Hur er kjent for å lokalisere til polysomes og i stress granulater etter visse typer leker og celle lesjoner. Vi la merke til en enorm forskyvning av proteinet til tyngre fraksjoner polysomal følgende doxo middel, noe som indikerer at proteinet er aktivt deltar i den cellulære reaksjonen overfor medikamentet kanskje regulere oversettelse utøvelse av bundne mRNA. Vi utnyttet en RIP chip analyse for å fastslå hvilke mRNA bindes til Hur følgende doxo behandling, for å undersøke Hur respons på doxo i form av Hur mål.
Etter immunoprecipitation og hybridisering på Agilent arrays, gjennom en fold berikelse toleranse, filtrert vi de mRNA rekke spesielt bundet til Hur. Vi oppdaget mRNA tilsvarer 822 HGNC annoterte gener som kan bindes til Hur og proporsjonalt beriket i produktet. Vi leverte 721 Hur bundet gen posten til evaluering av funksjonelle motiver rundt 3UTR, å bedømme stabiliteten i vår prosess med mRNA berikelse. Siden Hur er godt kjent for å binde seg til Ares, forventet vi å se etter en solid overrepresentasjon av ARE mening binding i 3UTRs av disse genene.
berikelse av ARE var stor og betydningen er bevart selv om stadig gener fjernes med lavere fold berikelse. De første 50 genene er maksimalt beriket i Åre. Fra denne listen vi valgte tre gener for å bekrefte konsekvensen av genomet brede analysen ved å sjekke den relaterte beløpet om immunoprecipitation løsning via semikvantitativ PCR av c fos, c myc og SOCS3. Alle mRNA etablert sitt forhold til Hur etter doxo regjeringen, som vist i figur 5B.
Disse dataene antyder en involvering av Hur i ferd med apoptose aktivering forårsaket av doxo i vårt cellulær modell system som ikke kan forklares ved dannelsen av apoptogenic avkortede type Hur, og at som et alternativ hur er bundet til spesifikke mRNA og relocalizes på polysomes etter doxo terapi. Siden Hur nedregule fremmer en reduksjon av apoptotisk respons indusert av doxo og siden rottlerin motvirker doxo i induserende tap av levedyktighet, vi lurte på om hur kan være innblandet i utbruddet av doxo motstand.
Vi legger MCF 7 celler i henhold doxo samling av stadig økende medikamentkonsentrasjonen fra 0 til 100 nM i en måned tidsskala. Vi har mottatt en celle innbyggerne, kalt MCF 7 /doxoR, som viste ca. 250 gangers resistens overfor doxo, sammenlignet med villtype MCF 7-celler, som observert av IC50 økning til omtrent 10 uM. Ytterligere bekreftelse av ervervet resistens fenotype oppsto i over-uttrykk i MCF 7 /doxoR av ABCG2 transporter, en gjennomsnittlig tegn og kjente årsaken til doxo pharmacoresistance, som permissivity til apoptose ble oppdaget av caspase 7 setning. Og-l002
Vi har observert en sterk nedregulering av Hur mens cellene er tilpasset til tilstedeværelsen av doxo. Vi gjentok prosedyren for doxo samling 3 x ofte anskaffe den samme åpen Hur nedregulering, fordi vi fokuserer på bestander, egen satt gjennom variabilitet. Mer over, legger vi i henhold utvalg forskjellige to brystkreftcellelinjer med forskjellige charachteristics fra MCF 7 celler: MDA MB 231, trippel dårlige celler, og SK BR 3, HER2 positive celler.
Vi kjøpte en befolkning på MDAMB 231 celler motstandsdyktig mot doxo men ikke en befolkning på SK BR 3 i henhold til de verdiene som er beregnet. Interessant, opplevde vi Hur downregulation i MDAMB 231 /doxoR men ikke i SK BR 3 /NOdoxoR, noe som tyder på at brystkreft celler downregulate Hur uttrykk hvis en dyp genetisk re-programmering mot pharmacoresistance er oppstått, og ikke som et resultat av tilstedeværelsen av doxo.
