Abstract
Bakgrunn
tpr er en stor coiled-spole protein ligger i kjernefysiske kurv av kjernefysiske pore anlegg, hvor mange ulike funksjoner ble foreslått fra gjær til menneske.
metodikk /hovedfunnene
Her viser vi at uttømming av tpr av RNA interferens utløser G0-G1 arrest og til slutt induserer en senescent-lignende fenotype avhengig av tilstedeværelse av p53. Vi fant også at tpr utarming svekker NES [atom eksport sekvens] -avhengige atom eksport av proteiner og forårsaker delvis co-uttømming av Nup153. I tillegg tpr utarming virkninger på nivået og funksjonen til SUMO-protease SENP2 dermed påvirke SUMOylation regulering ved kjernekraft pore og generell SUMOylation i cellen.
Konklusjoner
Våre data for første gang gi bevis på at et kjernefysisk pore komponent spiller en rolle i å kontrollere cellebegynnende alderdom. Våre funn peker også på nye roller for tpr i reguleringen av SUMO-en konjugering ved kjernekraft pore og direkte bekrefte tpr engasjement i atom eksport av NES-proteiner
Citation. David-Watine B (2011) Dempe Nuclear Pore Protein tpr utløser en senescent-Like Phenotype i kreftceller. PLoS ONE 6 (7): e22423. doi: 10,1371 /journal.pone.0022423
Redaktør: Michael Polymenis, Texas A M University, USA
mottatt: 1 april 2011; Godkjent: 22 juni 2011; Publisert: 19.07.2011
Copyright: © 2011 Brigitte David-Watine. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Institut Pasteur. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatteren har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Nuclear pore komplekser (NPC) megle alle selektiv toveis transport mellom kjernen og cytoplasma. Bevis er også fremstår som peker til flere roller for NPCer, beskaffenhet proteiner (nucleoporins) og tilhørende transportproteiner, noen som er uavhengige av klassisk transport [1], [2]. Det kan derfor rimelig hypotese at NPCer er sentrale i patologiske celle forhold hvor unormal cellevekst er et sentralt trekk.
Protein TPR (for translocated promoter region) og dets homologer er en fredet komponent ved kjernekraft siden av NPC . Hos pattedyr tpr er et 267-kDa strukturelt protein med en lang N-terminalt domene som medarbeidere i en dimer for å danne en parallell, to-trådet kveil-spiral. Den C-terminale domenet er svært sure, og er antatt å være ustrukturert [3]. I pattedyrceller tpr er begrenset til nucleoplasmic fibriller av NPC, og det har vært foreslått at den virker som den viktigste arkitektonisk element av kjerne kurven [4], [5]. Pattedyr tpr er bundet til NPC gjennom samhandling med Nup153 [5], [6], [7], [8]. Mange funksjoner har blitt tilskrevet tpr og dets homologer i ulike arter i tillegg til en rolle i NPC arkitekturen. Disse inkluderer mRNA eksport kontroll [9], [10], kjerneprotein eksport [4], [11], stille telomeric kromatin organisasjon og telomerlengde kontroll [12], [13], [14]. I tillegg har Drosophila og human tpr blitt vist å være involvert i spindelen sjekkpunkt kontroll [15], [16], [17] og human tpr i kontroll av Erk2 nucleo-cytoplasmisk trans [18].
TPR homologer i gjær, Mlp1p-Mlp2p, er involvert i å feste SUMO-protease Ulp1p til NPC [19], [20]. Dette funksjonelle samspillet synes å være bevart i Arabidopsis thaliana mellom ESD4 og Nua, som er homologer av Ulp1p og TPR, henholdsvis [21]. SUMOylation svarer til den posttranslasjonelle konjugering av SUMO (liten ubiquitin-relaterte modifiserende protein) til en spesifikk lysinrest i et målprotein. SUMOylation formidles av en enzymatisk cascade reaksjon som involverer suksessivt en SUMO-aktiverende enzym eller E1 og en unik E2 SUMO-konjugering enzym, Ubc9. SUMO endringen er reversible siden SUMO-spesifikke proteaser kan deconjugate SUMO-delen fra de modifiserte proteiner tyder på at protein SUMOylation dynamisk regulert i celler [22], [23]. Blant de Ulp1p-relaterte SUMO-proteaser som er blitt karakterisert i pattedyr, SENP1 og SENP2 viser størst likhet med gjær Ulp1 og er også assosiert med kjernefysiske konvolutten. Ulp1p og SENP2 dele eiendommen for å bli rettet mot NPC av sine ikke-katalytiske N-terminal domener [24]. Men i virveldyr, den N-terminale NPC-målsøkende domene i SENP2 interagerer med det C-terminale domene i Nup153, men ikke med tpr [25], [26].
Cellular senescens ble først beskrevet som » replikative senescens «på grunn av den begrensede levetiden av humane diploide fibroblaster in vitro [27]. Studier i kreftceller har vist at, til tross for det faktum at de er i stand til å dele seg i det uendelige, kan en tilstand nært opp replikative senescens være akutt indusert av ulike stimuli, slik som kjemoterapeutiske midler og stråling. Dette representerer derfor en annen celle program, foruten apoptose, som kan begrense celleproliferasjon [28], [29]. Senescent celler er preget av forstørret celle størrelse, flat morfologi, manglende evne til å syntetisere DNA, og uttrykk for senescence-forbundet (SA) -β-galaktosidase, biomarkøren av senescence [30].
Vi rapporterer her at tpr er kritisk for celledeling og som tpr uttømming fører til en begynnende alderdom-lignende fenotype som er avhengig av p53. Også tpr nedregule konsekvenser for den kjernefysiske eksport av proteiner med en Crm1 avhengig atom eksport sekvens (NES). Nivåene av Nup153 og SENP2 funksjon ved atom pore er også berørt. Som ble observert en konsekvens betydelige endringer i mønsteret av SUMO-en konjugering ved NPC og inne i cellen.
Resultater
tpr knockdown induserer G0-G1 arrest og en senescent fenotype i HeLa celler
tpr er nylig blitt beskrevet å ha flere ulike funksjoner bortsett fra dens rolle i cellesyklus, celle skjebne og proliferasjon er aldri blitt fullt ut undersøkt. Vi undersøkte derfor effekten av tpr utarming på cellesyklus ved hjelp sirnas målretting tpr i HeLa celler. Vi har funnet at nivået av tpr protein ble spesielt redusert etter 48 timers behandling med et av de to syntetiske sirnas anvendt, som vist ved Western blot-analyse av totalt celleekstrakter av behandlede HeLa-celler (Fig. 1A og S1A).
HeLa-celler seeded i 24-brønners plater på 5 10
-4 celler per brønn ble behandlet med tpr eller håne sirnas. 1A. 48 timer etter behandling siRNA som vist på toppen av figuren, ble en celleekstrakt fremstilt og analysert ved western blotting ved anvendelse av anti-tpr Mab 203-37; tubulin ble brukt som lasting kontroll. 1B. Lysfelt bilde (høyre panel) og konfokalt bilde (venstre panel) av HeLa-celler merket med et anti-tpr monoklonalt antistoff etter 2 dager med transfeksjon med tpr eller mock siRNA. Skala: 5 mikrometer. 1C. Vekstkurve av HeLa celler transfektert med TPR, mock siRNA eller ikke transfektert: kontroll (Ctrl). 1D. Representative FACS profiler av mock siRNA behandlet (venstre panel), tpr sirnas behandlede celler (i midten) og ikke-transfekterte celler eller kontroll (høyre). Etanol-fikserte celler ble inkubert med PI og analysert ved FACS for ploiditet. Celleantall er vist på den vertikale akse og DNA-innhold på den horisontale aksen. G0-G1 og G2-M-faser er representert som første og andre topper som starter fra den vertikale akse, respektivt. Den mellomliggende stripete domene korresponderer til S-fasen. 1E. Induksjon av senescence: celler ble sådd ved lav tetthet og behandlet med tpr eller håne sirnas. Etter 6 dager ble cellene fiksert og farget for SA-β-gal-aktivitet ved pH 6,0. Skala: 20 mikrometer. 1F. Kvantifisering av SA-β-gal-positive celler i kulturer tømt for tpr og farget for SA-β-gal-aktivitet ved pH 6,0. 1G-1H. U2OS celler ble transfektert med tpr eller håne sirnas. 1G: Etter 6 dager ble cellene fiksert og farget for BrdU-inkorporering og SA-β-gal-aktivitet ved pH 6,0. Skala: 15 mikrometer. 1H: Etter 6 dager ble cellene merket med anti-HP1γ og anti-MacroH2A antistoffer og DAPI. Skala: 5 mikrometer. 1I: A375 celler ble transfektert med tpr eller håne sirnas. Etter 6 dager ble cellene fiksert og farget for SA-β-gal-aktivitet ved pH 6,0. Skala: 15 mikrometer
Vi deretter bestemt plasseringen i HeLa celler ved konfokalmikroskopi (fig 1B.).. Optiske snitt gjennom midten av kjernen viste punctata mønster karakteristisk for nucleoporins ved NE. Eksponering for sirnas rettet mot tpr dramatisk redusert Punktum tpr mønster på NE (Fig. 1B). Siden tpr ble effektivt ned regulert under disse forholdene, var vi i stand til å analysere sin rolle i cellevekst og levedyktighet. Vi fant at behandling med tpr sirnas nedsatt celleproliferasjon i forhold til mock siRNA-behandlede celler (Fig. 1C). For å undersøke hvorvidt dette var på grunn av stanset celleproliferasjon eller celledød, ble cellene behandlet med Annexin V-og propidiumjodid å merke kjernen av døde celler, og cellene ble analysert ved hjelp av fluorescens-aktivert cellesortering (FACS). ble ikke observert noen forskjell mellom de grovt tpr siRNA-behandlede celler og kontrollene, hvilket indikerer at veksten defekten var ikke på grunn av apoptose (data ikke vist).
For ytterligere å karakterisere virkningen av tpr knockdown på celleproliferasjon, vi analyserte cellesyklus distribusjon av tpr siRNA-behandlede celler og kontroller ved å måle deres DNA innhold ved FACS. Vi bemerket at uekte siRNA transfeksjon ikke påvirke cellesyklusen av HeLa-celler sammenlignet med ubehandlede celler. I motsetning til dette, ble cellesyklusen arrestert i G0-G1 fase i TPR knockdown-celler som vist i fig. 1D. Omtrent 46% av kontrollen transfekterte og utransfekterte celler (2 dager etter transfeksjon) var i G0-G1-fasen av cellesyklusen, mens 69% av tpr knockdown cellene var i G0-G1. På samme tid, omtrent 37-38% av kontrollceller kommet til S-fasen sammenlignet med bare 16% av tpr knockdown-celler (Fig. 1D). Den samme andelen av celler ble sett i G2-M-fasen under alle tre betingelser. Lignende resultater ble oppnådd med de to tpr siRNA-sekvenser (fig. S1B).
Vi utførte deretter en kolonidannende analyse som en uavhengig måling av spredning defekten utløst av tpr uttømming. En vesentlig reduksjon (36%) i antall kolonier var tydelig når cellene ble transfektert med tpr sirnas sammenlignet med mock-transfekterte celler (Fig. S1C). Disse resultatene tyder på at transfeksjon av HeLa-celler med tpr sirnas dramatisk redusert tumorceller spredning.
En mer grundig undersøkelse av de tpr siRNA-behandlede celler viste at en fraksjon av disse hadde en heller «alvorlig» fenotype ved at de hadde utseendet senescence med et grovt utvidet cytoplasma. Dette førte oss til å gjennomføre ytterligere undersøkelser fokusert på denne responsen. I forbigående RNAi analyser, tidsforløpet for effektiv uttømming av målet protein er ikke mer enn fire dager mens TPR knockdown celler ble arrestert i G0-G1. I mellomtiden ikke-transfekterte celler fortsetter å dele seg og raskt innhente ikke-delende celler. Vi har derfor etablert betingelser under hvilke celler ble sådd ut ved lav tetthet (5,10
4 til 10
5 per brønn i en 6 brønners plate) for å minimere effekten av gjengroing ikke-transfekterte celler.
eksperimenter under disse forhold, viste at en stor andel av befolkningen begynte å endre morfologien 3-4 dager etter transfeksjon: cellene ble utvidet og flatet (figur 1E.). En viktig test for begynnende alderdom er SA-β-galaktosidase-aktivitet målt ved sur pH [30] og 6 dager etter transfeksjon har de fleste av de forstørrede og flate celler ble β-gal-positive og farget blå (ca. 40%) i TPR knockdown brønner , mens senescent-lignende blå celler var sjeldne (rundt 10%) i den uekte behandlede celle (fig. 1F).
tpr siRNA knockdown også indusert senescens i to andre tumorcellelinjer, U2OS, en human osteosarkomcellelinje linje, og A375 humane melanomceller (fig. 1G-1I). BrdU farging viste at SA-β-galaktosidase-positive celler ble BrdU negativ (fig. 1G). I tillegg ble tpr sirnas-behandlede U2OS celler og kontroller merket med antistoffer som er spesifikke for histon variant makro H2A og HP1γ, to markører for heterochromatin konstitutiv av SAHF (senescens forbindelse heterochromatin foci) som først ble identifisert i senescent humane fibroblaster [31] , [32]. Mange makro H2A og HP1γ positive og colocalizing foci ble observert i U2OS senescent celler kjerner, mens de var fraværende i kontroll kjerner. Lysere DAPI prikker indikerer heterochromatin colocalized med makro H2A og HP1γ Merking kan ses i fig. 1H.
tpr uttømming induserer kjernefysisk akkumulering av p53
Som p53 veien er ofte involvert i blokkering svulst utvikling ved å utløse mobilnettet senescence eller apoptose som svar på stress det var viktig å vurdere celle p53 status når tpr er oppbrukt.
først brukt immunocytochemistry for å analysere fordelingen av p53 og samtidig studert effekten av Nup153 tømming, da dette har vist seg å delocalize tpr fra atom pore på atom indre. Som vist på fig. 2A, p53 signal dukket opp like intens Punktum merking i kjernen av Tpr- og Nup153- utarmet celler. Ikke noe signal ble observert i kontrollceller. Til sammenligning, mens uttømming av Nup133, et stillas nucleoporin som spiller en viktig rolle i atom pore struktur og funksjon, ikke induserer noen nukleær akkumulering av p53 [33], slik opphopning ble sett i tpr-utarmet U2OS-celler (data ikke vist) . Disse resultatene viser at tpr uttømming eller mislocalization føre til atom akkumulering av p53.
2A. Analyse av p53 distribusjon i HeLa celler ved immunfluorescens. Øvre panel: Jakten celler ble transfektert med TPR, Nup153 og mock sirnas som vist på venstre side; nedre panel: Jakten celler ble transfektert med Nup133 og mock sirnas. Cellene ble fiksert på dag to etter -transfection og merket med en anti-tpr antistoff (øverst til venstre panel) eller anti-Nup133 (nederst til venstre panel) og en anti-p53 (høyre topp- og bunnplater). 2B. Hela celle hel celleprotein lysater ble separert ved SDS-PAGE og immunoblottet med antistoffer som er spesifikke for tpr, p53, p21, p16 og tubulin som angitt i figuren. 2C. Helcelle proteinlysatene av U2OS celler behandlet med TPR, tpr + p53 eller kontroll (mock) sirnas ble separert ved SDS-PAGE og immunoblottet med antistoffer spesifikke for TPR, p53, p21 og tubulin som vist i figuren. 2D. Co-uttømming av p53 og tpr reverseres senescence induksjon. Cellene ble transfektert med mock, TPR, p53 eller tpr og p53 i kombinasjoner som angitt. Den endelige siRNA konsentrasjon var 100 nM i hvert enkelt tilfelle og kompensasjon ble gjort med mock sirnas. Celler ble merket for SA-β-galaktosidase på 6 dager etter transfeksjon og resultatet er gitt som prosentandelen av SA-β-galaktosidase-positive celler i hver av de tre uavhengige eksperimenter.
cyclin -avhengig kinase inhibitor (CDK) p21 er forhøyet i mange stressende forhold og er transcriptionally regulert av p53. Vi undersøkte derfor konsekvensene av tpr uttømming på nivåer av p53 og p21. Nivåene av p53 og p21 var begge oppregulert i tpr-utarmet Hela-celler (Fig. 2B) og U2OS celler (Fig. 2C). I tillegg, når de evalueres i celleekstrakter hvor både tpr og p53 ble utarmet, ble p21 opphopning sett til å være lavere enn med tpr sirnas alene (Fig. 2C). Denne observasjonen tyder på at en del av p21 opphopning nevnt skyldes aktivering av p53. Nivåer av CDK-hemmere p16
INKA (Fig. 2B) og cyclinD1 ble også økt i tpr-utarmet HeLa-celler (data ikke vist).
Til slutt, for å demonstrere formelt den rollen p53 i formidling induksjon av senescence i tpr-utarmet celler, vi co-utarmet både tpr og p53. Knocking ned både tpr og p53 resulterte i en betydelig reversering av aldringsprosessen fenotype som vurderes av prosentandelen av SA-β-galaktosidase-positive celler (Fig. 2D).
tpr uttømming forstyrrer NES-avhengige atom eksport
det har vært antydet at de lave steady-state nivået av p53 i normale celler, det vil si i fravær av cellulært stress, et resultat av kontinuerlige Crm1 avhengig atom eksport [34], og cytosoliske påfølgende degradering av p53. Også tpr ble nylig funnet å samhandle med Crm1 i en trimere eksport kompleks [11]. Vi kan derfor hypotese at tpr fører til p53 kjernefysiske oppbygging og stabilisering ved å blokkere sitt atom eksport.
For å teste denne hypotesen vi først brukte konstruere pSTAT1-NES-GFP, som koder rester 367-427 av menneskelig STAT1 som overfører NES aktivitet [35], for å hindre ytterligere regulatoriske hendelser forstyrrer hemming av Crm1 avhengige atom eksport. Denne konstruksjonen ble ko-transfektert med TPR, Crm1 og kontroll sirnas å sondere for NES-avhengige eksport. Som vist på fig. 3A, fordelingen av GFP signal i levende celler 48 timer etter transfeksjon viste at Crm1- og tpr-uttømming førte til vesentlig atomfastholdelse av NES-GFP konstruere mens GFP forble hovedsakelig cytosol i mock-behandlede celler. Cellene ble deretter permeabilisert og merket med Crm1 og TPR-antistoffer for å kontrollere tømming effektivitet (fig. 3B).
3A-3B. Fordeling av GFP i celler ko-transfektert med STAT1-NES-GFP og TPR, Crm1 eller kontroll (mock) sirnas. 3A: GFP fordeling ble analysert i levende celler. Kjerner ble merket med Hoechst 33342. Skala: 10 mikrometer. 3B: Celler ble deretter permeabilisert og merket med antistoffer som er spesifikke for tpr og Crm1 og DAPI for DNA. Topplate: tpr tømming og kontroll; nedre panel: Crm1 tømming og kontroll. Skala: 10 mikrometer. 3C-3D: tpr uttømming forsinker atom eksport av NFkB. Jakten celler ble transfektert med tpr eller håne sirnas 2 dager før NFkB induksjon. Transfektert og kontrollceller ble deretter inkubert med TNF 100 IU /ml i 40 minutter. TNF ble så fjernet fra mediet, og cellene ble enten fast eller holdes i en annen 1h30 i friskt medium før fiksering. 3C: Kvantifisering av NFkB signal: Alle bilder ble ervervet ved samme forstørrelse og eksponeringen og NFKB-signalet ble kvantifisert ved anvendelse av samme overflateareal i kjernen og cytoplasmaet av celler under forskjellige eksperimentelle betingelser ved bruk av OpenLab3.1.2. Cytosoliske signal ble plottet mot kjernefysiske signal og standardavvik ble beregnet ved hjelp av Microsoft Excel. Feilfelt representerer standardavvik. Merk at cytosolic til kjernefysisk signal forholdet er svært like i kontrollceller før TNF behandling og 1h30 etter TNF fjerning. Dette var som forventet og skyldes NFkB fullt tilbake til cytoplasma på dette tidspunktet. 1.30 etter TNF fjerning cytosoliske til kjernefysisk signal forholdet var ca 25% lavere i TPR-utarmet celler enn i kontrollcellene. 3D: Immunofluorescent merking av NFkB og tpr 1h30 etter TNF fjerning i tpr-utarmet og kontrollceller. Faste cellene ble merket med en kanin anti-NFkB antistoff og anti-tpr mAb 203-37.
En funksjonell Crm1 avhengig NES er også nødvendig for IkappaBepsilon-mediert atom eksport som styrer Nucleo-cytoplasma distribusjon og etter induksjon atom clearance av NFkB /Rel proteiner [36]. For å vurdere bedre effekten av tpr utarming på NES-atom eksport av en endogen protein, ble HeLa-celler først transfektert med tpr eller håne sirnas to dager før NFkB induksjon av TNF. Som vist på fig. 3C-3D, tpr utarming forsinket clearance av NFkB fra kjernen i forhold til mock behandlede celler. Det er verdt å merke seg at NFkB opphopning i kjernen følgende TNF behandling var ikke annerledes i mock- og tpr-sirnas behandlede celler (fig. 3C).
Vi ønsket å finne ut om tpr uttømming påvirker Crm1 nivåer og distribusjon , eller vice versa. For å gjøre dette transfektert vi HeLa celler med sirnas rettet mot tpr og Crm1, eller mock transfekterte HeLa-celler, og 48 timer senere vi behandlet cellene med Tpr- og Crm1-spesifikke antistoffer. Immunofluorescent analyse for Crm1 uttrykk i kontroll og Crm1 knock-down cellene viste redusert nivåer i nukleoplasma og kjernekraft konvolutt av Crm1 siRNA-transfekterte celler. Også tpr uttrykk ble vesentlig redusert i tpr sirnas-behandlede celler. Derimot, gjorde Crm1 uttrykk ikke ut til å være påvirket av tpr utarming og tpr ble ikke berørt i Crm1 knock-down-celler (fig. S2A-B).
TPR utarming virkninger på uttrykk og distribusjon av Nup153 og SENP2 i atom kurv
for å vurdere hvilken rolle tpr i kjernefysiske pore organisasjon og funksjon bedre, undersøkte vi mer nøye forholdet mellom tpr og Nup153 ved å måle deres nivå i totale ekstrakter av celler transfektert med tpr eller Nup153 sirnas . Som vist ved Western blot-analyse av totalt celleekstrakter (fig. 4A), celle behandling med Nup153 sirnas førte til nesten fullstendig forsvinning av Nup153 og en markert reduksjon i tpr. Denne reduksjonen i TPR nivåer var i samsvar med tidligere studier som viser at tpr er mislocalized på atom interiøret i Nup153 knockdown celler [8]. Likeledes behandling med tpr sirnas førte til en markert nedgang i tpr og en sterkt redusert Nup153 signal (fig. 4A). Vi neste bekreftet denne observasjonen ved immunfluorescens analyse i HeLa celler behandlet med tpr sirnas og merket med antistoffer rettet mot ulike deler av kjernefysiske konvolutten. Merking med en anti-emerin antistoff og Mab414 antistoff som gjenkjenner alle FG-repeat-holdige nucleoporins inkludert Nup153 var ikke grovt endret (Fig. 4B-4C). I motsetning til dette, har vi funnet at merking med et spesifikt anti-Nup153 antistoff ble redusert (fig. 4B-4C). Vi konkluderte fra disse observasjonene som tpr uttømming påvirker spesifikt nivå av Nup153 protein i NE.
4A. Jakten celler ble transfektert med mock, tpr eller Nup153 sirnas som angitt på toppen. Hele cellelysater ble analysert 2 dager etter transfeksjon av immunoblotting bruker antistoffer rettet mot TPR, anti-FG gjenta nucleoporin Mab414 å merke Nup153 og Nup62 og anti-tubulin som lasting kontroll. 4B-4C. Nup153 uttrykk er spesielt senket i tpr-utarmet celler. Jakten celler ble behandlet med Tpr2 eller håne sirnas i 2 dager. 4C. Celler ble fiksert og merket med et anti-tpr-antistoff og anti-emerin, anti-Mab414 eller anti-Nup153 antistoffer. Skala: 15 mikrometer. 4D. Detaljer fra Mab414 og Nup153 merking. Skala: 5 mikrometer. 4D. Analyse av SENP2 uttrykk i atom ekstrakter av 293 celler behandlet med TPR, SENP2 og mock sirnas av western blot analyse. TRFII brukes som en lasting kontroll.
Gitt at tpr utarming endret Nup153 fordeling ved kjernekraft pore og at Nup153 platformer SENP2 til NPC, vi en hypotese om at tpr kan påvirke SENP2 protein nivåer og funksjon. For å teste denne hypotesen, vurderte vi effekten av tpr uttømming på SENP2. For det første, gitt at ingen antistoff er tilgjengelig for å observere endogen SENP2 i faste celler, vi analyserte SENP2 nivåer i atom ekstrakter av celler utarmet i TPR, Nup153 eller SENP2 og i mock utarmet celler. TPR uttømming i HeLa og 293 celler ble ledsaget av en reduksjon i SENP2 til nivåer svært like de som ble observert i SENP2-utarmet ekstrakter. Så å sammenligne de ulike protein nivåer, overvåket vi Nup133 og TRF2 som en lasting kontroll for atom ekstrakter (fig. 4D og S3A). Nedbryting av Nup153 tilsvar indusert reduksjon i SENP2 (data ikke vist).
tpr uttømming påvirker SUMOylation
Oppdagelsen av at tpr uttømming påvirker SENP2 bedt oss om å ta opp spørsmålet om tpr uttømming kan forstyrre med den SUMOylation for andre proteiner. For å undersøke endringene i den totale SUMOylation av proteiner, ble HeLa-celler behandlet med tpr, SENP2 og kontroll sirnas og nukleære og cytoplasmiske ekstrakter ble analysert og sammenlignet ved western blotting ved anvendelse av en anti-SUMO-1-antistoff. Blot av kjerneekstrakter viste at SENP2 undertrykkelse forårsaket en opphopning av høy molekylvekt SUMO-1 som var forventet for en nedgang i SUMO-proteaseaktivitet. Ingen slik opphopning ble sett i mock-transfekterte celler. I motsetning til dette tpr-uttømte celler viste en lavere samlet SUMOylation enn sammenlignet sirnas transfekterte celler (Fig. 5A). Lignende resultater ble oppnådd i U2OS og 293-celler (Fig. S3b og data ikke vist). Følgelig ble gratis SUMO-1 sett til å hope seg opp i tpr-utarmet celler (Fig. S3C).
5A-5B. Analyse av det generelle nivået av SUMOylation i celler transfektert med TPR, Nup153, SENP2 og mock sirnas. 5A. Nukleære ekstrakter av sirnas behandlede celler ble fremstilt og analysert ved western blotting ved anvendelse av antistoffene som er beskrevet på venstre side av figuren. RPB1 ble brukt som lasting kontroll. 5B. Analyse av RanGAP1 SUMOylation. Cytoplasmatiske ekstrakter av TPR, Nup153, SENP2 og mock sirnas-behandlede celler ble utarbeidet og analysert ved western blotting ved hjelp av en anti-RanGAP1 antistoff som gjenkjenner både SUMOylated og ikke-SUMOylated former RanGAP1 og med tubulin som lasting kontroll. 5C: SUMO-en siRNA behandling styrer tpr uttømming-indusert senescence i HeLa celler. Jakten celler ble transfektert med TPR, SUMO-en, tpr og SUMO-en og mock sirnas. Etter 6days ble cellene fiksert og farget for SA-β-gal-aktivitet ved pH 6,0. Et representativt bilde av hver tilstand er presentert. Skala:. 15 mikrometer
RanGAP1 (Ran-GTPase aktivering enzym 1) er en overflod SUMOylated protein og de fleste anti-RanGAP1 antistoffer oppdage SUMO-en-modifisert form og SUMO-free RanGAP1, migrerer rundt 80 kDa og 70 kDa, hhv. Vi undersøkte derfor effekten av tpr uttømming av fordelingen og nivået av ekspresjon og SUMOylation av RanGAP1. Fraksjonen av SUMO-fri RanGAP1 oppdaget av dette antistoffet ble økt i cytosoliske ekstrakter av Tpr- og SENP2-sirnas behandlet i forhold til mock behandlet HeLa-celler (fig. 5B) og i U2OS hele celleekstrakter (Fig. S3b). I kjerneekstrakt brøkdel, bare SUMO-en-RanGAP1 ble oppdaget og funnet økt i Tpr- og SENP2-sirnas behandlede celler sammenlignet med spotte behandlede celler når oppdages med anti-SUMO-en og anti-RanGAP1 antistoffer, med økningen blir mer uttalt i tpr-behandlede celler enn i SENP2-behandlede celler (fig. 5A).
Så langt, rollen av protein SUMOylation i senescence induksjon er bare studert i normale fibroblaster. Vi har bekreftet at uttømming av SENP2 kan indusere senescence i U2OS celler i vår eksperimentelle innstillingen (Fig. S3D). For å vurdere bidraget av SUMO-en modifikasjon vei til TPR-indusert senescence fenotype i kreftceller bedre, vi utføres parallelt RNAi knockdown av TPR, SUMO-1 og kombinert SUMO-en og tpr. Etter 6 dager ble cellene fiksert og analysert for SA-β-galaktosidase farging. Det totale celleantall var dramatisk forskjellig mellom tpr alene tilstand og de to andre forhold. Førti eller 50 felt ble telt for hver tilstand: antall felt som inneholder blå celler og andelen av plassen okkupert av forstørrede blå celler ble evaluert (tabell 1). Faktisk, for SUMO-1 uttømte celler, ble de fleste områder fylt med celler ved metningstetthet betyr at celleproliferasjon ikke ble stoppet. Svært få blå celler observert: 3 (i ett felt) til ca 20 blå celler eller så kan telles i 7 felt bare, resten blir negativ. Til slutt, var resultatene så forskjellige at det var umulig å ta dem i tabell 1. Som et faktisk var det mindre SA-β-galaktosidase-positive celler i SUMO-1-celler utarmet enn på den mock-kontroll. Resultatene er beskrevet i tabell 1 viser at befolkningen som helhet ble rammet av tpr uttømming mens celler med en senescent-lignende fenotype ble langt mer spredt i tpr pluss SUMO-en tilstand. I tillegg, med få unntak, de fleste blå celler viste ikke en full senescent fenotype som de ikke var flat og SA-β-galaktosidase flekker var svak (Fig. 5C).
Diskusjoner
Vi har vist i denne studien som reduserende tpr er tilstrekkelig til å indusere en senescent-lignende fenotype i tumorcellelinjer. Den begynnende alderdom fenotype kan forklares ved akkumulering av flere vekstundertrykkende proteiner som virker på mitogen signaltransduksjon og cellesyklusregulering. To hovedsignalveier, p16INK4a-pRb og p14ARF-p53, er ansvarlig for gjennomføring av proliferativ arrest som preger senescence [37], [38]. Rb-p16 veien er defekt i både HeLa og U2OS cellelinjer, men p53 i U2OS og HeLa celler og p16 i HeLa celler er økt etter tpr knockdown. P53 akkumuleres i kjernen, og det gjør P21 /CIP1, en nedstrøms effektor som er involvert i flere former for G1 sjekkpunkt kontroll. Videre er en del av p21 /Cip1protein opp-regulering er avhengig av tilstedeværelsen av p53
I normale celler er p53 et mål av den ubiquitin-proteasom-reaksjonsveien.: Den lave nivåer av p53 resultat av kontinuerlig Mdm2- mediert atom eksport av p53 for cytosolic degradering. I HeLa-celler, er atom eksport også nødvendig for degradering av p53 mediert av human papilloma virus (HPV) 18 E6 proteinet [39]. Vi viser her at tpr uttømming fører til kjernefysiske oppbevaring av en GFP reporter harbo NES sekvens av STAT1 og forsinker post-induksjon atom clearance av NFkB etter TNF fjerning i HeLa-celler [36], to hendelser er avhengige av den Crm1 eksport faktor. TPR ble nylig funnet å samvirke med Crm1 i nærvær av en NES peptid eller et nes peptid pluss RanGTP som i en trimere eksport kompleks [11]. Selv om de molekylære detaljene i denne interaksjonen ikke er videre kjennetegnet, er egnet til å svekke funksjonen til Crm1 i atom eksport fravær av tpr. Vi fant ut at tpr knock-down svakt påvirker Crm1 nivåer i vestlige blot eksperimenter, men ikke åpenbart påvirke Crm1 nivåer målt ved hjelp av spesifikke antistoffer på faste celler. Imidlertid har det tidligere blitt rapportert at selv liten nedregulering av Crm1 resulterer i fremtredende feil i atom eksport [40]. Crm1 hemning også redusert celleproliferasjon og induseres dyptgående endringer celle og apoptose (data ikke vist), som tidligere rapportert [41]. Vi foretrekker derfor hypotesen om at en hoved konsekvens av tpr uttømming er den kjernefysiske oppbygging og aktivering av p53 ved hemming av sitt atom eksport.
Til støtte for dette, leptomycin B (LMB), en Crm1 inhibitor, har vært vist seg å redusere E6 evne til å degradere p53 i cervical carcinoma celler [39], [42] og årsak: (i) bibeholdelse av STAT1-NES konstruere i kjernen [34], [35], (ii) atom akkumulering og aktivering av
