Abstract
Prostatakreft er den vanligste solide kreftformen hos menn, med 32.000 dødsfall årlig. Piperin, en viktig bestanddel av alkaloid sort pepper, har tidligere blitt rapportert å ha anti-canceraktivitet i forskjellige kreftcellelinjer. Effekten av piperine mot prostatakreft er foreløpig ikke kjent. Derfor, i denne studien undersøkte vi antitumor mekanismer for piperin på androgenavhengige og androgen-uavhengige prostata kreftceller. Her viser vi at piperine hemmet spredning av LNCaP, PC-3, 22RV1 og DU-145 prostatakreftceller på en doseavhengig måte. Videre Annexin-V farging viste at piperine behandling indusert apoptose i hormonavhengige prostatakreftceller (LNCaP). Ved hjelp av den globale caspaseaktivering analysen viser vi at piperin-indusert apoptose resulterte i caspaseaktivering i LNCaP og PC-3-celler. Videre undersøkelser viste at piperin behandlingen resulterte i aktivering av kaspase-3 og spaltning av PARP-1-proteiner i LNCaP, PC-3 og DU-145 prostatakreftceller. Piperin behandling også forstyrret androgen reseptor (AR) uttrykk i LNCaP prostatakreftceller. Våre evalueringer viser videre at det er en betydelig reduksjon av prostataspesifikt antigen (PSA) nivåer følgende piperine behandling i LNCaP celler. NF-kB og STAT-3 transkripsjonsfaktorer har tidligere blitt vist å spille en rolle i angiogenese og invasjon av prostatacancerceller. Interessant, behandling av LNCaP, PC-3 og DU-145 prostatakreftceller med piperine resulterte i redusert uttrykk av fosforylert STAT-3 og nukleær faktor-kB (NF-kB) transkripsjonsfaktorer. Disse resultatene korrelerte med resultatene av Boyden kammer analysen, karakterisert ved at piperin behandling reduserte cellemigrering av LNCaP og PC-3-celler. Til slutt viser vi at piperin behandling signifikant redusert androgen avhengige og androgen uavhengig tumorvekst i nakne mus modell xenotransplanted med prostatakreftceller. Samlet utgjør disse resultatene støtte videre etterforskningen av piperine som en potensiell terapeutisk middel i behandlingen av prostatakreft
Citation. Samykutty A, Shetty AV, Dakshinamoorthy G, Bartik MM, Johnson GL, Webb B, et al . (2013) Piperin, en Bioaktive komponent av Pepper Spice utøver terapeutiske effekter på Androgen Avhengige og Androgen Uavhengig prostata kreft celler. PLoS ONE 8 (6): e65889. doi: 10,1371 /journal.pone.0065889
Redaktør: Bart O. Williams, Van Andel Institute, USA
mottatt: 02.11.2012; Godkjent: 30 april 2013; Publisert: 18 juni 2013
Copyright: © 2013 Samykutty et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
Konkurrerende interesser:. forfatterne hevder at Mary Margaret Bartik og Gary Johnson er ansatt med immunokjemisystemer Technologies, LLC, Bloomington, MN, og Brian Webb er ansatt ved Thermo Fisher Scientific, Rockford , IL. Videre forfatterne oppgir at dette ikke endrer sin tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
vestlige menn blir konfrontert med en økende forekomst av kreft og kreft relatert dødsfall årlig. Statistikk viser at prostatakreft er den nest største årsaken til kreft dødsfall blant menn i USA. Ifølge de siste anslagene i USA, vil 217,730 menn være nylig diagnostisert med prostatakreft og 32,050 mennesker vil dø av denne sykdommen i 2010 [1]. Prostatakreft utgangspunktet begynner å være hormonavhengig, men som sykdommen utvikler det overganger til å være hormonuavhengig og motstandsdyktig mot hormonrelatert behandling. For tiden tilgjengelige behandlingstilbud som kjemoterapi, strålebehandling, kirurgi eller hormonbehandling er utilfredsstillende [2]. Naturlige produkter, avledet fra planter eller mikroorganismer, har blitt en viktig kilde til anti-kreft terapier, med et betydelig antall av dagens behandlingsformer som enten naturlig eller avledet fra naturlige produkter. Det er derfor en stor interesse i å identifisere naturlige forbindelser i behandling av prostatakreft. Bevis akkumulerer at forbindelser av vegetabilsk opprinnelse (fytokjemikalier) utøve anti-kreft effekt med mindre toksisitet [3]. Svart pepper, har krydder i årtusener vært mye brukt i ulike næringsmidler over hele kloden. I USA alene, har den gjennomsnittlige daglige inntaket av svart pepper er estimert til 359 mg. Piperin står for 5% til 9% av svart pepper innhold, noe som tyder på at daglig inntak på ca 60-110 mikrometer [4]. Piperin (trans-trans-isomeren av 1-piperoyl piperidin) er det aktive prinsipp og den viktigste bestanddel av svart pepper brukes som en tradisjonell medisin i India [5]. Potensialet av piperin som anti-cancer midlet er blitt vist tidligere. Piperin hemmet solid svulst utvikling hos mus indusert med DLA (Dalton Lympoma Ascites) celler og forlenget levetid på mus med Ehrlich ascites tumor [6]. Piperin har også vist seg å ha anti-invasjons aktivitet av B16F-10 melanomceller [7]. Den cytoprotective effekten av piperine på B (α) -p (bensapyren) indusert eksperimentell lungekreft har blitt undersøkt i mus og inferred at piperine kunne utøve sin chemopreventive effekt ved å modulere lipidperoksidasjon og forsterke antioksidantforsvar system [8]. Interessant, har nyere studier vist at piperine kan hemme brystkreft ved å målrette kreftstamcelle fornyelse egenskaper [9].
Til tross for sin utstrakte bruken og dens evne til å hemme flere krefttyper, lite er kjent om de gunstige effektene av piperine mot prostatakreft. Makhov og kolleger [4] tidligere viste at samtidig administrering av docetaxel og piperine resultert i forbedret anti-tumor effekt i en xenograft modell for menneskelig kastrering resistent prostatakreft via hemming av CYP3A4 aktivitet. Hittil har imidlertid ingen andre studier preget de direkte kreft effekter av piperine i prostatakreftceller til tross for å bli vist for å forbedre den kjemoterapeutiske potensialet for docetaxel mot prostatakreft [4]. Derfor er målet med studien er å bestemme anti-prostatakreft aktiviteter piperine, samt å bestemme underliggende molekylære mekanismene for sin handling.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Dyreforsøk ble utført i denne studien i henhold til retningslinjer fastsatt for omsorg og bruk av forsøksdyr og med reglene formulert i henhold til dyrevernloven av United States Department of Agriculture (USDA). Protokollen ble godkjent av IACUC komiteen ved University of Illinois, College of Medicine i Rockford og dyrestudier utført ved et anlegg akkreditert av AAALAC og USDA.
Kjemikalier og reagenser
føtalt kalveserum (FCS), RPMI-1640 og Minimum Essential Medium (MEM) ble oppnådd fra American Type Cell Culture (ATCC), Manassas, VA, USA. Piperin ble kjøpt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Celleviabilitet assay kit ble kjøpt fra Dojindo Molecular Technologies Inc., Gaithersburg, MD. Annexin V-FITC apoptose deteksjon Kit ble hentet fra MBL internasjonalt, Woburn, MA.
Cellelinjer og cellekultur
LNCaP, DU-145, 22RV1 og PC-3 cellelinjer ble oppnådd fra American Type Cell Culture (ATCC), ble Manassas, VA, USA og cellene dyrket i RPMI-medium supplert med 10% FCS og 50 ug /ml gentamycin. For alle eksperimentene, 1 x 10
5 celler /ml utsådd og dyrket i 24 timer før den eksperimentelle behandling. Celler ble opprettholdt ved 37 ° C, 5% CO
2 miljøet.
Celleviabilitet analysen
LNCaP, 22RV1, DU-145 og PC-3 celler ble sådd i 96-brønn vevskulturplater og inkubert inntil cellene festet til brønner. Alle cellene ble deretter behandlet og inkubert med forskjellige konsentrasjoner av piperin (5-200 uM) i 24, 48 og 72 timer. Celle viabilities ble bestemt ved hjelp av en celle telling kit-8 (CCK-8) fra Dojindo Molecular Technologies. 10 ul CCK-8-løsning ble tilsatt til den piperin behandlede cellsand inkubert i 3 timer. Optisk tetthet ble målt ved 450 nm ved bruk av en BIO RAD-mikroplateleser modell 680.
Caspase aktiveringstest
LNCaP og PC-3-celler ble sådd ut i 96-brønners vevkulturplater og dyrket inntil de nådde 50% konfluens. Prostata kreftceller ble deretter behandlet og inkubert med forskjellige konsentrasjoner av piperin (50-200 uM) i 24, 48 og 72 timer henholdsvis. Hver plate ble deretter inkubert med 2 mL fluorescens-merket caspase probe (NIR-FLIVO 747 In Vivo apoptose Tracer, immunokjemisystemer Technologies, LLC, Bloomington, MN) i 15 minutter. Celler ble vasket med 100 pl 1 x PBS for å fjerne caspase substrat. Etter denne, 100 ul 1 x PBS ble tilsatt til 24 timer plate, og 100 ul av fullstendig medium ble tilsatt til de 48 h og 72 h platene slik at cellene ikke vil tørke ut før de blir lest. Platene ble avlest ved anvendelse av en LI-COR Odyssey maskin V3.0 å detektere global caspaseaktivering.
Annexin V-FITC farging for apoptose deteksjon
LNCaP-celler ble dyrket i en 8-kammer vevskultur lysbilde i RPMI-1640 medium supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) og gentamycin inntil cellene festet til brønner. Cellene ble deretter behandlet og inkubert med forskjellige konsentrasjoner av piperin (60 uM og 75 uM) i 24 timer. Mediet ble deretter fjernet fra brønnene og brukes senere for PSA prøven. Apoptose ble bestemt ved hjelp av en Annexin V-FITC apoptose deteksjon kit fra MBL International. Celler ble farget ved tilsetning av 500 ul av bindingsbuffer, 5 ul Annexin, og 5 ul PI til hver brønn og inkubering i mørket ved romtemperatur i 5-10 minutter. Bindingsbuffer, ble Annexin og PI deretter fjernet fra brønnene sammen med kammeret. 2-3 dråper 1 x PBS ble tilsatt til hver del av raset og dekket. Slide ble deretter analysert ved hjelp av en fluorescens mikroskop.
PSA-analysen
PSA-analysen ble utført ved hjelp av supernatantene samlet inn fra LNCaP celler behandlet med piperine (5-150 mm). Prostata spesifikt antigen sekresjon (ng /ml) ble bestemt ved hjelp av en menneskelig prostataspesifikt antigen ELISA kit kjøpt fra Abnova.
Western blot analyse
LNCaP og PC-3 celler behandlet med 60 mikrometer og 75 uM av piperin henholdsvis og DU145-celler behandlet med 160 pM i 24 timer. I tillegg, LNCaP-celler ble også behandlet med 25 pM av piperin for å bestemme doseeffekter lave. Etter behandling ble cellene lysert med prøveoppløsningsbuffer og underkastet SDS-PAGE, overført til nitrocellulosemembran for Western blot-analyse. Følgende antistoffer ble anvendt for immunblotting. Anti-NF-kB (MBL International Inc.), anti-caspase-3 (eBioscience), anti-PARP-1 (Santacruz Biotechnology), anti-STAT-3 og anti-fosfor STAT-3 (Cell signale Technologies), anti -PSA (Thermo Fisher), anti-androgen Receptor (Sigma Aldrich) og anti β-Actin-peroksidase (Sigma Aldrich) antistoffer ble brukt sammen med leverandørens anbefalte fortynninger. Celler behandlet med 0,1% DMSO løsemiddel fungerte som kontroller.
Boyden kammeret analysen
LNCaP og PC-3 celler ble sådd i en Transwell® (Corning) kammer, behandlet og inkubert med piperine konsentrasjoner av 60 uM og 75 uM henholdsvis i 24 timer. Cellene ble deretter fjernet fra toppen av membranen ved hjelp av en pipette, og eventuelle gjenværende celler ble fjernet ved hjelp av en Q-tips. En HEMA tre flekker sett fra Fisher Scientific ble brukt til å fikse og beis cellene. Etter dette ble hver membran skyllet med vann og eventuelt gjenværende flekk ble fjernet fra toppen av hver membran ved hjelp av en Q-tips. Membraner ble analysert for cellemigrasjon ved bruk av et lysmikroskop (Nikon).
Dyr
6 uker gamle mannlige naken mus som veier ca 20 gram ble opprettholdt i Dyreavdelingen ved University of Illinois i Rockford College of Medicine. Alle eksperimentelle prosedyrer ved hjelp av dyr ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved University of Illinois i Rockford College of Medicine. LNCaP (5 x 10
6) og DU145 (1 x 10
6) celler suspendert i samme volum av Matrigel ble injisert subkutant inn i de flanke regioner av hann nakne mus og tumorene ble tillatt å vokse. Når tumoren nådde 50 mm
3 i størrelse, mus ble behandlet daglig med piperin (100 mg /kg) homogent fremstilt i vegetabilsk olje ved intraperitoneale injeksjoner i 1 måned. Kontrollgruppen ble injisert med vegetabilsk olje alene. Effektene av piperin for prostatatumorvekst i nakne mus ble også testet ved oral gavage administrering som tidligere beskrevet [10]. For sonde studie, LNCaP celler (7 × 10
6) suspendend i matrigel ble subkutant implantert i nakne mus. Etter 24 timer etter implantering av LNCaP-celler, ble musene behandlet daglig med piperin (10 mg /kg kroppsvekt) fremstilt i PBS ved oral gavage. Kontrolldyrene mottok PBS alene gavage behandling. Etter en måned med behandling ble musene avlivet ved karbondioksyd inhalering fulgt ved blodtapping og tumorene ble skåret ut og målte masse og volum. Tumorvolumene ble beregnet ved hjelp av formelen: [volum = 0,5 x (bredde)
2 x lengde. Listen
in vivo
forsøket var i samsvar med ANKOMMER retningslinjer [11].
Statistical Analysis
Statistisk analyse ble utført med Graph Pad Prism 5-programvaren. Data ble sammenlignet ved bruk av Student t-test. P 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
Piperin hemmer spredning og induserer død i begge androgen avhengige (AD) LNCaP og androgen uavhengige (AI) DU145, 22RV1, PC-3 celler i. vitro
Vi først bestemt anti-proliferative effekter av piperine på menneskelige prostata carcinoma celler inkludert androgen sensitive (LNCaP) (figur 1A) og androgen ufølsomme (PC-3, 22Rv1, DU-145 celler: Figur 1B- 1D). Cellene ble behandlet med (5-200 uM) piperin i 24, 48, 72 timer. Behandlingen av LNCaP (AD) og PC-3 (AI) celler med piperin resulterte i signifikant reduksjon av proliferasjon eller levedyktighet i en doseavhengig måte med en IC-50-verdier på 60 pM og 75 pM henholdsvis, som målt ved MTT. Ved 22Rv1 og DU-145 prostatakreftceller, piperine behandling viste høyere IC-50-verdier på 110 mikrometer og 160 mikrometer henholdsvis. Dermed synes piperin å være istand til å utøve et differensial nivå av cytotoksiske effekter, avhengig av type av prostatakreftceller med androgenavhengige prostatakreftceller (LNCaP) å være den mest følsomme en. IC50-verdiene ble oppnådd fra denne cellelevedyktighetsanalyseresultatene ble anvendt til å evaluere effektene av piperin i prostatakreftceller i etterfølgende eksperimenter.
piperin inhiberer celleproliferasjon av LNCaP, PC-3, 22RV1 og DU-145 med en IC50 på omtrent 60 uM, 75 uM, 110 uM og 160 uM i de respektive prostatakreftceller. Resultatene viste at piperine hemmet spredning av både androgen avhengige (LNCaP) og androgen uavhengige avledet prostatakreftceller (PC-3, 22Rv1 og DU145) i en tid og doseavhengig måte. Data presentert er representant for en av tre lignende eksperimenter.
Piperin behandling reduserer prostata spesifikt antigen (PSA) nivåer i LNCaP celler
PSA er gullstandarden markør som brukes i diagnostisering og overvåking behandlingseffekten av prostatakreft. Våre innledende studier viste at AR-positive LNCaP cellene følsomme for piperine behandling. Piperin behandling ved 75 pM konsentrasjon vesentlig hemmet utskillelsen av PSA til nær normalt nivå (4,244 ng /ml) sammenlignet med ubehandlede LNCaP-celler (41,24 ng /ml) (figur 2). Interessant, piperine med en lav dose rekke 25 mikrometer til 60 mikrometer hadde også en betydelig innvirkning på PSA sekresjon fra LNCaP celler.
PSA analyseresultatene viste at piperine har doseavhengig effekt på utskillelsen av PSA (nedstrøms mål av AR) i LNCaP celler. . * P 0,05 sammenlignet med kontroll LNCaP celler
Piperin induserer apoptose i PCA celler: Annexin-V FITC flekker analyse og caspaseaktivering analysen
For å finne ut om reduksjon i spredning og celleviabilitet av prostata kreftceller ved piperin var assosiert med induksjon av apoptose, ble LNCaP-celler behandlet med forskjellige konsentrasjoner av piperin og antall av apoptotiske celler ble vurdert ved hjelp av Annexin V-apoptotis deteksjon kit som tidligere beskrevet [12]. LNCaP-celler ble behandlet med 60 uM eller 75 uM av piperin i 24 timer og farget med Annexin V-FITC og propidiumjodid for å visualisere cellene under fluorescerende mikroskop. Fluorescerende mikroskopisk analyse viste at LNCaP-celler ble behandlet med piperin resultert i en økt antall av apoptotiske celler sammenlignet med kontroll LNCaP-celler (figur 3) på en doseavhengig måte (60 uM og 75 uM henholdsvis). Basert på de ovenfor angitte resultater, hvor vi bestemt at konsentrasjonen av piperin på inhibering av celleproliferasjon og induksjon av apoptose, valgte vi en piperin konsentrasjon på 60 uM for videre mekanistiske undersøkelser med LNCaP-celler.
Annexin V- FITC farging av LNCaP-celler, viser at celler behandlet med piperin var positive for annexin V-binding som det fremgår av fluorescens-signal. Pil viser celler positive for Annexin-V farging. Apoptotiske celler ble kvantifisert basert på det antall celler positive for Annexin V-farging sammenlignet med de totale celler i hvert felt. Resultatene viser at økende konsentrasjoner av piperin ført til økt apoptose som vist i tabell 1 i figur 3. Representative resultater fra en av tre uavhengige vurderinger.
I tillegg til Annexin-V-farging, vi analysert apoptose i LNCaP og PC-3 celler ved Global caspaseaktivering analysen. Caspase er en verdifull og pålitelig markør for apoptose. Vi analyserte derfor dens aktivering i LNCaP og PC-3-PCA-cellelinjer etter behandling med piperin av global caspaseaktivering analyse ved bruk av fluorescens-merket poly-caspase-probe (figur 4). Cellene ble inkubert med 50-200 pM av piperin ved forskjellige tidspunkter (24, 48, 72 timer). Både LnCap og PC-3-celler behandlet med piperin resultert i økt caspaseaktivering. Økningen i caspaseaktivering i LNCaP-celler var i en dose- og tidsavhengig måte, mens PC-3 oppviste konsekvent høye nivåer av kaspase-aktivering på både konsentrasjon og ved alle tidspunkter bortsett fra ved 48 timer, der caspaseaktivering syntes å minske og øke en gang til. Dette kan være på grunn av forskjellige følsomheter i cellen i løpet av forskjellige tidspunkter. Tatt sammen tyder disse resultatene på at piperin-indusert apoptose i både LNCaP og PC-3-celler via kaspase-aktivering.
A NIR-FLIVO 747-konjugert poly-kaspase sonde, som er en celle-gjennomtrengelig fluorescerende detektor av aktive kaspaser, ble anvendt for å bestemme hvorvidt piperin aktiverer caspase i prostatakreftceller. De LnCap og PC-3 cellelinjer ble behandlet med piperin og deretter testet for caspaseaktivering. Resultatene viste at piperine skapt global caspaseaktivering både LNCaP (A) og PC-3 celler (B) så tidlig som 24 timer. Forsøkene ble gjentatt fire ganger og fått samme resultat som vist i denne representative tall
Western blotting-analyse. Piperin behandling aktiverer uttrykk for caspase-3 og kløyver PARP-1
aktivering av kaspaser bøddelknektene, dvs. caspase-3, resulterer i spaltingen av et bredt spektrum av cellulære target proteiner, inkludert poly (ADP-ribose) polymerase-1 (PARP-1), som fører til celledød [13]. Derfor bestemmes vi effekten av piperin på aktivering av kaspase-3 og Poly (ADP) Ribose Polymerase. Immunoblot-analyse av LNCaP (Figur 5A og figur 5C) og DU-145, PC-3-celler (Figur 5B) behandlet med piperin resulterte i en økning i spaltingen av caspase-3 og PARP-1 sammenlignet med celler behandlet med DMSO alene . Disse resultatene var i overensstemmelse med den globale caspaseaktivering at vi har observert før (figur 4).
(a) Western blot-analyse viste at 60 uM piperin inhiberer ekspresjonen av AR, STAT-3 og NF-kB transkripsjon faktorer i LNCaP-celler og samtidig apoptotiske aktiverende signaler (Caspase-3 og PARP-1-aktivering). (B). Western blot analyse viste at 160 uM og 75 uM piperin behandling inhiberer ekspresjonen av STAT-3 og NF-kB transkripsjonsfaktorer i DU-145 og PC-3-celler etter aktivering av apoptotiske markører (kaspase-3 og PARP-1-aktivering). C) Immunoblotanalyse Resultatene viste thatpiperine ved lavere dose på 25 uM også inhiberer ekspresjonen av AR, STAT-3 og NF-kB transkripsjonsfaktorer i LNCaP-celler i tillegg til downregulating PSA uttrykk. Endringer i ekspresjon av proteiner er angitt med + eller -. LNCaP, DU-145 og PC-3 celler behandlet med 0,1% DMSO alene fungerte som kontroller (ctrl) i dette forsøket.
Piperin behandling ned regulerer uttrykket av androgen reseptor (AR), NF- kB og fosforylert STAT-3
NF-kB og STAT-3 (fosforylert form av STAT-3) transkripsjonsfaktorer og androgen reseptor (AR) spiller en avgjørende rolle i celleproliferasjon, anti-apoptose, angiogenese og invasjon av prostata kreft celler. Immunoblot-analyse av LNCaP (figur 5A) celler behandlet med 60 pM av piperin viste reduksjon i ekspresjonen av NF-kB og STAT-3 (fosforylerte form av STAT-3) transkripsjonsfaktorer og nedregulering av Androgen Receptor (AR) i disse cellene. Interessant, lavere konsentrasjon (25 mm) av piperine behandling reduserte også uttrykk for fosforylert STAT-3, NF-kB og PSA nivåer i LNCaP celler (figur 5C). Våre resultater viste også at DU-145 og PC-3 PCa (figur 5B) celler behandlet med 160 uM og 75 uM av piperin henholdsvis dose resulterte også i nedregulering av NF-kB og fosforylerte STAT-3 ekspresjonsnivåer, og understreker den anti- kreft effekt av piperine i prostata kreftceller.
piperin behandling reduserer celle migrasjon in vitro
piperin behandling reduserte celle migrasjon av LNCaP og PC-3 celler, noe som tyder på at piperine har anti-trekkende effekter i prostata cancer (figur 6).
Boyden kammer analysen viser som styrer LNCaP og PC-3 prostata kreftcellene har et større antall migrerte celler mens LnCap og PC-3 prøver som ble behandlet med 60 uM og 75 uM piperin viser færre migrerte celler i Transwell® kamre. Pil viser migrerte celler. Hemmingen av cellemigrering antyder at piperin kan ha anti-trekkende egenskaper i prostata kreft. Data som vises her er representant for en av tre lignende resultater som oppnås.
Piperin administrasjon hemmer tumorvekst av menneskelig prostata kreft celler xenografter implantert i immunsvikt mus
neste søkt å bestemme antitumor effekter av piperine
in vivo
ved hjelp av en xenograft modell i nakne mus. Som det fremgår av resultatene, behandling med piperin betydelig redusert tumorvekst i nakne mus implantert med LNCaP-celler med 72% [tumorvolum (p 0,01) og tumormasse (p 0,01)] (Figur 7A 7B) og behandling av piperin også reduserte tumorvekst i nakne mus implantert med DU-145-celler ved 41% [tumorvolum (p 0,05) og tumormasse (p 0,05)] (Figur 7C 8B ) sikret reduksjon i tumormasse og volum i piperin behandlet gruppene var signifikant. Basert på disse resultatene, synes piperine å ha kreft undertrykkende effekt på begge androgen avhengige og androgen uavhengig prostata kreft celler
in vivo
.
Piperin hemmer veksten av LNCaP og DU-145 avledet tumorxenotransplantater i naken mus modell. Tumor volum (mm
3) og vekter (g) av piperin behandlede og ubehandlede kontroll nakne mus ble målt på de angitte dager. Seks uavhengige svulster ble samlet inn fra piperine behandlet LNCaP, DU-145 og kontrollere hårløse mus hhv. Resultatene (A-D) viste at piperin injeksjon signifikant reduserte tumorvolumer og tumorvekt av både androgenavhengige og androgen uavhengige avledet prostata kreftceller implantert i nakne mus. * P 0,05 sammenlignet med kontroll gruppe
piperin gitt til nakne mus (n = 6) ved en dose på 10 mg /kg via gavage administrering hemmer veksten av LNCaP xenograft tumorer i betydelig grad sammenlignet med naken. mus (n = 6) fikk PBS alene kontrollgruppe. Etter fullførelse av behandlingen, ble svulster som er samlet fra nakne mus målt for tumorvolumer og tumorvekten. Resultatene (A og B) viser at piperin reduserte signifikant tumorvolumer og tumorvekt av LNCaP avledet prostata kreft celler i nakne mus. * P 0,05 sammenlignet med kontroll gruppe
Diskusjoner
Nye anslag i kjønnsfordelingen avslørte det faktum at antall menn i alderen 15 og 65 ble enormt økt som hadde. en direkte innvirkning på antallet av prostatakreftpasienter [14]. Ulike fysiske og genetisk tilknyttede faktorer bidrar til utviklingen av prostatakreft. Håpet for prostatakreft behandling av «naturlige» kosttilskudd produkter også kjent som fytokjemikalier har blitt et aktivt forskningsområde. Piperine er et slikt lovende forbindelse rikelig tilstede i pepper krydder [15]. Så langt er det ingen studie som vurderer direkte terapeutiske effekten av piperin på prostatakreft og bare få studier har vist dens potensial i andre kreft [16], [17], [18], [19], [20]. Derav i denne studien, forsøkte vi å evaluere effekten av piperine som anti-kreft middel mot både androgen avhengige og uavhengige prostatakreftcellelinjer og undersøke de molekylære mekanismene som er ansvarlig for sine anti-proliferative aktiviteter. Den anti-kreft effekt av piperin ble nylig demonstrert i tykktarmskreftceller [21]. I den studien, viste piperine en trend mot anti-spredning på kolon kreftceller på 24 timer og en betydelig grad av hemming av celleproliferasjon ble meldt klokken 48 og 72 timer henholdsvis [21]. I en annen studie ble piperin vist å effektivt inhibere Benzo (α) pyren indusert lunge karsinogenese i albino mus ved å beskytte proteinene mot skade og også ved å undertrykke celledeling [8]. I denne studien, observerte vi en anti-proliferativ aktivitet utstilt av piperine på androgen avhengige (AD) LNCaP og androgen uavhengig (AI) PC-3, DU-145 og 22RV1 PCA celler
in vitro
i en dose avhengig måte.
Den robuste anti Resultatene fra vår studie viste at LNCaP cellene mer følsomme for piperine behandling etterfulgt av PC-3, 22RV1 og DU-145 celler som tyder på at piperine handlinger forskjellig avhengig av hvilken type av prostatakreft cellelinje. proliferativ effekt som utøves av piperin på begge androgenavhengige og androgen uavhengig prostatacancerceller kan betraktes som fordelaktig ved behandling av prostatakreft. Den tidlige stadium prostata kreft avhenger androgener for vekst og overlevelse, og androgen ablasjon terapi får dem til å regress [22]. Kreft som ikke er kurert av hormonbehandling etter hvert bli androgen uavhengig, rende anti-androgen terapi ineffektiv [22], [23]. Videre våre undersøkelser avslørte også at piperine induserer apoptose i prostatakreftceller som fremgår av Annexin-V immunfluorescens flekker studier.
Potensialet for piperine å fremme apoptose er videre støttet av sin evne til å forbedre caspaseaktivering i begge androgen-avhengige og androgen-uavhengig prostatacancerceller. En effektiv terapeutisk middel bør ikke bare begrense spredning, men bør også være i stand til å aktivere programmert celledød i både AD og AI prostatakreftceller [24], [25]. Gitt det faktum at piperine effektivt hemmet spredning av prostata kreft celler og indusert apoptose, kan piperine være en lovende anti-prostatakreft middel som fortjener videre undersøkelser som chemopreventive eller kjemoterapeutisk middel. De caspases, innblandet i apoptose, generelt er klassifisert som initiativtakere og bødler av celledød [26]. I denne studien fant vi at det var en rask økning i den globale caspase aktivitet utløst av piperine i LNCaP prostatakreftceller. Caspase-3 er den kritiske død relaterte enzym som utfører apoptose i prostatakreftceller [27]. Resultatene som presenteres i denne studien bekrefter at piperine behandling aktivert caspase-3 i prostatakreftceller. Dette ble ytterligere bekreftet i våre studier som vi har observert spalting av PARP-1 [28] i Piperin behandlet prostatakreftceller. For ytterligere å avgrense den molekylære mekanismen som piperine induserer apoptose, STAT-3 en viktig anti-apopoptic overlevelse faktor i prostatakreftceller ble evaluert. STAT-3 spiller en viktig rolle i kreftcelleformering, migrering og invasjon i mange typer kreft så som blæren, eggstokk, og hjerne [29], [30], [31]. I prostata cancer, har STAT-3 aktivering er funnet å være assosiert med lymfeknute og benmetastaser [32]. Blant STAT-familien av transkripsjons proteiner, har inhibering av fosforylert STAT-3 har blitt identifisert som et viktig mål for celledød ved økt apoptose i PCA-celler [33], [34], [35], [36]. Følgelig, i den foreliggende undersøkelsen kan det postulert at piperin kan indusere apoptose ved å hemme aktiveringen av fosforylert STAT-3 i LNCaP, DU145 og PC-3-celler som, i sin tur, kan inhibere overlevelsen og veksten av prostatacancerceller.
i tillegg til å hemme STAT-3, våre resultater viste at piperine også målrettet uttrykk for nukleær faktor-kB (NF-kB) transkripsjonsfaktor og androgen reseptor (AR). NF-kB spiller viktige roller i kontrollen av cellevekst, differensiering, apoptose og metastaser [37], [38], [39]. Den eksisterende bevis fra denne studien viser også at mange anti-kreft effekt av piperine kan også være regulert enten direkte eller indirekte av NF-kB. Våre resultater tyder på at NF-kB er nedregulert i LNCaP, PC-3 og DU-145 PCA celler. Tilsvar androgen reseptor (AR) ble nedregulert i LNCaP-celler. Den nedregulering av AR var i overensstemmelse med den samtidige reduksjon i PSA-ekspresjon i LNCaP-celler ble behandlet med piperine. Det faktum at androgenavhengige prostata kreft celler er mer sensitive overfor piperin behandling kan skyldes nedregulering av AR som er kritisk for overlevelsen av androgenavhengige prostatakreftceller, slik som LNCaP-celler som vi brukt i denne studien.
