 8,0), og to ganger med TE, pH 8,0. Kompleksene ble eluert fra kulene ved inkubering i 1% SDS, 0,1 M NaHCO
3 (oppvarmet til 65 ° C) i 30 minutter ved 37 ° C med risting. Prøvene ble behandlet med 200 mM NaCl og 1 pg RNase A ved 65 ° C over natten. Etter 1 time proteinase K-behandlingen ved 37 ° C, ble DNA renset ved anvendelse av Qiagen QIAquick PCR-rensesett og eluert i 100 ul TE.
For qPCR-analyse, 2,5 ul prøve ble anvendt pr reaksjon. PCR ble utført ved anvendelse av SYBR grønn farge og en iCycler (Bio-Rad, Hercules, CA). Den terskel syklusnummer (CT) ble oppnådd ved bruk av iCycler Optisk system grensesnitt-programvaren. PCR-primere ble utformet ved bruk av primer 3-programmet (Nukleotidsekvensene av primerne er vist i tabell S6). Data ble normalisert ved anvendelse av en standardkurve, som ble fremstilt fra sonikert inngang (total) DNA.
chip chip rekke analyse
til spon-chip rekke analyse, brikken ble utført som beskrevet ovenfor, bortsett for DNA-rensetrinn. DNA ble renset ved anvendelse av Qiagen MinElute PCR kit rensing og eluert med 10 ul H2O. Hele immunopresipitert DNA-prøven ble amplifisert ved anvendelse av en WGA2 kit (Sigma) og renset ved anvendelse av Qiagen QIAquick PCR-rensesett med et elueringsvolum på 40 ul i H2O. Om inndata DNA, ble 200 ng av renset DNA som anvendes for WGA2 PCR. En alikvot av hver amplifiserte prøve ble fortynnet til 5 ng /mL og anvendt for qPCR. Hvis 4 ug av DNA som ikke ble fremstilt fra WGA2 PCR, ble 10 ng av WGA2 reaksjonen reamplifisert ved hjelp av WGA3 kit (Sigma), og testet med kontroll primere igjen. Porsjoner av hver prøve (4 mikrogram) ble sendt til NimbleGen for merking og rekke hybridisering. Den NimbleGen 385K RefSeq promoter 1-plex matrise ble brukt for prøven hybridisering.
For rekke analyse, ble det NimbleGen programsignalet kart anvendes for å oppnå signal topper for hver prøve og for å kartlegge disse toppene til deres tilsvarende genomiske regioner. Bruke Bioconductor pakken GenomicRanges (tilgjengelig på bioconductor.org), vist vi peak områder fra mål ChIP-chip med FDR≤0.2 for overlapping med topper fra ikke-spesifikk IgG chip chip og forkastet de toppene med minst én bp overlapping. De resterende topper fra mål ChIP-chip ble ansett som positivt for proteinbinding.
Motif søke analysene ble utført ved hjelp av seqpos motiv oppdagelsen verktøy (Cistrome, https://cistrome.org/ap/root) og TRANSFAC motiv database med følgende parameter: bredde fra toppen som skal skannes = 600 bp;
p
. 0,05 ble satt som cutoff for betydningen
Gene Expression Array Analyse
RNA ble isolert fra OVCAR3 celler som tidligere ble behandlet med enten PBX1 siRNA eller kontroll siRNA rettet mot luciferase genet. RNA merking, hybridisering til Illumina menneskelige HT-12 Expression Array, og normalisering analyse ble utført av Lowe Family Genomics Core-anlegget, Johns Hopkins Bayview Medical Center. Folden endring av ekspresjonsnivået av hvert gen ble beregnet som forholdet mellom PBX1 siRNA behandling for å kontrollere. Så det var bare ett array på hvert tidspunkt, brukte vi logaritmen av ganger endring som testobservator, og gjennomførte betydning analyse for å beregne
p
-verdi, som ble definert som sannsynligheten for å få en test statistikk minst like ekstrem som den faktisk observert under nullhypotesen. For null distribusjon vi antok testobservatoren fulgt en normalfordeling der gjennomsnitt og standardavvik ble beregnet fra kontrollprøvene. Vi har også implementert Benjamini og Hochberg prosedyre [26] for flere hypotesetesting, og beregnet den falske funnraten (FDR) for betydelig uttrykte gener. Betydelig oppregulert og ned-regulert gener ble endelig bestemt av en forhåndsdefinert FDR cutoff. 0,01
Statistiske test for genet overlapping mellom rekke datasett
For å vurdere betydningen av overlapping mellom datasett (dvs. mellom chip-chips og mellom 195 målgener og chip-chip), bestemt vi sannsynligheten for å få like mange eller flere overlappende gener ved tilfeldig prøvetaking fra hele settet av gener. Antall gener i hele settet var 18 511 for chip chip og 30500 for uttrykk array.
p
-verdi ble beregnet ved å bestemme de øvre hale sannsynlighetene for den tilsvarende hypergeometriske fordelingen hjelp phyper () -funksjonen i R-versjon 2.14.1.
Statistiske test for co-uttrykk mellom PBX1 og sine mål gener
Z-score av mRNA uttrykk data fra TCGA eggstokkreft studien ble hentet fra kreft~~POS=TRUNC Genomics data Server (CGDS) arrangert av Memorial-Sloan-Kettering Cancer Center (http: //www. cbioportal.org/) ved hjelp av CGDS-R 1.1.19 pakken (https://cran.r-project.org/web/packages/cgdsr/index.html). Z-score ble beregnet ved hjelp av diploide tumorer (diploide for hvert gen) som referansegruppen, og bare gener som representeres ved alle de tre uttrykk plattformer brukes i TCGA studien ble tatt [27]. Totalt 11,202 gener fra 316 tumorprøver med Z-score ble hentet for analyse
Over-uttrykk for hvert gen ble definert av en Z-score . 1.65 (som representerer den øverste 5% i mRNA uttrykk). Tendensen til co-overekspresjon av PBX1 og dets mål gener i samme prøve ble vurdert i 316 svulst prøvesett, og odds ratio (ORS) ble beregnet.
