Abstract
Fosforylert signalmolekyler er biomarkører for kreft patofysiologi og motstand mot terapi, men fordi fosfoproteinet analytter er ofte labil, kan dårlig kontrollerte kliniske laboratoriepraksis hindre oversettelse av forskningsresultater på dette området fra benken til sengen. Vi sammenlignet derfor multiple biomarkør og fosfoprotein immunhistokjemi (IHC) resulterer i 23 kliniske kolorektal karsinom prøver etter enten en ny, rask vev fiksering protokoll eller en standard vev fiksering protokoll som anvendes ved kliniske laboratorier, og vi undersøkte også effekten av en definert postoperativ «kald» iskemi periode på følgende IHC resultater. Vi fant ut at en times kald iskemi intervall, tillates av ASCO /CAP retningslinjer for visse kreft biomarkør analyser, er svært skadelig for visse Fosfoproteinet analytter, spesielt fosforylert epidermal vekstfaktor reseptor (pEGFR), men kortere iskemiske intervaller (mindre enn 17 minutter) lette bevaring av fosfoproteiner. For det andre, fant vi at en rask 4-timers, to temperatur, formalin fiksering ga overlegen flekker i flere tilfeller med utvalgte markører (pEGFR, pBAD, Pakt) sammenlignet med en standard over natten romtemperatur fiksering protokollen, til tross for å ta mindre tid. Disse funnene tyder på at de fremtidige forskning og kliniske verktøy av phosphoprotein IHC for vurdering tykktarmskreft patofysiologien helt avhengig av oppmerksomhet til preanalytiske faktorer og strengt kontrollerte vev fiksering protokoller
Citation. Theiss AP, Chafin D, Bauer DR, Grogan TM, Baird GS (2014) Immunohistochemistry av tykktarmskreft Biomarker Fosforylering Krever Kontrollert Tissue Fiksering. PLoS ONE 9 (11): e113608. doi: 10,1371 /journal.pone.0113608
Redaktør: John Matthew Koomen, Moffitt Cancer Center, USA
mottatt: 18 juni 2014; Godkjent: 28 oktober 2014; Publisert: 19.11.2014
Copyright: © 2014 Theiss et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Denne studien ble finansiert delvis av et forskningsstipend til GSB fra Ventana Medical Systems, Inc. Det er ingen bevilgning rekke forbundet med dette oppdragsforskning stipend. Denne studien var et samarbeid mellom GSB institusjon og Ventana, og dermed Ventana ansatte var involvert i alle stadier av denne forskningen (studiedesignet, datainnsamling, analyse, beslutning å publisere, og forberedelse av manuskriptet). Den resterende delen av dette arbeidet ble finansiert av intern University of Washington midler
Konkurrerende interesser:. Geoffrey Baird har lest journalen politikk og forfatterne av dette manuskriptet har følgende konkurrerende interesser: De angitte forfatterne er ansatt i Ventana Medical Systems, Inc. Dette endrer ikke noe forfatterens tilslutning til noen PLoS ONE politikk.
Innledning
i målrettet terapi av tykktarmskreft, har det vært de siste oppmerksomhet plassert på viktigheten av å identifisere aktiverings statene celle signalmolekyler til prediksjon av respons på behandlingen. Et eksempel på dette er den EGFR-mediert aktivering av MAPK signalering, noe som bidrar til den ufølsomhet av BRAF-mutant kolorektal karsinom til RAF hemming med vemurafenib [1]. Viktigere dette pEGFR reaktive arrangementet er underlagt modulasjon av EGFR-hemmere, og den kombinerte polyterapi BRAF og EGFR-hemmere overvinne denne motstanden, med fordelaktig respons
in vitro Hotell og i dyremodeller
in vivo
.
utvidelsen av disse tidligere laboratoriefunn til klinikken, og vår evne til å påvirke alternative behandlinger, er helt avhengig av vår evne til å nøyaktig bevare og oppdage aktiverings statene i spørsmålet. I arbeidet med å finne den optimale bevaring (vev fiksering) betingelser for å støtte målrettet terapi, har litteraturen ledet oss til å stille spørsmål om hvorvidt vanlig praksis i anatomisk patologi laboratorium er tilstrekkelig til å ivareta alle de potensielle fallgruvene som kan påvirke biomarkør /aktiveringsstatus bevaring. For eksempel, i egne kliniske laboratorium erfaring, kan vevsprøver forbli ved romtemperatur før nedsenking i fiksativ i lengre perioder, og den faktiske tiden som brukes i et fikseringsmiddel, og temperaturen av det bindemiddel, er noen ganger dårlig kontrollert. Gjeldende faglige retningslinjer i denne saken [2] – [4] adressere bare et begrenset antall kliniske prøvetyper og nedstrøms biomarkør analyser, eller er fortsatt ganske bred i å definere hva som anses som akseptabelt i forhold til fiksering tid (en to-fold variasjon i maksimal fiksering tid, 16-32 timer, er anbefalt i CLSI retningslinjer, og en 12-fold spekter av fiksering varighet, 6-72 timer, regnes som akseptabelt i ASCO /CAP markør brystkreft retningslinjer). En pre-fiksering «kald ischemi» tid på opp til en time er også ansett som akseptabelt i en av disse retningslinjene [3], som er innenfor rekkevidden av det som vi har observert klinisk i våre egne institusjoner. Tidligere kreft biomarkør immunhistokjemi studier har faktisk funnet ~ 1 time iskemi ganger akseptable, selv om disse studier har primært fokusert på etablerte biomarkører som østrogenreseptor og HER2 [5], [6]. Men av de retningslinjer som eksisterer, ingen hensikt å ta opp bevaring av biomarkør aktiverings stater, som fosforylering stater, i det hele tatt. Dette er spesielt problematisk, fordi fosforylering stater har vært kjent i noen tid til å være svært følsom for preanalytiske forhold [7] -. [9], inkludert varme iskemiske ganger [10] (som ikke er undersøkt her)
for å oppnå dette, har vi utviklet en ny, rask to-temperatur formalin fiksering strategi som vi fant bevarer viktige funksjoner i vev som morfologi, samt protein uttrykk som vurderes av immunhistokjemi [11]. I dette arbeidet, fant vi betydelig Pakt bevaring i en Calu3 mus xenograft modell, som vurdert av IHC, ved hjelp av en to-temperatur fiksering protokollen, og vi fant ut at dette farging ble nesten helt borte ved hjelp av standard romtemperatur fiksering. Fremover fra denne studien, utvidet vi vår studie i kolorektal karsinom prøver, analysere for ytterligere phosphoepitopes. I denne aktuelle omfattende studie, vi spurte om ikke de to-temperatur teknologi i tillegg hjulpet i å bevare aktiveringstilstanden av biomarkører som er relevante for kolorektal kreft terapi, samt hvorvidt kontrollerende pre-fiksering kalde iskemiske intervaller var viktig for disse biomarkører. Ved hjelp av 23 colorectal carcinoma kirurgiske prøver samlet med definerte kalde iskemiske intervaller og formalinfikseringsprotokoller, studerte vi fosforyleringstilstanden av mange PI3-kinasereaksjonsveien mål, så vel som BRAF V600E mutasjon og andre markører ved hjelp av immunhistokjemi [12], [13]. Vi rapporterer her på begge betydningen av kald iskemisk tid som en variabel i fosfoprotein analyse, samt den samlede virkningen av vår raske to-temperatur formalin fiksering protokollen.
Materialer og metoder
Prøve innsamling og Fixation
Menneskelig kolon karsinom prøver ble innhentet fra Indivumed GmbH (Hamburg, Tyskland) som parafininnstøpte blokker. Prøvene ble samlet på Indivumed fordi Ventana er ikke en medisinsk innretning, og dermed ikke har tilgang til kirurgiske prøver, og også fordi Indivumed var kjent for å kunne gi vevsprøver med dokumenterte kort (mindre enn 17 minutter) etter fjerning iskemisk intervall. Indivumed forskere utført vev samlinger i henhold til godkjenning fra deres lokale Institutional Review Board, og innhentet skriftlig samtykke fra pasientene involvert.
For alle forsøkene, ble feste protokoller utført av Indivumed forskere, og besto av nedsenking i 10% nøytral formalin (10% mettet, vandig formaldehyd fra Fisher Scientific, Houston, TX, bufret til pH 6,8-7,2 med 100 mM fosfatbuffer) i varierende tider ved temperaturer i området 4-45 ° C. Romtemperatur varierte fra 20-25 ° C. Vevsprøver hentet fra kliniske tilfeller ble delt inn i tredjedeler og hver fast annerledes. Ett stykke ble pakket inn i saltløsning fuktet gasbind og holdt ved romtemperatur i 1 time ( «1 time kald ischemi») før 24 timers fiksering ved RT. Dette var å teste effekten av den lengre retningslinje foreskrevet kald ischemi intervall på en time. De resterende to stykker var å teste effekten av kortere (mindre enn 17 minutter) kald ischemi intervall. Ett stykke ble plassert direkte i romtemperatur formalin i 24 timer ( «24 hr»). Et tredje stykke ble plassert direkte i 4 ° C formalin i 2 timer, fulgt av 2 timer i 45 ° C formalin ( «2 + 2») [11]. Sistnevnte var å teste om prosessen kan bli sped opp for å øke effektiviteten på sykehuset. Fiksering ble utført i 100-500 ml begerglass dekket i et kjøleskap ved 4 ° C behandling, eller i en standard avtrekksskap for høyere temperaturer. Kalde iskemi tider for «24» og «2 + 2» prøver i gjennomsnitt 10 +/- 3 minutter (spredning 6-17 min). Nedstrøms vev behandling ble utført som beskrevet [11], med alle løsemidler prosessortrinn ble holdt ved 45 ° C under omgivelsestrykk, og parafinen trinnet ble holdt ved 60 ° C under vakuum. Alle prøvene ble dyppet i parafin og kuttet på glassplater som 4-mikron seksjoner for IHC eller histomorphology.
Automatisert Immunohistochemistry
immunhistokjemi analyser ble utført på en VENTANA Discovery XT automatisert farging instrument i henhold til produsentens instruksjoner. Slides ble de-paraffinized hjelp EZprep løsning (Ventana Medical Systems, Inc., Tucson, Arizona) i 30 minutter ved 75 ° C. Epitop gjenfinning ble oppnådd på den automatiserte Stainer med CC1 løsning (Ventana Medical Systems, Inc., Tucson, AZ) for 64 minutter ved 95 ° C. Antistoffer som oppnås fra cellesignale Technologies eller Epitomics ble først titrert over et område av konsentrasjoner for å tilveiebringe det optimale forhold for spesifikk farging til bakgrunnsfarging. Når titere ble satt, ble antistoffer overført med fortynningsmiddel til bruker utfyllbare dispensere for bruk på automatiserte Stainer. Lysbilder ble utviklet ved hjelp av Opti
vis
DAB deteksjon kit (Ventana Medical Systems, Inc., Tucson, AZ). Kort, trinn inkludert inhibitor i 8 minutter, linker i 8 minutter, multimer i 12 minutter, DAB /peroxide i 8 minutter og kobber i 4 minutter. Slides ble deretter kontra med hematoksylin II i 8 minutter (Ventana Medical Systems, Inc., Tucson, AZ). Antistoffer, kloner, og titers er oppført i Tabell 1. Antistofftitere ble bestemt for hvert antistoff ved hjelp av positive og negative kontrollsvev etter produsentens anvisninger.
Immunohistochemistry Analyse
Immunohistokjemiske analyser var scoret av to uavhengige patologer, hver blinde for fiksering metodikk for hvert bilde, ved hjelp av en H-score for semiquantitation av farging proporsjoner og intensitet [14]. I tilfeller med både
i situ Hotell og invasiv neoplasi, ble bare invasive svulster bort fra kantene av vevsprøve scoret. Høy intensitet flekker som var tydelig henvist til den absolutte vevkanter (dvs. det som oftest referert til i klinisk immunhistokjemi som en «edge-effekt» [15]) ble ignorert. Poeng ble avblindet av en tredjepart, og alle H score fra hver patolog ble plottet mot hverandre for hver markør. Poeng som dukket subjektivt discrepant, dvs. de som vesentlig avvek fra linjen av identitet som vurderes ved visuell inspeksjon, ble gjennomgått i fellesskap på en multi-ledet mikroskop og en konsensus Poengsummen ble generert.
Statistical Analysis
Alle analyser ble utført ved hjelp av R statistikk pakke. For hvert tilfelle ble H score fra de to lesere i gjennomsnitt. Statistiske forskjeller mellom feste grupper (24 hr vs 2 + 2, 24 timers vs kald iskemi) ved hjelp av en tosidig paret Wilcoxon Signed Rank test. Fordi flere forhold ble vurdert samtidig, ble p-verdier for disse sammenligningene omgjort til falske funnrate korrigert q-verdier [16], [17]. Boksplott i figur 1 ble generert med pakken ggplot2. Svarte striper representerer medianverdier og bokser strekker seg fra 25
th 75
th persentiler. Linjene utvides til 1,5 × den interkvartilt avstand.
H score til fargeintensitet for alle studert biomarkører, ved behandling tilstand. «2 + 2» er den raske fiksering tilstand, «24 hr.» Er standard 24-timers romtemperatur tilstand uten pre-fiksering kald iskemi, og «iskemi» betegner en 1-times kald iskemiske perioden før 24-timers room temperatur fiksering. Medianer er representert ved horisontale linjer, boksene i plottene svarer til den 25
th og 75 persentiler for hver fordeling, linjene strekker seg til de mest ekstreme verdi som er innenfor 1,5 ganger avstanden mellom det første og tredje kvartiler, og data utover værhårene er vist som prikker.
resultater
H-score for alle markører er grafisk representert i boksplott Figur 1, og resultatene av sammenligningstester er vist i tabell 2 .
Svært få tilfeller viste nevneverdig farging for tre av markører (BRAF V600E, pMEK1 /2, og Pakt), men to tilfeller var entydig positive for BRAF V600E mutasjon, et funn bekreftes av molekylær analyse (data ikke vist). Samlet er 2 + 2-protokollen gitt like mye eller mer IHC signal enn 24 timers behandling, med representative flekker resultatene vist i Figur 2. Mens flere casespesifikke forskjeller er markert i figur 2, var det ingen statistisk signifikante forskjeller ble observert på flere parvise sammenligninger på tvers av de 24 tilfellene (tabell 2). Tabell 2 viser at to markører syntes å ha noe økt flekker i 24 timers behandling (EGFR og perk), men igjen, disse forskjellene var ikke statistisk signifikant, heller ikke patologene scoring prøvene finner alle fall hvor avvikende flekker mellom 2 + 2 og 24 timers betingelser ville føre til en endring i patofysiologiske tolkning av disse to markører.
Representative resultater fra IHC analyse av to prøver kolon karsinom utsatt for enten en rask fiksering tilstand ( «2 + 2») eller standard 24 -timers romtemperatur tilstand uten pre-fiksering kald iskemi ( «24-timers»). Perk, pMTOR, pMEK1 /2 og pPRAS40 er vist for en sak og pBAD og Pakt vises fra en annen sak. To forskjellige tilfeller vises her fordi ikke alle tilfeller viste farging for alle markører. Alle mikrografer er tatt på 200 × med tilsvarende eksponeringer.
IHC signalet ble mye mer ugunstig påvirket av lengre en times kald iskemi periode før fiksering i forhold til de kortere iskemiske intervall protokoller, med unntak av EGFR. Disse trendene var svært statistisk signifikant for pEGFR og pMSK1, og reduksjonen i perk farging nærmet statistisk signifikans. I to tilfeller i spesifikk, som er vist i figurene 3 og 4, karsinomer husing BRAF V600E mutasjon ble funnet å være klart positivt for pEGFR i begge av de kortere iskemiske intervall forhold, men farging var nesten fullstendig fraværende når prøven ble utsatt for lengre 1 time kald iskemi tilstand.
Representative bilder av en colonic carcinoma tilfelle farget med antistoffer mot BRAF V600E, pEGFR, EGFR, og pMSK1, som viser betydelig tap av pEGFR flekker i iskemi tilstand. Alle mikrografer er tatt på 200 × med tilsvarende eksponeringer.
representant for en andre kolonkreft tilfelle farget med antistoffer mot BRAF V600E, pEGFR, PTEN, og pMSK1, viser betydelig tap av pEGFR flekker i iskemi betingelse. Alle mikrografer er tatt på 200 × med tilsvarende eksponeringer.
Diskusjoner
Funnene i denne studien viser tydelig at en betydelig post-kirurgisk, pre-fiksering kald iskemisk intervall (en time ) forundrer forsøket på å identifisere de fosforylering tilstander av en nøkkel PI3 kinase vei element i formalinfiksert vev. Dette funnet er i samsvar med tidligere rapporter som indikerer betydelig preanalytiske følsomheten Fosfoproteinet analyser [7], [18]. Hvis forsiktig prøvehåndtering er ansatt for å minimere den kalde iskemisk intervall (mindre enn 17 minutter), men både 24-timers romtemperatur formalin fiksering og vår raske to-temperatur fiksering protokollen bevare fosforylering signaler gjennomsnittlig for vesentlig alle markører undersøkt. Hvorfor noen markører ble mer påvirket av kulde iskemi er uklart for oss; balansen mellom uhindret kinase og fosfatase aktivitet under kalde iskemiske intervaller er ikke sannsynlig å spille ut likt for hver fosforylering mål, men så identifisere disse målene med overdrevne overfølsomhet for kulde iskemi gjennom studier som dette vil være svært viktig som innen Fosfoproteinet immunhistokjemi fremskritt.
Når prefixation kald iskemi tid strekker til en time anses et akseptabelt intervall i dagens ASCO /CAP retningslinjer for ER testing [3], fant vi at signalet fra utvalgte fosfoproteiner minker betraktelig. Nærmere bestemt i to eksemplarer funnet til båtplass BRAF V600E mutasjon (figur 3 og 4), 1-timers kulde iskemisk intervall syntes å tilsløre uttrykk for pEGFR, en feil som kan føre til svikt for å identifisere disse pasientene som kandidater for ytterligere terapi [12], [13], [19]. I disse to tilfellene er den raske to-temperatur fiksering protokoll ga tydelig mer pEGFR flekker enn det 24-timers fiksering protokoll, noe som indikerer at den raske protokollen kan være en mer robust metodikk for å vurdere denne klinisk signifikant biomarkør aktiveringstilstanden. En lignende trend er observert i noen flere markører (f.eks. PBAD, Pakt) i utvalgte tilfeller vist i figur 2. Dette funnet tydelig fremhever den potensielle effekten av preanalytiske prøvehåndtering i en tid med personlig medisin, siden bevaring av biomarkør aktiverings stater ser ut til å være relativt konstant i gjennomsnitt mellom fiksering protokoller for enkelte biomarkører, men skiller seg vesentlig for konkrete saker.
Flere studier har nå identifisert som MAPK pathway reaktive utgjør en mekanisme for terapi motstand i BRAF V600E mutert kolorektal karsinom som er behandlet med vemurafenib [1], [20], [21].
In vitro
og xenograft-modeller viser at dette motstandsdyktig tilstand kan overvinnes ved kombinasjonsbehandling inkluderer EGFR-inhibitorer rettet mot pEGFR, men denne metoden forutsetter evnen til diagnostikeren til å identifisere pEGFR overekspresjon i den kliniske prøven vev. Mens den eksisterende litteraturen viser at kombinasjonsbehandling har mye potensiell nytte for pasienter med disse spesifikke kreft fenotyper, våre funn tyder på at alt dette potensielle fordelen er i fare hvis en ukontrollert vev bevaring og fiksering prosessen er ansatt. De to pasienter med karsinom næret BRAF V600E mutasjoner, for eksempel, ville ikke bli identifisert som kandidater for EGFR-rettet terapi hadde sine prøver er samlet inn med den lengre en time kald iskemisk intervall som ikke bare sett i kliniske patologi områder, men er også anses akseptabelt i en gjeldende kreft biomarkør analyse retningslinje. Utover disse kliniske betraktninger, er det også verdt å vurdere de ekstreme kostnadene forbundet med romanen målrettet terapi, slik at misidentifying pasienter som kandidater for behandling kan være ikke bare personlig skadelig, men også økonomisk sløsing.
I tillegg til BRAFV600E /pEGFR eksempel , det er også bemerkelsesverdig at ekstra fordel uttrykk er redusert etter en time kald ischemi (se tabell 2). Ettersom ekstra fordel har vært brukt til å overvåke behandling effekt, denne effekten, hvis til stede i en klinisk assay, potensielt kan svekke terapi overvåking. Også i utvalgte tilfeller (figur 2), tilsynelatende pBAD uttrykk kan reduseres ved prefixation iskemi, konfunderende vår evne til å vurdere uttrykk for en faktor kjent for å være relevant for tykktarmskreft patogenesen [19].
En mulig svakhet ved denne studien er at relativt få prøver ble undersøkt. Mens alle prøvene ble analysert for alle merkene, de høye kostnadene og vanskelighetene med å skaffe prøver med presist definerte preanalytiske behandlinger fra vår kommersielle leverandør utelukket studiet av flere prøver. Åpenbart vil flere større studier være gunstig for å bekrefte disse funnene. Arbeid på xenograft-modeller kan også forventes å være fordelaktig i dette området, og det har faktisk vært så i vårt tidligere arbeid med dette [11] på grunn av den utsøkte kontroll over preanalytiske forhold som er mulig i disse systemer. Men vi valgte å jobbe med kliniske prøver her fordi de er mer relevante til dagens problemer i translasjonell kreftforskning. Det bør bemerkes at 10-minutt kald iskemi tider av prøver samlet inn under denne forskningsprotokoll ikke er vanligvis observert i dagens anatomiske patologi praksis, kan heller ikke slike raske kald iskemi ganger være oppnåelig med dagens prosesser på plass i kliniske laboratorier. Selv om det kan være en utfordring å innlemme våre funn i standard kliniske arbeidsflyten fordi mange av dagens medisinske fasiliteter er ikke i stand til å redusere iskemiske ganger betydelig, tror vi vår data indikerer at standardisering og optimalisering av preanalytiske forhold er minst et verdig mål.
En annen potensiell svakhet er at fosfoprotein signal skårer over behandlingsforhold ikke ble sammenliknet med klinisk validerte rille terskler, rett og slett fordi ingen slike terskler finnes for markører som er undersøkt her. Hva vi observert med vår semikvantitativ tilnærming, var imidlertid at signalene ble ofte dramatisk redusert i prøver med en lang prefixation iskemisk intervall, og at i de to konkrete saker vi snakket om, den lange prefixation iskemisk intervall syntes å ablate all relevant signal fra en kritisk biomarkør. I disse tilfellene, de kontrollerte fiksering protokoller vi undersøkt bevarte signaler som trolig ville bli tolket, i medisinske vurdering av to praktiserende patologer, som patofysiologisk betydning for potensiell terapi.
Til slutt, mens vi har tolket tap av phosphoprotein IHC signaler som indikasjoner på skadelige preanalytiske effekter, kan det være tilfelle som øker i farging var de sanne gjenstander og at redusert flekker var nærmere den sanne tilstand
in situ
. Men andre har vist at tallrike phosphomarkers, deriblant pakt, er tydelig redusert i sammenheng med endrede fiksering tilstander eller kald ischemi [22], [23], så vår tolkning er ikke uten presedens. Selv om dette spørsmålet aldri kan løses uten fremtid
in vivo
studier, hva er helt klart fra dette arbeidet er at endringer i den tilsynelatende aktiverings statene mange relevante kreft biomarkører synes å være følsomme overfor vanlige preanalytiske variabler. Av disse variablene, er den iskemiske intervall kanskje en av de viktigste, og derfor mener vi at videre forskning og kliniske studier må inkludere kontroller som adresserer denne faktoren.
Hjelpemiddel Informasjon
Tabell S1.
Raw H-poengsum data for alle tilfeller undersøkt i denne studien
doi:. 10,1371 /journal.pone.0113608.s001 plakater (XLSX)
