Abstract
Valg av lungekreft pasienter for behandling med tyrosinkinasehemmere rettet mot EGFR krever identifisering av spesifikke
EGFR
mutasjoner. I de fleste pasienter med avanserte, ubrukelige lungekarsinom begrenset tumorprøver ofte representerer det eneste materialet tilgjengelig for både histologisk typing og molekylær analyse. Vi definerte en neste generasjons sekvensering protokollen målrettet for å
EGFR
eksoner 18-21 egnet for rutinediagnostikk av slike kliniske prøver. Protokollen ble godkjent i en uselektert serie av 80 små biopsier (n = 14) og cytologi (n = 66) eksemplarer representative for materialet vanligvis sendes for diagnostisk vurdering til tre henvisning medisinske sentre i Italia. Prøvene ble systematisk undersøkt for tumorcelle antall og andel i forhold til ikke-neoplastiske celler. De ble analysert i grupper på 100-150 amplikonene per løp, og nådde en analytisk følsomhet på 1% og skaffe et tilstrekkelig antall lyder, for å dekke alle eksoner på alle analyserte prøvene. Neste generasjon sekvensering ble sammenlignet med Sanger-sekvensering. Sistnevnte identifisert 15
EGFR
mutasjoner i 14/80 tilfeller (17,5%), men hadde ikke oppdaget mutasjoner når andelen av neoplastiske celler var under 40%. Neste generasjons sekvensering identifisert 31
EGFR
mutasjoner i 24/80 tilfeller (30,0%). Mutasjoner ble detektert med en andel av neoplastiske celler så lavt som 5%. Alle mutasjoner identifisert av Sanger-metoden ble bekreftet. I 6 tilfeller neste generasjon sekvense identifisert exon delesjoner 19 eller L858R mutasjonen ikke sett etter Sanger-sekvensering, slik at pasienten som skal behandles med tyrosinkinaseinhibitorer. I ett ekstra tilfelle R831H-mutasjonen i forbindelse med behandling motstand ble identifisert i en
EGFR
vill type svulst etter Sanger-sekvensering. Neste generasjons sekvensering er robust, kostnadseffektiv og forbedrer deteksjonen av
EGFR
mutasjoner. Bruken bør fremmes for klinisk diagnose av mutasjoner i prøver med ugunstige tumor celleinnhold
Citation. De Biase D, Visani M, Malapelle U, Simonato F, Cesari V, Bellevicine C, et al. (2013) Next-Generation Sequencing av Lung Cancer
EGFR
Eksoner 18-21 Lar Effektiv molekylær diagnostikk av små rutineprøver (cytologi og biopsi). PLoS ONE 8 (12): e83607. doi: 10,1371 /journal.pone.0083607
Redaktør: Pan-Chyr Yang, National Taiwan University, Taiwan
mottatt: 18. august 2013, Godkjent: 05.11.2013; Publisert: 23.12.2013
Copyright: © 2013 de Biase et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne bekrefte at denne studien ble støttet av en italiensk regjering MURST tilskuddet (Grant no. 20093XZC57_003) til GT. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. Ingen ekstra ekstern finansiering ble mottatt for denne studien
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lung carcinoma presenterer ofte på avansert stadium og er den ledende årsak til kreft dødsfall i utviklede land (https://seer.cancer.gov/statfacts/html/lungb.html#survival). Oppdagelsen i 2004 at aktivering somatiske mutasjoner i tyrosinkinase
EGFR
genet gjør svulsten følsomme for tyrosinkinasehemmere (TKI) behandling har representert en av de mest betydningsfulle gjennombrudd innen molekylær onkologi i det siste tiåret [1,2]. Randomiserte kliniske studier har vist pasientsvar TKI Erlotinib (Tarceva, OSI Pharmaceutical) eller Gefitinib (Iressa, Astrazeneca) som førstelinjebehandling i omtrent to tredjedeler av pasienter med
EGFR
mutert svulster med priser langt bedre enn de som oppnås med konvensjonell platina-basert kjemoterapi [3-9].
EGFR
mutasjoner har blitt «kritiske» biomarkører til riktig velge pasienter for TKI behandling, og retningslinjer for molekylær diagnostikk har blitt skissert av profesjonelle organisasjoner både i Europa og i USA [10, 11]. De fleste – 80-90% – av
EGFR
mutasjoner er enten små ekson 19 slettinger eller L858R mutasjon i ekson 21, men andre TKI sensitive
EGFR
mutasjoner kan oppstå i eksoner 12, 19 , 20, 21. Mutasjoner assosiert med TKI motstand, som T790M i ekson 20, kan også utvikle seg i små tumorcelle sublclones og må identifiseres [1,2,8,12-23].
EGFR
muterte svulster er vanligvis adenokarsinomer, hvor mutasjoner kan identifiseres i omtrent en fjerdedel av tilfellene, og i en høyere andel av svulster fra asiatiske pasienter.
adenokarsinomer er nå regnet som den vanligste lungekarsinom subtype, som utgjør ca 40% av alle ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) [24] og molekylære analyser av
EGFR
eksoner 18, 19, 20, 21 anbefales i alle adenokarsinom eller lungesvulster med en adenokarsinom-komponent [10]. Dermed blir patologisk evaluering av en lungekarsinom krever nå både en nøyaktig inndeling i undergrupper av histologiske og immunhistokjemiske studier samt fastsettelse av
EGFR
mutasjonsstatus for å velge pasienter for TKI behandling. Denne inngående vurdering åpenbart krever tilstrekkelige mengder av tumorvev av god kvalitet, som de hentet fra lunge resections [25].
Dessverre 60% av NSCLC er høy scene lokalt avansert og /eller ubrukelige svulster som allerede har metastasert å fjerne områder av den tiden de blir oppdaget (https://seer.cancer.gov/statfacts/html/lungb.html#survival). Derfor, i pasienter med slike svulster svært begrenset prøver – små biopsier eller cytologiske prøver – er vanligvis det eneste materialet tilgjengelig for histologisk skrive og for molekylær analyse [26]. I disse prøvene utstedelse av prøven renhet, dvs. andelen av angrepne materiale til «forurensende» godartede eller ikke-angrepne celler er ofte kritisk [27,28]. Sanger-sekvensering, gjør den mest brukte metode for påvisning mutasjonen ikke har nok analytiske følsomhet for på en pålitelig måte å identifisere mutasjoner i prøver med en lav andel av tumorceller. Det kan gi falske negative resultater hvis andelen av neoplastiske celler er under en generell terskel på 50% som tilsvarer 25% muterte alleler, forutsatt at mutasjonen er heterozygot og at
EGFR
kromosom nettstedet 7p12 er dysomic [29 ]. Derfor alternative metoder – hver med sine egne fordeler og ulemper – har vært foreslått å oppdage
EGFR
mutasjoner med mål om å oppnå høyere følsomhet. Mange er i dag brukt for molekylær analyse av rutineprøver [30]. Disse inkluderer høy oppløsning Smelte (HRM) [31], rflp (RFLP) [32], mutant allel-spesifikk PCR [33], Peptide Nucleic Acid Låst PCR Klem (PNA-PCR) [34,35], pyrosequencying [36], og immunhistokjemi med spesifikke EGFR antistoffer som gjenkjenner den L858R mutasjon og ekson 19 sletting [37,38]. Noen mutasjonsspesifikke metoder som de Scorpion ARMS (TheraScreen EGFR29 mutasjon kits fra Qiagen Manchester [tidligere DxS], Manchester, England) [39] nå svært høy følsomhet (~ 1%), men undervurdere ikke forhånds designet mutasjoner og krever en ganske betydelig mengde DNA, ikke alltid tilgjengelig i et begrenset prøver [40,41]
utviklingen av neste generasjon sekvensering (NGS) metoder -. også kjent som massiv parallell sekvense siden de tillater parallellanalyse av en meget stor antall DNA-molekyler – har representert en av de mer betydelige tekniske fremskritt innen molekylær biologi [42]. Disse metodene har blitt tilgjengelig siden 2005 og produserer bemerkelsesverdig gjennombrudd i onkologi, herunder definisjonen av hele DNA-sekvensen av vanlige typer humane cancere [43].
Dette er en multisentrisk studie for å evaluere bruken av NGS til molekylær diagnostikk av
EGFR
mutasjoner i begrensede prøver av NSCLC, små biopsier og cytologiske prøver. I stedet for å analysere noen tilfeller for et stort antall gener, valgte vi å målrette parallell sekvensering til
EGFR
mutasjon «hot spots». Det er fokusert på
EGFR
analyse fordi, som nevnt ovenfor,
EGFR
mutasjoner ofte behov for å bli identifisert i DNA ekstrahert fra prøver som både er problematisk for molekylær diagnose og samtidig er meget avgjørende å bestemme pasientens behandling. NGS sekvense Resultatene ble sammenlignet med de av Sanger-sekvensering, metoden i bruk for rutinen molekylær analyse i de tre italienske partner sentre i Bologna, Padova og Napoli, som deltok i studien.
Vi tenkte at i til tross for sin større kompleksitet sammenlignet med Sanger-sekvensering (eller andre alternative metode) NGS gir flere fordeler – høy analytisk sensitivitet, screening av hele nukleotidsekvensen til målregionen, semikvantitativ evaluering av det muterte allel, analyse av mange prøver i et enkelt løp (high throughput) – som gjør det ideelt for studiet av lungekarsinom. Våre resultater tyder på at NGS kan effektivt brukes til å møte behovene til rutine DNA-analyse, og at den representerer et praktisk alternativ til andre metoder som i dag brukes til å påvise
EGFR
mutasjoner.
Materialer og Metoder
Etikk erklæringen
Siden
EGFR
mutasjonsanalyse er en del av rutinen diagnostiske workup av pasienter med NSCLC behovet for etikk komiteens~~POS=HEADCOMP godkjenning var ikke nødvendig for denne studien, i samsvar med medisinske etiske retningslinjene fra Azienda Unità Sanitaria Locale di Bologna, Azienda Universitaria Policlinico Università degli Studi di Napoli Federico II, Azienda Universitaria Policlinico Università degli Studi di Padova og i samsvar med generell fullmakt til å behandle personopplysninger i vitenskapelige forskningsformål fra «The Italian data Protection Authority «(https://www.garanteprivacy.it/web/guest/home/docweb/-/docweb-display/export/2485392). Følgelig disse retningslinjene, ble en omfattende skriftlig informert samtykke signert for prosedyrene (tynn nål aspirasjon, biopsier og kirurgiske reseksjoner) som produserte vevsprøver og for deres diagnostiske workup. All informasjon om den menneskelige materialet ble styrt ved hjelp av anonyme tallkoder. Kliniske data og følge opp informasjonen ble ikke brukt i denne studien. Alle prøver ble håndtert i samsvar med Helsinkideklarasjonen (https://www.wma.net/en/30publications/10policies/b3/).
Case utvalg og innsamling av tumormateriale for molekylær analyse
Åtti prøver av NSCLC ble tilfeldig valgt fra pasienter som gjennomgikk diagnostisk workup på deler av Anatomisk patologi i Bellaria Hospital-universitetet i Bologna og Maggiore Hospital i Bologna, og i universitetssykehusene i Napoli og Padova. Alle pasientene hadde en klinisk indikasjon for
EGFR
mutasjonstesting for avansert lungekreft. Tumorceller for molekylær analyse ble hentet fra cytologi lysbilder i 66 tilfeller og fra formalinfiksert parafin innebygd (FFPE) vevssnitt i 14 biopsiprøver. Både cytologiske og biopsiprøver ble rutinemessig behandlet og diagnoser gjengitt i henhold til standardkriterier.
Alle tilfeller ble bearbeidet for DNA-ekstraksjon etter patologisk vurdering sikret nærvær av minst ett hundre neoplastiske celler. Andelen av neoplastiske celler /totalt antall celler (dvs. tumorcelle berikelse) ble beregnet på alle tilfeller. Det totale antall av neoplastiske celler som er tilstede i prøven behandlet for molekylær analyse ble også evaluert. Det ble beregnet som følger: i en gitt prøve neoplastiske celler ble tellet i en fem kvadratmillimeter feltene (1 mm
2) og middelverdien av disse fem verdier beregnet; middelverdien ble deretter multiplisert for det totale arealet (i millimeter) av prøven – cytologi smøre eller histologi delen av biopsi -. valgt for molekylær analyse
For cytologiprøvene celler ble skrapet fra valgt for analyse området etter cover-slip fjerning ved nedsenkning av raset i xylen. For FFPE materiale, ble seks 10 mikrometer tykke seksjoner kuttet fra hver valgte blokk, etterfulgt av en Hematoxylin og eosin flekken (H E) kontroll lysbilde. Svulsten området ble markert på kontroll lysbilde og tumor materiale ble manuelt dissekert etter mikroskopisk veiledning fra de tilsvarende 10 mikrometer seksjoner ved hjelp av en steril kniv. Tjue flere DNA-prøver – tidligere karakteriserte for
EGFR
mutasjonsstatus – ble brukt til å vurdere reproduserbarheten av 454 parallell sekvensering (se nedenfor)
DNA-ekstraksjon
For Sanger. sekvensering DNA ble ekstrahert i henhold til standardprosedyrer som tidligere rapportert [44-46]. For å sikre maksimal avkastning av DNA for NGS to forskjellige protokoller ble fulgt for cytologi og biopsiprøver. DNA ble ekstrahert fra cytologiprøvene hjelp MasterPure DNA Purification Kit (Epicentre, Madison, WI, USA) i henhold til produsentens anvisninger. For eksempler hentet fra biopsier DNA ble ekstrahert med High Pure PCR mal Preparation Kit (Roche Diagnostics, Mannheim, Tyskland) etter produsentens protokoll.
Sekvense
Åtti prøver ble testet for
EGFR plakater (ekson 18, 19, 20 og 21) ved hjelp av Sanger og /eller Next Generation sekvensering. Sanger-sekvensering ble utført på molekylært Patologi fasilitetene på Anatomisk patologi deler av Bellaria Hospital-universitetet i Bologna (33 tilfeller), ved University Hospital of Naples (29 tilfeller) og av Padova (18 tilfeller). Neste generasjon sekvensering av alle tilfeller ble utført parallelt ved hjelp av en 454 GS-Junior Next Generation sequencer på Molecular Pathology innretningen av Bellaria Hospital-universitetet i Bologna, Anatomisk patologi delen, fra rutinemessig behandlet materiale som opprinnelig ble valgt fra Anatomisk patologi delen av Bellaria Hospital og fra de sender institusjoner i Padova og Napoli. Negative kontroller og ingen mal DNA-kontroller ble inkludert i alle løyper.
Sanger-sekvensering.
PCR reaksjoner ble utført ved hjelp av FastStartTaq DNA polymerase kit (Roche Applied Science, Mannheim, Tyskland), fra 15-50 ng av DNA. Primerne anvendt for PCR, er beskrevet i tabell 1. PCR-produkter ble kontrollert på 2,5% agarosegel og amplikonene renses ved bruk av Agencourt Ampure XP-kuler (Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA, USA). Sekvensering ble utført i henhold til standard prosedyrer ved hjelp av GenomeLab DTC Kit (Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA, USA) og en CEQ2000 XL automatisk DNA sequencer (Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA, USA) i Bellaria Hospital ved hjelp av BigDye Terminator kit (versjon 3.1, Life Technologies). og kjøre på ABI 3730 analysator (Life Technologies) i Napoli universitetssykehus og i Padova universitetssykehus
EGFR
Exon
Sanger-sekvensering 5′-3 «
NGS 5′-3′
en
Lengde (bp)
Ex18 FwCATgTCTggCACTgCTTTCCggCTgAggTgACCCTTgTC184Ex18 RvAgggACCTTACCTTATACACCgCCTgTgCCAgggACCTTACEx19 FwAgCATgTggCACCATCTCACAgCATgTggCACCATCTCAC182Ex19 RvATgAgAAAAggTgggCCTgACCCACACAgCAAAgCAgAAAEx20 FwAgCCACACTgACgTgCCTCTAgCCACACTgACgTgCCTCT208Ex20 RvCCTTATCTCCCCTCCCCgTATgCACACACCAgTTgAgCAgEx21 FwTgCAgAgCTTCTTCCCATgACCTCACAgCAgggTCTTCTC196Ex21 RvgCATgTgTTAAACAATACAgCCCACCTCCTTACTTTgCCTCCTTable en. primere som brukes til forsterkning av EGFR eksoner 18-21
en primere for 454 neste generasjons sekvensering er knyttet til en sekvens av 10 nukleotider (MID – Multiple Identifier)., 4 nucleotide av «veikryss» og 25 nucleotide av » universell sekvens «, i henhold til produsentens instruksjoner (ikke vist i tabell). Ex, Exon; Fw, Forward; Rv, omvendt. CSV Last ned CSV
454:. Next Generation Sekvense
Sekvensanalyse av
EGFR
ekson 18, 19, 20 og 21 ble utført med 454 GS-Junior Next Generation sequencer (Roche Diagnostics , Mannheim, Tyskland) i henhold til etablerte protokoller (https://www.454.com/).
Kort, disse inkluderer følgende: PCR amplifikasjon av målsekvensen, rensing av de forsterkede fragmenter, emulsjon PCR, og utvinning av emulsjon PCR-produkter som deretter lastet på Titanium PicoTiterPlate (Roche Diagnostics) fra 454 GS Junior instrument for massivt parallell pyrosekvensering. Primere for første forsterkning løp er modifisert med universelle halesekvenser og flere identifikatorer (MID) nukleotider (Integrated DNA Technologies Inc, www.idtdna.com). En bestemt par MID sekvenser identifiserer entydig hver prøve (target-sekvens).
For
EGFR
mutasjonsanalyse vi definert følgende arbeidsflyt format, ved hjelp av primere vist i tabell 1 for å analysere eksoner 18- 19-20-21. Omtrent 10 ng genomisk DNA ble amplifisert for hvert exon. Alle PCR-reaksjoner ble utført ved å bruke et Faststart High Fidelity Taq Polymerase (Roche Diagnostic, Mannheim, Tyskland). I hvert sekvense kjøre 100 til 120 ulike målgrupper sekvensene ble analysert for parallell pyrosekvensering. Dette tillot oss å studere 25-30 tilfeller per løp, siden alle fire
EGFR
eksoner ble evaluert på alle pasienter, med en antatt antall på ca 700 leser per mål, ifølge produsentens spesifikasjoner (http: //. www.454.com/)
med tanke på at hvert mål sekvens – exon og pasientspesifikke – er entydig identifisert ved en bestemt par MID, minst 5 forover primere og minst 6 reverse primere med unike MID var nødvendig å analysere 30 saker i samme løp (eller omvendt minst 6 forover primere og minst 5 omvendte seg). Vi brukte nettskjemaer per hvert
EGFR
ekson å identifisere den unike sammenhengen mellom MID par og konkrete mål sekvenser (se figur 1). Både forover og bakover tråd sekvenser ( «leser») ble evaluert etter parallell forsterkning av målet DNA. De oppnådde sekvensene ble analysert ved hjelp av Amplicon Variant Analyzer (AVA) Programvare (Roche Diagnostics, Mannheim, Tyskland). Bare nukleotidvariasjoner observert i begge trådene ble ansett for mutasjons samtale. Tvetydige basis samtaler knyttet til strekninger av homo fire basepar eller lenger ble ikke vurdert mutert på grunn av begrensninger i den pyrosekvensering kjemi som brukes av 454 NGS for sekvensanalyse [47,48].
For å sikre at det i en gitt 454 neste generasjons sekvense kjøre et bestemt mål sekvens er forbundet med en unik par MID vi brukte grid ordninger; På midten par for EGFR ekson 18 er illustrert; romertall indikerer individuelle pasientprøver. Ex, Exon; Fw, Forward; Rv, Omvendt
Analytisk sensitivitet
Den analytiske sensitiviteten av vår 454-sekvensering arbeidsflyt format for
EGFR
mutasjonsanalyse ble testet av serielt fortynne (1:.. 1 1: 2, 1:10, 1: 100, 1: 1000) DNA fra en pool av prøver skjuler en homozygot nucleotide polymorphism G A i 2470 posisjonen til
EGFR
sekvens (c2470 G A , CAG CAA, Q787Q ekson 20) i en pool av prøver som ikke havna nucleotide substitusjon (c2470, CAG). Hver analyse ble gjentatt minst to ganger.
minimal mengde av inngangs DNA ved den analytiske sensitivitetsterskelen.
Inngangs DNA ved den analytiske sensitiviteten terskelen ble seriefortynnet i H
2O for å bestemme minimalt med DNA nødvendig for mutasjonsdeteksjon
454:.. Next Generation Sequencing reproduserbarhet
Inter-analyse reproduserbarhet (dvs. konsistensen av resultatene med den samme protokollen i forskjellige nedfarter) ble analysert ved gjenta sekvensanalyse av 20 DNA-prøver som tidligere var preget for sin
EGFR
mutasjonsstatus (11 villtype saker og 9
EGFR
mutert seg – 7 med en delesjon i ekson 19, en med den L858R og ett med T790M mutasjoner).
Resultater
Utførelse av 454 Next Generation Sequencing protokollen
Analytisk sensitivitet og definisjon av terskelen for mutasjons samtale.
Den analytiske sensitiviteten av 454 NGS avhenger av det totale antall lesninger som kan oppnås for en gitt prøve. Etter vår 454 sekvenseringsformat protokoll, som er rettet mot en antatt antall på ca. 700 leser pr amplikon, testet vi en serie (1: 1, 1: 2, 1:10, 1: 100, 1: 1000) fortynning av DNA med c 0,2470 G et nukleotid substitusjon på 2470 polymorfe stedet av
EGFR
gensekvens i en pool av menneskelig DNA uten substitusjon (c.2470 G)
c.2470 G en substitusjon var konsekvent påvist ned til en 1: 100 fortynning bare hvis minst 10 samtykkende c.2470 G en nukleotid-leser ble oppnådd etter parallell 454 sekvensering. Denne observasjonen er illustrert i figur 2. Med en 1: 100 fortynning av c.2470 G ble det observert en DNA nukleotidsubstitusjon når det totale antall lyder var 2359, tilsvarende 23 samtykkende c.2470 G A-sekvensene (figur 2D ). Det ble ikke observert når det totale antall lyder var 750, som ville ha tilsvarte 7 frivillig c.2470 G A-sekvensene (figur 2E). Den c.2470 G A substitusjon ble heller ikke observert med en 1: 1000 fortynning, selv når det totale antall lesninger analysert var svært høy (mellom 3000 og 4000), men ikke nok til å nå 10 c.2470 G A står som ville ha krevd en total på 10.000 leser per fragment (figur 2F)
AF) det polymorfe c.2470 G en substitusjon ble observert med følgende fortynninger av DNA ikke bærer polymorfisme. 1: 1 ( A) 1: 2 (B), 01:10 (C), 1: 100 (D), men ikke ved 1: 1000 (F). Ved 1: 100 fortynning av c.2470 G ble observert A substitusjon når det totale antall lesninger lov til å detektere minst 10 leser med c.2470 G En endring (dette betyr at i det minste 1000 total leser) (D). Den c.2470 G En substitusjon ble ikke observert når det totale antall leser var ikke tilstrekkelig til å oppdage minst 10 lyder med c.2470 G . En endring (E)
Basert på disse observasjonene vi etablerte som kriterier for å definere en prøve mutert identifikasjon av mutasjon i minst 10 leser (i)
og
på minst 1% av det totale antall lesninger analysert (ii). Kravet om 10 samtykkende leser gjør kriteriene for mutasjons samtalen strengere for prøver som genererer et totalt antall lyder lavere enn forventet, og dermed sikre spesifisitet av resultatene.
Minimal mengde innspill DNA på den analytiske sensitivitetsterskelen
Hvor mye DNA som kreves for å påvise c.2470 G En DNA på den analytiske følsomhet terskelen på 1% (1: 100 c.2470 G En DNA fortynning). ble serie redusert fra 10 ng , for å bestemme den minimale inngangs DNA som er nødvendig for å detektere nukleotidsubstitusjon. En minimal mengde av 2 ng DNA var tilstrekkelig til å oppnå konsekvent amplifiserbart DNA og detektere c.2470 G A substitusjon. Tatt i betraktning at hver human diploid celle inneholder 7 pg av DNA, 2 ng av en 1: 100 fortynning av c.2470 G A DNA i c.2470_G DNA som svarer til påvisning av ca. 4 muterte celler i et totalt 200 celler uten mutasjon, forutsatt at mutasjonen er heterozygot og
EGFR
dysomic.
reproduserbarhet.
for å vurdere reproduserbarheten av 454 parallell sekvense vi benyttet 20 DNA-prøver som tidligere preget for sin
EGFR
mutasjonsstatus: 11 var
EGFR
villtype, 7 hadde en ekson 19 sletting, og en hver hadde en L858R-ekson 21 mutasjon og en T790M-exon 20 mutasjon. Hver prøve ble gjentatt to ganger med 454 NGS og i alle tilfeller mutasjons status ble bekreftet. I prøvene som næret
EGFR
mutasjoner andelen muterte leser variert i gjennomsnitt 2,6% (median variasjon 1,45%, rekkevidde 0. 6% – 8,6%)
patologisk diagnose og mikroskopisk vurdering av. svulst cellularity i ikke-småcellet lungekreft prøver
Åtti saker ble undersøkt. Patologiske diagnoser er oppsummert i tabell 2. femtiseks av 80 tilfeller var foretrukne lungelesjoner diagnostisert som adenocarcinoma (n = 33) eller NSCLC ikke videre spesifisert (NOS) (n = 23). Tjueto prøver var fra tumormetastaser: 18 i lymfeknuter, 2 i pleura, og to i benet. To prøver var cytologiske preparater fra pleuravæske.
Biopsiprøver
Diagnose
Antall neoplastiske celler
en
tumorcelle berikelse
N = 1414 Adenocarcinoma848-42,504 (median: 11828) 15-80% (median: 60,0%)
ni Primær
5Metastasis (LN 3, Bone 2)
Cytologi SamplesDiagnosisNumber av neoplastiske celler
b
Tumor celle enrichmentN = 66190-730,000 (median: 11200) 5-80% (median: 42,5%) 38 Adenocarcinoma952-228,150 (median: 3956) 10-80% (median: 32,5%)
24Primary
12Metastasis (LN 10, pleura 2)
2 pleuravæske
28 NSCLC190-730,000 (median: 18000) 5-80% (median: 50,0%)
23Primary
5 metastaser (LN 5)
Total SamplesDiagnosisNumber av neoplastiske celler
en
,
b
svulst celle enrichmentN = 80190-730,000 (median: 17400) 5 -80% (median: 50,0%) 52 Adenocarcinoma848-228,150 (median: 5000) 10-80% (median: 45,0%)
33 Primær
17Metastasis (LN 13, pleura 2, Bone 2)
2 pleuravæske
28 NSCLC190-730,000 (median: 18000) 5-80% (median: 50,0%)
23Primary
5 metastaser (LN 5)
Tabell 2. Clinicopathological data av analyserte prøver
en
Antall neoplastiske celler ble vurdert i alle 14 biopsiprøver.;
b
Antall neoplastiske celler ble evaluert i 39 av 66 cytologiprøvene; kvantitativ bestemmelse av andelen av neoplastiske celler ble utført på alle 80 tilfeller. LN, Lymph Node; NSCLC, ikke-småcellet lungekarsinom. CSV ned CSV
Resultatene av evalueringen av tumorcelledannelse er oppsummert i tabell 2 og vist i figur 3. Andelen av neoplastiske celler /totalt antall celler (dvs. tumorcelle-anrikning) ble evaluert på alle tilfeller. Prosenter av neoplastiske celler varierte 5-80% (gjennomsnitt 45,2%, median 50,0%). I 35 prøver andelen av neoplastiske celler var mindre enn 40%. I halvparten av tilfellene andelen av neoplastiske celler var mindre enn 50%. Det totale antall av neoplastiske celler i prøven sendes til
EGFR
mutasjonsanalyse ble estimert i 53 tilfeller. Det varierte mellom 190 og 730 000 (gjennomsnittlig 68 147, median 17 400). En numerisk estimat av tumorcelle berikelse og av det totale antall av neoplastiske celler analysert for
EGFR
mutasjon var tilgjengelig i det hele tatt, men to tilfeller med avvikende resultater mellom Sanger og neste generasjons sekvensering (se nedenfor).
A) cytologiske prøven fra en 72 år gammel kvinne med adenokarsinom metastatisk til en mediastinale lymfeknute (mai Grumwald Giemsa, 200X forstørrelse, innfelt 600X); andelen av neoplastiske celler i prøven er 35%; DNA-analyse var villtype etter Sanger-sekvensering, men NGS viste to
EGFR
mutasjoner (G721W, R831H) (case 57 av tabell 5). B) biopsiprøve fra en 65 år gammel mann med adenokarsinom metastatisk til bein (ryggvirvel kroppen) (Hematoxylin og eosin, 200X forstørrelse, innfelt 600X); andelen av neoplastiske celler i prøven er 5%; DNA-analyse var villtype etter Sanger-sekvensering, men NGS viste L858R
EGFR
mutasjon (sak 80 av tabell 5).
EGFR mutasjonsstatus
Sanger-sekvensering .
resultatene av Sanger-sekvensering er sammenfattet i tabell 3, 4 og 5 og som er vist i figurene 4 og 5. Mutasjoner ble identifisert i 14 av 80 tilfeller (17,5%) ved hjelp av Sanger-sekvensering. I alt 15 mutasjoner ble identifisert: 10 var ekson 19 slettinger, tre var L858R (ekson 21), en var G719A (ekson 18) og en var en T790M mutasjon (ekson 20). I ett tilfelle var det en dobbel T790M og L858R mutasjon. Mutasjoner ble funnet i 9 av 52 (17,3%) tilfeller diagnostisert adenokarsinom og i 5 av 28 (17,8%) cytologiprøvene som ikke kunne være lenger subtyped og ble diagnostisert som NSCLC. De ble funnet i 3 av 14 (21,4%) biopsiprøver og i 11 av 66 (16,7%) cytologiprøvene Sanger-sekvensering detektert mutasjoner over et bredt område av neoplastisk celle nummer. En ekson 19 sletting (del L747-A752) ble identifisert i prøven med lavest antall neoplastiske celler i vår serie (190 neoplastiske celler). Men i alle tilfeller hvor Sanger-sekvensering oppdaget
EGFR
mutasjoner andelen av neoplastiske celler i utvalget var 40% (tabell 3, figur 4 og 5)
biopsiprøver
Antall muterte tilfeller
Totalt Mutasjoner observert
Mutasjoner observert i prøver med . 40% av neoplastiske celler
Mutasjoner observert i prøver med 40% av neoplastiske celler
Sanger (%)
NGS (%)
Sanger
NGS
Sanger
NGS
Sanger
NGS
N=14 3 (21,4)
en
6 (42,9)
b
494
en
8
b
01
Del Ex19
2
2
2
2
2
2
0
0
L858R
1
2
1
2
1
1
0
1
Other muts.
en
5
en
5
en
5
0
0
Cytologi SamplesNumber av muterte casesTotal mutasjoner observedMutations observert i prøvene med 40% av neoplastiske cellsMutations observert i prøver med 40% av neoplastiske celler
Sanger (%)
NGS (%)
Sanger
NGS
Sanger
NGS
Sanger
NGS
N = 6611 (16,7) 18 (27,3)
c
11221114
c
08
d
Del Ex19
8
12
8
12
8
9
0
3
L858R
3
3
3
3
3
3
0
0
Others muts.
0
7
0
7
0
2
0
5
Alle SamplesNumber av muterte casesTotal mutasjoner observedMutations observert i prøvene med 40% av neoplastiske cellsMutations observert i prøver med 40% av neoplastiske celler
Sanger (%)
NGS (%)
Sanger
NGS
Sanger
NGS
Sanger
NGS
N = 8014 (17,5)
en
24 (30,0)
d
153115
en
22
c
09
b
Tabell 3. EGFR mutasjonsanalyse ved hjelp av Sanger og Next Generation-sekvense
en
I ett tilfelle ble det observert doble mutasjoner.;
b
i to tilfeller doble /multiple mutasjoner ble observert;
c
i fire tilfeller dobbel /flere mutasjoner ble observert;
d
i seks tilfeller ble det observert dobbel /flere mutasjoner. NGS, Next Generation Sequencing; Del EX19, sletting i ekson 19; Andre muts, annet enn ekson 19 sletting eller L858R mutasjoner. CSV Last ned CSV
SANGER
Type mutationExNum tilfeller
en
Forut rolle for TKI treatmentReferencesG719A181Response [1,2,15,17] Exon 19 deletions1910Response [1,2,8,13,15-17] L858R213Response [1,14-16] T790M201Resistance [19-21] NGSType av mutationExNum tilfeller
b
Forut rolle for TKI treatmentReferencesG719A181Response [1,2 , 15,17] Exon 19 deletions1914Response [1,2,8,13,15-17] L858R215Response [1,14-16] P772S201Response (Antatte) [18] T790M201Resistance [19-21] R831H211Resistance [22] F795S201Undefined (rapportert i LN, lymfeknute;
