Abstract
Prostatakreft er en av de viktigste årsakene til kreft dødsfall blant menn over hele verden . I denne studien, ved hjelp av transgene mus adenokarsinom av prostata (tramp) mus ble effekten av diett anriket med 1% vekt /vekt ursolic syre (UA) ble undersøkt for å evaluere den spesifikke trinnet Kjemopreventivt aktivitet mot prostatakreft. Vi fant at Tramp mus matet med UA diett i 8 uker (uker 4 til 12) forsinket dannelsen av prostata intraepitelial neoplasi (PIN). Tilsvarende mus matet med UA diett i 6 uker (uker 12 til 18) hemmet utviklingen av PIN til adenokarsinom som bestemmes av hematoxylin og eosin farging. Endelig Tramp mus matet med UA diett i 12 uker (uker 24 til 36) viste betydelig redusert tumorvekst uten signifikant effekt på total kroppsvekt og lengre total overlevelse. Med hensyn til den molekylære mekanisme, har vi funnet at UA nedregulert aktivering av forskjellige proinflammatoriske mediatorer, inkludert, NF-kB, STAT3, AKT og IKKα /β fosforylering i dorsolateral prostata (DLP) vev som korreleres med reduksjonen i serum nivåer av TNF-α og IL-6. I tillegg UA signifikant nedregulert uttrykket nivåer av cyklin D1 og COX-2, men oppregulert nivåene av caspase-3 som vist ved immunohistokjemisk analyse av tumor-vev seksjoner. Endelig UA ble påvist i serumprøver hentet fra ulike mus grupper matet med anriket diett i nanogram størrelse som angir at det absorberes godt i mage-tarmkanalen. Samlet sett våre funn gir sterke bevis for at UA kan være et utmerket middel for både forebygging og behandling av prostatakreft
Citation. Shanmugam MK, Ong TH, Kumar AP, Lun CK, Ho PC, Wong PTH, et al. (2012) ursolic Acid Hemmer Initiation, utviklingen av prostatakreft og Forlenger Survival of TRAMP Mus ved Moduler proinflammatoriske Pathways. PLoS ONE 7 (3): e32476. doi: 10,1371 /journal.pone.0032476
Redaktør: Ganesh Chandra Jagetia, Mizoram University, India
mottatt: 8 juli 2011; Godkjent: 28 januar 2012; Publisert: 12 mars 2012
Copyright: © 2012 Shanmugam et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra National Medical Research Council of Singapore [R-184-000-168-275 og R-184-000-201-275] til GS. APK ble støttet med tilskudd fra National Medical Research Council of Singapore [Grant R-713-000-119-275] og Cancer Science Institute of Singapore, Experimental Therapeutics jeg Program [Grant R-713-001-011-271]. KMH ble støttet av et stipend fra National Medical Research Council of Singapore, Biomedical Research Council of Singapore, og Singapore Millennium Foundation. De bevilgende myndighet ikke har noen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft er den nest største årsaken til kreft dødsfall blant menn i vestlige land etter lungekreft [1]. Kronisk betennelse i økende grad anerkjent som en mellommann for mange kreftformer [2], [3], [4] og betydelig bevis tyder på at den spiller en viktig rolle både i utvikling og progresjon av prostatakreft [5]. Først pasienter med symptomatisk prostatitt er mer utsatt for å utvikle prostatakreft. For det andre har prostatakreft vært forbundet med seksuelt overførbare sykdommer. Tredje, redusert risiko for prostatakreft er forbundet med økt inntak av frukt og grønnsaker, antioksidanter, og ikke-steroide antiinflammatoriske legemidler (NSAID) [6], [7]. Fjerde, gjennomgår normal prostata proliferative inflammatorisk atrofi (PIA) før forming prostata intraepitelial neoplasi (PIN), forløperen for prostatakreft [8]. Femte, kan PIA overuttrykker inflammatorisk enzym COX-2 [9]. Sjette, transkripsjonsfaktorer NF-kB og STAT3, både store mediator av inflammasjon, er konstitutivt aktiv i prostata kreftvev [10]. Og syvende, NF-kB-regulert inflammatoriske cytokiner slik som interleukin (IL) -6 er en autokrin vekstfaktor kjent for å bli utskilt av prostata kreftvev [11], [12]. Derfor er det rimelig å anta at midler som kan undertrykke inflammatoriske mediatorer har et potensial for både forebyggelse og behandling av prostatacancer.
UA (3β-hydroksy-urs-12-en-28-syre) , et penta triterpenoid utledet fra bær, blader, blomster og frukter av medisinske planter, for eksempel
Rosemarinus officin
,
Eriobotrya japonica
,
Calluna vulgaris
,
Ocimum sanctum
, og
Eugenia jumbolana
er en slik agent som har blitt grundig undersøkt for sin anti-inflammatorisk og kreft aktiviteter i det siste tiåret [13]. UA har blitt rapportert å undertrykke proliferasjon av forskjellige tumorceller, for å indusere apoptose, og for å inhibere tumorvekst, metastase, og angiogenese [14], [15], [16], [17]. Vår gruppe er undersøker nå uutforsket potensialet UA for forebygging og behandling av prostatakreft og er nylig rapportert i to separate studier som UA kan faktisk undertrykke veksten av prostata xenograft i nakne mus og inhiberer også fjernt område metastase ved å modulere CXCR4 /CXCL12 signalkaskade [18], [19].
transgen adenokarsinom i mus prostata (TRAMP) modell av prostatakreft er basert på en transgen bestående av probasin (PB) promoter-drevet SV40 T antigen (Tag) uttrykk. Dette transgen mus er å foretrekke å implantasjon modeller fordi i denne modellen prostatakreft spontant utvikler seg gjennom en rekke veldefinerte trinn. De viser bemerkelsesverdige likheter med menneskelige prostata kreft progresjon fra PIN-scenen til invasiv adenokarsinom som metastasizes til lever, lunge og mage-tarmkanalen via aktivering av et transgen som er hormonelt regulert av androgener [20], [21]. Dessuten, alle Tramp mus utvikler godt differensiert karsinom (WDC) mellom 8-12 ukers alder og metastaser til fjerne områder mellom 18 og 24 ukers alder [22]. I denne studien undersøkte vi de potensielle effektene av UA beriket diett for å forebygge utvikling, progresjon, samt total overlevelse av svulster i Tramp mus. Våre data indikerer klart for første gang at fôring mus med en diett rik på UA kan hemme progresjon fra PIN til adenokarsinom, og tumorvekst. Det kan også forlenge overlevelsen av mus gjennom modulering av flere signalkaskader.
Resultater
Denne studien var designet for å undersøke den potensielle effekten (e) av UA på tidlig svulst utvikling, tumor progresjon og total overlevelse av Tramp mus (fig 1A.)
A, Mann TRAMP-mus 4 ukers alder ble matet med UA beriket diett i 8 uker (gruppe 1).; 12 uker gamle mus i 6 uker (gruppe 2); og 24 uker gamle mus for 12 uke (gruppe 3). Musene ble avlivet ved slutten av behandlingsperiodene. Age-matchet kontrollgruppe TRAMP-mus fikk normal diett for de samme tidsperioder. For overlevelse studier ble Grupper 1 til 3 behandlet på samme måte mens gruppe 4 ble matet med UA beriket diett i 36 uker starter på 4 ukers alder. B, H E farget deler av DLP av ikke-TRAMP prostata (i), Gruppe 1 kontroll (ii), og UA-behandlet (iii) TRAMP prostata. C viser Bar diagram forekomsten av LG-PIN, HG-PIN, WDC, MDC og PDC i DLP av kontroll og gruppe 1 mus. Det ble observert en liten økning i LG-PIN og en nedgang i HG-PIN (n = 5) etter UA behandling. Ingen MDC og PDC ble observert i gruppe 1 og tilsvarende kontroller. Pil viser LG-PIN; hakk høyre pil indikerer HG-PIN.
UA undertrykker prostata intraepitelial neoplasi (PIN) dannelse
Det har blitt rapportert tidligere at Tramp mus utviser økt epitel lagdeling i dorsolateral prostata, epitelial celler med variabelt avlange kjerner med kondensert kromatin med flate mønstre av lavgradig (LG) PIN (LG-PIN) etter 4-8 ukers alder og tufted micropapillary og en cribriform mønster av HG-PIN ved 6-10 ukers alder [ ,,,0],22] .For å undersøke om UA undertrykker PIN-formasjonen, ble fire ukers gamle mus matet med UA (1%, w /w) som inneholder diett i 8 uker og ofret ved 12 ukers alder (gruppe 1). Den våte vekt av prostata med sædblærene ikke merkbart endrer både kontroll- og UA matet TRAMP-mus (data ikke vist). Visuell undersøkelse av bukhulen heller ikke avsløre uvanlig utvidelse av sædblærene, prostata fliker eller bekken lymfeknuter. Forbruket av UA beriket dietten ble godt tolerert uten tegn på toksisitet i form av dyr utseende, atferd og kroppsvekt.
Mens ikke-tramp mus ikke viser noen PIN dannelse (Fig. 1B, i), Tramp mus dyrene viste LG- og HG-PIN og godt differensiert karsinom (WDC) (fig. 1B, ii og iii). Virkningene av UA-behandling på dannelsen av PIN-koden er vist i fig. 1C. LG-PIN ble sett i 60% av UA-behandlede mus sammenlignet med 40% hos kontrollene mens HG-PIN ble sett i 20% av UA-behandlede mus i motsetning til 80% i kontroller. Dette viste at UA behandling hadde redusert dannelse av PIN samt forsinket progresjon fra LG- til HG-PIN. I tillegg er kun ett dyr viste moderat (MDC) eller dårlig differensiert karsinom (PDC) på dette stadiet. Disse dataene antyder sterkt at UA har potensial til å bli brukt som en chemopreventive agent.
UA hindrer progresjon fra PIN til prostatakreft
For å avgjøre hvorvidt UA kan hindre progresjon fra PIN til prostatakreft, 12-uker-gamle tramp-mus ble foret med kontroll eller UA (1%, vekt /vekt) anriket diett i 6 uker og deretter avlivet ved 18 uker (fig. 1A, gruppe 2). Ved 18 ukers alder, DLP av TRAMP mus viste høyere forekomst av LG-PIN, HG-PIN, WDC og MDC (figur 2A, i . Ii) sammenlignet med de som ble observert i yngre aldersgrupper (figur 1B C). Det ble ikke observert signifikante endringer i utseende, kroppsvekt og matinntak mellom gruppe 2 mus og deres kontroller. Det var imidlertid en merkbar, men statistisk signifikant reduksjon i den våte vekten av prostatakjertelen med sædblærene i UA matet mus (data ikke vist). UA-behandling reduserte forekomsten av LG-PIN med 60%, HG-PIN med 40% og WDC med 40% (Fig. 2A, iii) .Samlet, var det en merkbar dreining mot de høyere forekomst av ikke-kreft DLP i UA-behandlede mus
A, H . E farget delen av DLP i gruppe 2 kontroll (i) og UA-behandlet (ii) TRAMP prostata. Pil viser LG-PIN, hakk høyre pil indikerer HG-PIN, og blokkere høyre pil indikerer WDC. (Iii) Bar Figuren viser forekomsten av LG-PIN, HG-PIN, WDC, MDC og PDC i DLP av kontroll og Gruppe 2 mus. Reduksjoner i PIN, WDC og MDC ble observert etter UA behandling. B, H Arrow hodet indikerer MDC og chevron indikerer PDC. C, Western blot av pSTAT3, pakt, pIKKα /β, og p65-proteiner i DLP i gruppene 1, 2 og 3 mus. DLP lysatene ble utarbeidet og immunoblotting ble utført som beskrevet i materialer og metoder. Lik protein lasting for Pakt og pIKKα /β ble bestemt ved stripping og sondering for total AKT og IKKα ble p65 og Stat3 blotter strippet og reprobed for β-actin å bestemme lik protein lasting. Bandet tetthet ble kvantifisert ved hjelp av Image J programvare. NT = ikke-Tramp-mus; T = Tramp kontroller; T + UA = UA-behandlede TRAMP-mus.
UA undertrykker vekst av etablerte prostatakreft
in vivo
For å finne ut om UA kan undertrykke vekst av etablerte prostatakreft, ble 24 uker gamle tramp-mus foret med en kontroll eller UA (1%, vekt /vekt) anriket diett i 12 uker og deretter avlivet ved 36 uker (fig. 1A, gruppe 3). I denne alderen, visuell undersøkelse av bukhulen klart frem forstørrede sædblærene, DLP og andre prostata lapper i kontroll tramp-mus. DLP viste høyere forekomst av WDC, MDC og PDC sammenlignet med de som ble observert i yngre aldersgrupper, noe som tyder på at et flertall av dyrene hadde til kreft i DLP (figur 2B, i . Ii). I motsetning til UA-behandlede tramp mus viste redusert forekomst av HG-PIN med 40%, WDC med 60%, MDC med 40%, og PDC med 20% (Fig. 2B iii). Totalt sett er resultatene indikerte at UA-behandlede mus viste ikke-kreft lesjoner som strekker seg fra LG-PIN og HG-PIN til normal stroma sammenlignet med 100% forekomst av prostatakreft i kontroll tramp mus.
UA hemmer aktiveringen fra AKT, IKKα /β, NF-kB og STAT3 i DLP av Tramp mus
Vi har nylig rapportert at UA kan hemme AKT, IKKα /β, NF-kB og STAT3 aktivering i androgen avhengige og uavhengige prostatakreft cellelinjer [18]. I denne studien vi videre undersøkte effekten av UA anriket diett på aktivering av pro-inflammatoriske mediatorer i DLP av TRAMP mus (Fig. 1A). Som vist på fig. 2C, progressiv økning i fosfor (P) -AKT, -pIKKα /β, pSTAT3, og p65 uttrykk ble observert fra gruppe 1 til gruppe 3 trampe mus som kreften gradvis gått fra LG-PIN-formasjonen i gruppe 1 ved 4-12 uke gamle, HG-PIN og WD carcinoma in DLP i gruppe 2 ved 12-18 ukers alder, og WDC, MDC og PDC ved 24-36 ukers alder. Alderstilpassede ikke-tramp C57BL /6 mus, anvendt som negative kontroller, ikke viste noen endring i nivåene av disse proinflammatoriske proteiner. Interessant, observerte vi at UA behandlingen resulterte i 40-50% inhibering i ekspresjonen av disse fosforylerte proteiner i DLP av gruppe 2 og gruppe 3 sammenlignet med ubehandlede tramp mus, mens bare en liten reduksjon ble observert i gruppe 1 (Fig . 2C). Nivåene av den ikke-fosforylerte AKT og IKKα var minimalt påvirket av UA-behandling (fig. 2C). Tatt sammen, våre data klart indikerte at undertrykkelsen av pro-inflammatoriske AKT, NF-kB og STAT3 aktivering spiller en rolle ved inhibering av progresjon av prostatacancer i mus ved tramp UA.
UA hemmer serum TNF -α og IL-6 nivåer i tramp mus
TNF-α og IL-6 er proinflammatoriske cytokiner, og anses som viktige biomarkører for inflammasjon. Gruppene 1, 2 og 3 mus sammen med deres kontroller ble avlivet ved slutten av hver behandlingsprotokoll; blod ble oppsamlet via hjertepunktering. Det oppnådde serum ble evaluert med hensyn på nivåer av TNF-α og IL-6 ved hjelp av et ELISA-kit. Både TNF-α og IL-6-nivåer økte fra gruppe 1 til Gruppe 3 svarende til økende alder og stadier av kreft progresjon (fig. 3A). UA-behandling signifikant redusert serum TNF-α i gruppe 2 (med ~90%) Gruppe 3 (~ 30%) (fig. 3A, i) så vel som i serum IL-6 i alle de tre gruppene med ~40-90% ( fig. 3A, ii).
A. Undertrykkelse av serum TNF-α (i) og IL-6 (ii) ved UA-behandling. Grupper på 1-3 mus ble behandlet som beskrevet i Materialer og Metoder. Sandwich-ELISA-analysen ble utført i henhold til produsentens instruksjoner (R 0,05). B, Immunhistokjemisk analyse av cyclin D1, caspase 3 og COX-2 i tumorvevet i gruppe 3 tramp mus. DLP tumorvev, forankret i parafinblokker, ble kuttet i 5 um vevssnitt og undersøkt for cyclin D1, caspase 3 og COX-2 immunoreaktivitetene som beskrevet i Materialer og metoder. UA-behandling (1% v /v) ble redusert ekspresjon av cyclin D1 og COX-2, men økte caspase-3-ekspresjon sammenlignet med kontrollene. Bilder ble tatt med et Olympus BX51 mikroskop (forstørrelse, 20 ×). Positive celler (brune) ble kvantifisert ved hjelp av Image-Pro plus V6.3 programvarepakke (Media Cybernetics, Inc.).
UA undertrykker uttrykk for cyclin D1, COX-2 og caspase-3 i DLP av TRAMP mus
Vi neste undersøkt ulike genprodukter involvert i kreft progresjon (COX-2), spredning (cyclin D1) og apoptose (caspase-3) ved immunhistokjemi i DLP av gruppe 3 Tramp mus. Som vist på fig. 3B, UA-behandling reduserte antallet celler farget positivt for cyklin D1 fra 31% til 3% og COX-2 fra 89% til 27%. Som forventet, var ekspresjonen av caspase-3 økte fra 6% til 95%. Disse resultatene klart indikerte at hemming av flere genprodukter involvert i tumorprogresjon og induksjon av apoptose bidra til potente anti-tumor aktivitet av UA som observert i tramp tumorvev.
UA undertrykker svulst vekst og øker overlevelses av Tramp mus
for å finne ut om UA kan undertrykke veksten av etablerte prostatakreft, 24-ukers gamle tramp-mus ble matet med en kontroll eller UA (1%, w /w) anriket diett i 12 uker og deretter ofret på 36 uker (fig. 1A, gruppe 3). Den våte vekt av prostata med sædblærene viste signifikante forskjeller i vekten av hele prostatakjertel. Det ble ikke observert forskjell i tumorvolumet i UA-behandlede mus, A signifikant (0,05 P kontrollgrupper mottok normal diett (fig. 1A). Mus ble scoret på tidspunktet for død basert på tumorbyrde. Kaplan-Meier overlevelses tomter ble generert for å bestemme total overlevelse. Log-rank (Mantel-Cox) tomter viste økning i total overlevelse av mus i alle UA-behandlede grupper. Median overlevelse av mus i kontrollgruppen var 55 uker, sammenlignet med 75 uker for gruppe 1 og gruppe 2, og 72 uker for gruppe 4 (P 0,05). I gruppe 3 var median overlevelse var 68 uker, men klarte ikke å nå statistisk signifikans (fig. 4C). Derfor kan det konkluderes med at UA-behandling er mest effektiv når den ble startet tidlig når den TRAMP-mus viste ingen kreft eller kun tidlige stadier av PIN-utvikling.
A, Mus ble avlivet etter 36 uker og den tumorvolum ble målt som beskrevet i Materialer og Metoder. Feilfelt representerer SEM. * Statistisk signifikans (P 0,05). B, Kroppsvekt av gruppene 1-3 Tramp mus og deres kontroller. C, Virkningen av UA-behandling på lang sikt overlevelse av tramp mus. Kaplan-Meier overlevelsesanalyse ble utført for kontroll og UA-behandlede tramp mus. Median overlevelsestid var 55 uker for kontroll (n = 5). Median overlevelse for gruppe 1, gruppe 2, gruppe 3 og gruppe 4 var 75, 75, 68, og 72 uker, henholdsvis. Samlet betydning ble bestemt ved bruk av log-rank (Mantel-Cox) test. UA beriket diett betydelig forlenget overlevelse.
Påvisning av UA i serum
UA ble påvist i serum fra alle 3 grupper av TRAMP-mus matet med UA beriket kosthold. Konsentrasjonene detektert varierte fra omtrent 600 til 1300 ng /ml uten noen statistisk signifikans mellom grupper (Fig. 5B). Som UA serumnivåer var forventet å ha nådd steady state-konsentrasjon i alle tre gruppene, forskjellene i konsentrasjon og dermed reflekteres individuelle variasjoner. Ingen ytterligere topper ble påvist i serumet, noe som indikerer at UA ikke genererer noen metabolitter (Fig. 5A, III og IV). Vår undersøkelse viser den første eksperimentelle bevis for at UA absorberes godt etter oral foring og serumkonsentrasjonen oppnådd er tilstrekkelig til å utløse biologiske effekter som tydelig ved inhibering av prostatatumorvekst i tramp mus.
A, (i) ionekromatogrammer av serum utdrag fra mus som ikke hadde fått UA (blank). (Ii) Fullstendig skanning spektrum som viste m /z topp med en molekylvekt på 469 korresponderer med indre standard (IS) glycyrrhetinsyre. (Iii) Fullstendig skanning spektrum som viste m /z topp med en molekylvekt på standard UA ved 455 og står til 469 og (iv) Fullstendig skanning spektrum av prøven, retensjonstid var 1,7 og 1,96 minutter for henholdsvis både IS og prøven. Kromatogrammene er representative for 3 uavhengige eksperimenter. B, ble Serumkonsentrasjoner av UA beregnet ved anvendelse Analyst programvare 1.4.2 fra den lineære regresjon ligning av topparealforholdet mot konsentrasjonen av kalibreringskurven. Feilfelt representerer SEM.
Diskusjoner
TRAMP musemodell er et godt etablert spontant utvikle prostatakreft modell som etterligner naturlig prostata tumorprogresjon, fra PIN til meget inngripende metastatisk prostatakreft [ ,,,0],20] i mennesker. I tramp mus, stammer svulst fra både DLP og ventral prostata (VP) som et resultat av Tag uttrykk som er primært begrenset til de prostatiske fliker [22], mens human prostatakreft stammer fra den perifere sone som er lik den DLP i mus [23]. De kreft effekter av ulike chemopreventive midler, inkludert oleanolic syre analoger, sulforaphane, polyfenoler hentet fra grønn te, hvitløk bestanddeler, curcumin, 3, 3′-diindolylmethane og genistein har blitt evaluert tidligere på spontant utvikle prostata tumorigenesis i Tramp mus [24], [25], [26]. I tillegg har lykopen, γ-tokoferol, silbinin og tomat anriket diett alle er funnet å øke overlevelse og forsinke progresjon fra PIN-koden til adenokarsinom og redusere forekomsten av dårlig differensiert karsinom [23], [27], [28], [ ,,,0],29], [30]. Imidlertid har chemoprevention studie med UA i prostatakreft-modellen ikke er utført tidligere, og bare vår gruppe har nylig rapportert for første gang at UA beriket kosthold kan faktisk hemme prostata metastase ved å modulere CXCR4 /CXCL12 aksen i Tramp mus [19 ]; Selv om effekten av UA på tumorutvikling og progresjon ikke ble evaluert. I denne studien, studerte vi effekten av UA behandling på tre forskjellige stadier av kreftutvikling i Tramp mus. Vi fant at UA kan hemme kreftutvikling og progresjon på alle tre trinn. I Gruppe 1 mus, observerte vi målbare undertrykkende effekter av UA på PIN utvikling, mens i Gruppe 2 mus, utvikling av høy klasse PIN ble hemmet som gjenspeiles av reduksjonen i godt differensiert PIN. Videre UA betydelig hemmet utviklingen av preneoplastiske PIN i DLP og tumor volum uten observerbare bivirkninger hos konsern 3 mus. Utviklingen av en overflod av ikke-cancerøse lesjoner i denne gruppe i motsetning til overvekt av cancerøse lesjoner hos kontroll tramp mus er tydelig. Resultatene av histologisk gradering videre foreslått at UA kan overveiende hemme utviklingen av forstadier til kreft i et flertall av mus, og således forhindre utvikling av sterkt invasive maligne tumorer. UA også betydelig økt total overlevelse med så mye som 20 uker, forsinket progresjon fra PIN til adenokarsinom, og redusert forekomsten av PDC.
Videre observerte vi at anti-proliferative og pro-apoptotiske virkninger av UA er forbundet med undertrykkelse av cyclin D1 og COX-2 og inhibering av NF-kB, STAT3, AKT og IKKα /β aktivering i prostata av tramp mus. En slik inhibering korreleres med lengden av foringsperioden, slik det fremgår av betydelig større hemning i gruppe 3 mus som mottok UA kontinuerlig for12 påfølgende uker. Reduksjonen i TNF-α og IL-6-nivåer korrelerte også med lengden av behandlingsperioden. Undertrykkelse av cyclin D1 og COX-2 kan godt være en konsekvens av den reduserte aktivering av NF-kB og STAT3 da disse pro-inflammatoriske transkripsjonsfaktorer regulere ekspresjonen av cyclin D1 og COX-2 [2], [3], [ ,,,0],31]. Økt caspase-3 ekspresjon er et tegn på apoptose. Samlet utgjør disse resultatene tyder klart på at hemming av celleproliferasjon og økning i apoptose spille en sentral rolle i UA-mediert hemming av prostata tumorprogresjon hos Tramp mus. Det faktum at UA ble påvist i alle serumprøver i vesentlige konsentrasjoner ytterligere indikerer at UA absorberes godt og oral foring kan betraktes som en foretrukket bruksmåte for en potensiell Kjemopreventivt og terapeutisk middel for prostatacancer. Derfor kan det konkluderes med at UA-behandling hemmet utviklingen av PIN-koden til adenokarsinom, reduserte tumorvekst og også forlenget overlevelse av mus. Sammen indikerer disse resultater at UA kan ha et stort potensial for anvendelse som et Kjemopreventivt middel, så vel som et lovende middel for behandling av prostatakreft.
I sammendrag, våre data viser tydelig at UA mating forsinker progresjon av prostata kreft hos mus gjennom modulering av forskjellige pro-inflammatoriske molekyler. Fordi TRAMP er en spontan modell for prostatacancer som etterligner progressive former av human sykdom, resultatene av denne undersøkelse gir et godt grunnlag for å forfølge videre studier på bruk av UA, enten alene eller i kombinasjon med annen terapi for forhindring og /eller behandling av prostatakreft.
Materialer og metoder
Reagenser
UA (98% rent) ble kjøpt fra Guangxi Chang Natural Products Development Company Ltd (Kina). UA ble blandet med normalt muse diett ved 1% w /w og lagret ved 4 ° C. Tris, glycin, NaCl, SDS, glycyrrhetinsyre og β-aktin-antistoff ble levert fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) og HRP-konjugert sekundært antistoff ble oppnådd fra Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). Antistoffer mot fosfor-STAT3 (Tyr 705), fosfor-AKT (Ser 473), STAT3 ble kjøpt fra Santa Cruz Bioteknologi (Santa Cruz, California). Antistoffer mot AKT, p65, fosfo-spesifikke IKKα /β (Ser 180 /Ser 181), og IKKα ble anskaffet fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA). TNF-α og IL-6-ELISA-sett ble kjøpt fra Research Instruments (MA, USA). Bradford reagens ble kjøpt fra Bio-Rad (Hercules, CA). Immunhistokjemi flekker kit ble kjøpt fra Dako (Danmark).
tramp mus avl og genotyping
Dyreforsøk ble utført i samsvar med Singapore NACLAR retningslinjer (Law per november 2004) for forsøksdyr bruk og omsorg og godkjent av NUS Institutional Animal Care og bruk komité protokollnummer 052/09. Kort fortalt ble fire ukers gamle tramp hunnmus kjøpt fra The Jackson Laboratory parret med C57BL /6 hannhund på NUS CARE (Singapore). Valpene ble genotypet for transgenet (Tag) ved 3 ukers alder; DNA ble ekstrahert fra halen snips hjelp TRIZOL® reagens (Invitrogen, USA) og kvantifisert ved hjelp av Nanodrop spektrofotometer (Thermo Scientific, USA). Ett pg av DNA ble tatt for PCR-analyse. Polymerase kjedereaksjon (PCR) Reaksjonsblandingen inneholdt 10 pl av 5 x QIAGEN PCR-buffer, 1 ug DNA, 0,6 pM hver av forover og revers primere, 2 ul dNTP-blanding og 1 ul Taq-polymerase-enzym i et sluttvolum på 50 ul. Primere som brukes til genotyping, forover primer: 5′-CCG GTC GAC CGG AAG CTT CCA CAA GTG CAT TTA-3 «, Revers primer: 5′-AGG CAT TCC ACC ACT GCT CCC ATT CAT C-3». PCR-betingelsene var 94 ° C i 3 minutter, 94 ° C i 30 sek, 62 ° C i 1 minutt, 72 ° C i 1 min, gjenta trinn 2-4 for 35 sykluser, 72 ° C i 2 min og holdt ved 4 ° C. PCR-produkter ble kjørt på 1% agarosegel inneholdende 1 x GelRed nukleinsyre gel flekk fra Biotium (Hayward, CA). Farget bånd ble visualisert under UV-lys og fotografert ved hjelp av Biorad Gel doc EZ-system (Bio-Rad, USA). Transgen positive valpene ble deretter brukt for de påfølgende forsøkene.
Patologisk gradering av tumorvev
Den patologiske gradering av TRAMP prostatakreft ble utført i henhold til karaktersystemet beskrevet tidligere [22]. Prostata lesjoner i DLP ble histologisk gradert som normalt (duct foret med enkelt lag av sekretoriske epitelceller omgitt av to eller tre cellelag av fibrousmuscular stroma), lav grad av prostata intraepitelial neoplasi (PIN) [epitelceller med variabelt avlange kjerner med kondensert kromatin], høyverdig PIN (epithelial lagdeling og tufte, tilstedeværelse av micropapillary og cribiform strukturer), godt differensiert karsinom (WDC) (epitelceller invaderende fibromuscular stroma), og moderat differensiert (MDC) til dårlig differensiert (PDC) adenokarsinom prostata (ark av neoplastiske celler med lite eller ingen kjertelstrukturer). 15 tilfeldig utvalgte mikroskopiske felt på hematoxylin og eosin (H E) farget deler av DLP ble scoret for forekomst og patologisk grad av prostata kreft i kontroll og UA matet tramp mus
In vivo.
anti-tumor studie
De innavlede mannlige Tramp mus, 4 uker gamle, ble opprettholdt i temperaturkontrollerte rom med en 12 timers lys /mørke syklus. Alle musene ble veid før starten av forsøket. Musene ble deretter tilfeldig delt inn i følgende UA forede og kontrollgrupper (n = 5). Gruppe 1: 4 uker gamle TRAMP-mus ble foret med UA (1% vekt /vekt) anriket diett i 8 uker; Gruppe 2: 12 uker gammel tramp mus ble matet med UA beriket diett i 6 uker; Gruppe 3: 24 uker gamle Tramp mus ble matet med UA beriket diett i 12 uker. Kontroll TRAMP mus fikk normal diett. Kroppsvekt og tumorstørrelse ble målt to ganger hver uke og tumorstørrelsen ble bestemt ved verniercaliper og beregnes ut fra formelen [lengde x (bredde)
2] /2. Musene ble avlivet av CO
2 innånding fulgt ved halshugging. Blodprøver, som samles ved hjertepunktur, ble holdt ved 4 ° C over natten og sentrifugert ved 10000 rpm i 20 min for å oppnå serum, som ble lagret i alikvoter ved -80 ° C. Tumorvolumet ble målt og veid. Prostatakjertel ble microdisected fra sædblærene under et stereomikroskop, fiksert i 10% fosfatbuffret formalin for H & Co. E og immunhistokjemisk analyse
ELISA-assay for TNF-α og IL-6
Lagret. serum~~POS=TRUNC prøver~~POS=HEADCOMP ble analysert for TNF-a og IL-6-nivåer ved hjelp av ELISA-sett (R & D Systems, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. Sandwich ELISA protokoller ble brukt og kalibrering ble gjort med standard TNF-α og IL-6 i settet.
Western blotting
dorsolateral prostata tumorvev ble lysert i lyseringsbuffer som inneholder (20 mM Tris (pH 7,4), 250 mM NaCl, 2 mM EDTA (pH 8,0), 0,1% Triton X-100, 0,01 mg /ml aprotinin, 0,005 mg /ml leupeptin, 1 mM PMSF, og 4 mM NaVO4). Lysatene ble deretter sentrifugert ved 13000 rpm i 10 minutter for å fjerne uoppløselig materiale og 50 ug protein ble løst i en 10% SDS-gel.
