Abstract
LCRMP-en, en roman isoform av CRMP-en, kan fremme kreft celle migrasjon, invasjon og forbinder med dårlig klinisk utfall hos pasienter med ikke-småcellet lungekreft (NSCLC). Men de underliggende reguleringsmekanismer LCRMP-en i kreftcelle invasivitet fortsatt uklar. Her rapporterer vi at GSK3p kan fosforylere LCRMP-en på Thr-628 i konsensussekvenser og dette fosforylering er avgjørende for funksjon av LCRMP-en for å fremme filopodia dannelse, migrasjon og invasjon i kreftceller. Hindring av Thr-628 fosforylering demper de stimulerende effekten av LCRMP-en på filopodia forming, migrasjon og invasjon evner i kreftceller; samtidig, minsker kinase-døde GSK3p regulering av LCRMP-en på kreftcelle invasjon. Videre fant vi også at pasienter med lav-nivå Ser-9-fosforylert GSK3p uttrykk og høyt nivå LCRMP-1 uttrykk har dårligere total overlevelse enn de med høyt nivå inaktive GSK3p uttrykk og lavt nivå LCRMP-1 uttrykk (P 0,0001). Sammen er disse resultatene viser at GSK3p-avhengig fosforylering av LCRMP-1 gir en viktig mekanisme for regulering av LCRMP-en på kreftcelle invasivitet og klinisk utfall
Citation. Wang WL, Hong TM, Chang YL, Wu CT, Pan SH, Yang PC (2012) Fosforylering av LCRMP-1 av GSK3p Fremmer Filopoda Formation, migrasjon og invasjon evner i lungekreft celler. PLoS ONE 7 (2): e31689. doi: 10,1371 /journal.pone.0031689
Redaktør: Adam I. Marcus, Emory University, USA
mottatt: 15 desember 2011; Godkjent: 11 januar 2012; Publisert: 21 februar 2012
Copyright: © 2012 Wang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra National Science Council (NSC 98-2628-B-002-086-My3, NSC100-3112-B-006-005, og NSC100-2321-B-002-071). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
metastaser bidrar til behandlingssvikt og død hos de fleste kreftpasienter [1]. Kapasiteten på kreftceller til progressiv metastase styres av kompliserte cellulære prosesser som involverer microenvironmental endringer, økende evne til celle migrasjon eller invasjon, flere genetiske hendelser og regulatoriske forhold. Til nå har mange stam indusere og undertrykkere av kreft metastase blitt identifisert til å være involvert i disse prosessene, og dermed rakne oppstrøms regulatoriske veier av disse proteinene kan lette viser detaljerte molekylære mekanismer for kreft metastase [2].
Glykogen syntase kinase-3β (GSK3P) er kjent som en multifunksjons serin /treonin-kinase som styrer en rekke cellulære prosesser, inkludert glykogen metabolisme, celledifferensiering, apoptose, cytoskjelettet omleiring, cellesyklusregulering, og celleproliferasjon [3], [4]. GSK3P regulerer en lang rekke substrater gjennom fosforylering ved optimale konsensusmotiver (Ser /Thr-X-X-X-Ser /Thr, hvor X representerer en hvilken som helst aminosyre) [3], [5]. Vanligvis har de fleste vanlige underlag av GSK3P trenger en spesifikk priming kinase for å øke effektiviteten av første fosforylering ved serin eller treonin-rester som i nærheten av de fire rester av GSK3p-fosforyleringssetet i karboksylenden. For eksempel casein kinase 1 tidligere primtall p-catenin å GSK3p fosforylering [6], og kasein kinase 2 er en grunning kinase av glykogen syntase [7].
Collapsin respons mekler protein-1 (CRMP-1) undertrykker neuronal vekst kjegle forlengelse under utvikling, og er også kjent som en kreft invasjon suppressor [8], [9]. Nylig identifiserte vi en roman isoform av CRMP-en, den lange formen CRMP-en (LCRMP-1) [10]. LCRMP-1 kan fremme filopodia formasjon, kreftcellemigrering, invasjon gjennom funksjonelt mot CRMP-1, og dets ekspresjon korrelerer med dårlig klinisk resultat i ikke-små-celle lungekreft (NSCLC) pasienter. LCRMP-1 og CRMP-1 havner identiske C-terminale sekvenser fra ekson-2 til ekson-14; imidlertid, N-terminal ekson-en sekvens av LCRMP-1 er forskjellig med det av CRMP-1 [11]. Blant human CRMP familie, aminosyresekvensen av CRMP-2 er 78% og 76% identitet med CRMP-1 og CRMP-3, henholdsvis [12]. Tidligere har CRMP-2 blitt rapportert å bli fosforylert av GSK3P ved Thr-514, og forbundet med svekke neuronal polarisasjon [13]. Spesielt, CRMP-en og CRMP-3 viste svært lignende GSK3p fosforylering konsensus motiver med CRMP-2 [14]. I samsvar med CRMP-en, LCRMP-en inneholder også samme motiv for GSK3p fosforylering.
Siden LCRMP-en og CRMP-en har motsatt funksjon på kreft migrasjon og invasjon, om funksjonen av LCRMP-en kan reguleres ved GSK3P bør bli ytterligere undersøkt. I denne rapporten undersøker vi mulig regulering av GSK3p på LCRMP-en. Her viste vi at GSK3p kan fosforylere LCRMP-en og modulere filopodia formasjon, kreft celle migrasjon og invasjon. Vi bekrefter videre GSK3p-fosforylert nettstedet i LCRMP-en, undersøke dens funksjon for celle invasivitet og evaluere klinisk signifikant i NSCLC.
Resultater
GSK3p kan fosforylere LCRMP-en på Thr- 628
For å forutsi om de klassiske GSK3p fosforylering konsensus sekvenser eksistert i LCRMP-en, må vi først justert proteinsekvenser blant CRMP-2, CRMP-en, og LCRMP-1 (fig. 1a). Tidligere studie viste at cdk5 er en grunning kinase som fosforylerer CRMP-2 på Ser-522, etter med fosforylering av CRMP-2 på Thr-514 ved GSK3p og resulterer i funksjonell regulering av nevronale polarisering [13]. Derfor har vi funnet at proteinsekvenser av LCRMP-1 inneholdt svært konsistent med cdk5 og GSK3P fosforylering motiv, så vi spekulert over at et stort potensielt fosforyleringssete av LCRMP-en er plassert på Thr-628 (fig. 1A). For å undersøke hvorvidt LCRMP-1 kan bli fosforylert av GSK3P, ble HEK293T-celler transfektert med villtype-Flag-merket LCRMP-1 (WT) i nærvær av tom vektor, vill-type GSK3p (WT), konstitutivt aktiv GSK3p (CA) eller kinase-døde GSK3p (KD). Ekspresjon av GSK3P (CA) ble mer tydelig påvist mobilitetsskift (pilhoder) av LCRMP-1 (WT) enn GSK3p (WT) (Fig. 1B, spor 2 og 3). Imidlertid langsom migrerings øvre bånd ble helt forsvunnet i celler som uttrykker kinase-manglende form av GSK3P (KD) (Fig. 1B, spor 4). Disse resultater antyder at LCRMP-1 er et substrat av GSK3P og langsomt vandrende båndene ble forårsaket av dets fosforylering
in vivo
.
(A) Proteinsekvensanalyse viste at potensialet konsensus side LCRMP- 1 for fosforylering av GSK3p. Proteinsekvenser er innrettet blant CRMP2, CRMP-1, og LCRMP-1. Tallene representerer aminosyre nettsider og understreking viser en potensiell fosforylering stedet for cdk5. (B) GSK3p phosphorylates LCRMP-en (WT)
in vivo
. HEK293T celler ble ko-transfektert med flagg-merket LCRMP-en og tydelig aktivitet av Flag-merket GSK3p (WT, CA og KD form). Lik mengde av plasmider ble transfektert inn i hver tilstand ved hjelp av tomme vektorer. Celler ble lysert 30 timer etter transfeksjon og proteinekstrakter ble analysert ved immunblotting med anti-Flag-antistoffer. (C) GSK3p phosphorylates LCRMP-en (WT) på Thr-628
in vivo
. CL1-0-celler ble ko-transfektert enten Flag-merket LCRMP-1 (WT) eller LCRMP-1 (T628A, T628D) mutanter i nærvær eller fravær av distinkte aktivitet av Flag-tagged GSK3p (CA og KD form). Tomme vektorer ble anvendt for supplement til lik mengde av plasmider i transfeksjon analysen. Cellelysater ble høstet 48 timer etter transfeksjon og analysert ved immunblotting med anti-Flag og anti-β-actin-antistoffer.
neste, for å bestemme hvorvidt GSK3P fosforylerer LCRMP-1 ved Thr-628
in vivo
, ble en nonphosphorylated LCRMP-en mutant som genereres ved å erstatte Thr-628 til Ala (T628A). CL1-0 celler ble kotransfektert med LCRMP-1 (WT) eller et LCRMP-1 (T628A) nonphosphorylated mutant i nærvær av enten tom vektor, GSK3p (CA), eller GSK3P (KD). I samsvar med tidligere observasjoner, ble GSK3p (CA) og GSK3p (KD) viste seg å vise bånd skift og ikke-båndskift (pilspisser) av LCRMP-en, henholdsvis (fig. 1C, spor 2 og 3). Spesielt, LCRMP-1 (T628A) var resistent mot GSK3p (CA) aktivitet, og de forskjøvne båndene ble nesten opphevet (fig. 1C, spor 4). Dette resultatet var i likhet med forholdene i LCRMP-1 (WT) pluss GSK3p (KD) (Fig. 1C, spor 3 og 4), og videre bekrefter at GSK3P faktisk fosforylert LCRMP-1 ved 628 Thr-rester. Kollektivt, alle disse resultatene indikerte at LCRMP-en var spesielt fosforylert ved Thr-628 ved GSK3p
in vivo
.
Thr-628 fosforylering av LCRMP-1 er nødvendig for kreftcelle invasjon, migrasjon og filopodia formasjon
i våre aktuelle rapporter, har vi funnet ut at villtype LCRMP-en øker filopodia formasjon, og fremmer celle migrasjon og invasjon i ikke-invasiv menneskelige lungekreft cellelinjer [10]. Siden LCRMP-1 kan bli fosforylert ved Thr-628 ved GSK3P, ved utspurt vi om funksjonen av LCRMP-en kan reguleres ved denne fosforyleringen. For å løse dette, genererte vi en serie med lentivirus som uttrykker GFP (kontroll), non-taggede LCRMP-en (WT), LCRMP-en (T628A), eller LCRMP-en (T628D), og omformet dem inn i lav-invasiv CL1 -0 lungekreftceller som uttrykker lavt nivå av endogen LCRMP-1 [11]. Protein ekspresjon av villtype eller mutant LCRMP-1 ble bekreftet ved immunblotanalyse ved anvendelse av anti-LCRMP-1-antistoffer (Fig. 2A). Disse cellene ble deretter anvendt for å undersøke evnen til cellen invasjon. Som forventet, bidro LCRMP-1 (WT) overekspresjon til en økt celle invasivitet sammenlignet med GFP kontroll (Fig. 2B). Men T628A nonphosphorylated mutant av LCRMP-1 ble sterkt redusert celle invasivitet (Fig. 2B). Omvendt, fosfo-ligne LCRMP-1 (T628D), som var forventet å etterligne den fosforylerte form, som vises forbedret invasjon evne tilsvarende villtype LCRMP-1 (WT). For ytterligere å undersøke effekten av Thr-628 fosforylering av LCRMP-1 uttrykk på CL1-0 cellemotilitet, utførte vi video time-lapse mikroskopi analyse for å overvåke flytting spor på minst 10 individuelle celler over en 20-timers periode. Lentivirus-transduserte CL1-0 celler som uttrykker GFP-LCRMP-1 (WT) eller GFP-LCRMP-1 (T628D) øket både migrasjon avstand og migreringshastighet i forhold til GFP vektoren (fig. 2C, D og E). Imidlertid GFP-LCRMP-1 (T628A) viste markant kompresjon av avstand og hastighet av migrasjon (fig. 2C, D og E). Disse resultatene antydet at fosforylering av LCRMP-1 ved Thr-628 er en forutsetning for celle invasivitet og cellemigrasjon.
(A) Protein ekspresjonsnivåer av eksogent ukodet LCRMP-1 (WT), LCRMP-1 (T628A ), og LCRMP-1 (T628D) blir bekreftet ved immunblotting. Etter 48 timer etter infeksjon lentivirus, ble CL1-0 celler som stabilt uttrykte villtype og mutant LCRMP-1. Lentivirus uttrykker GFP tjente som kontroll. Cellelysater ble høstet etter ved å vurdere med immunblotting ved anvendelse av anti-LCRMP-1-antistoff og anti-p-aktin-antistoffer. (B) Nonphosphorylated LCRMP-1 (T628A) mutanten reduserer aktiviteten av celle invasjon. Den invasive Evnen til disse celler ble bestemt med det modifiserte Boyden kammere invasjon assay
in vitro
. Andel av invasiv evne ble normalisert til GFP kontroll. Data ble vist som middelverdier ± SEM for tre uavhengige eksperimenter (n = 3). (C) Nonphosphorylated LCRMP-en (T628A) mutante sterkt undertrykte celle migrasjon spor. Veis tomter viste CL1-0 celler som uttrykker GFP, GFP-LCRMP-en (WT), GFP-LCRMP-en (T628A), GFP-LCRMP-en (T628D), henholdsvis. Flytte spor på minst 10 representative celler ved startpunktet alle satt til «0,0» over en 20-timers periode (ulike linjer) viste representant motilitet av celler. Scale bar, 100 mikrometer. (D, E) Total migrasjon avstand (D), og cellevandring hastighet (E) ble kvantifisert fra celle sporing assay i 20 timer. Data ble presentert som betyr ± SEM.
Neste, vi videre undersøkte effekten av GSK3p på LCRMP-en indusert filopodia formasjon. CL1-0 celler ble transient transfektert med GFP kontroll, GFP-LCRMP-1 (WT), GFP-LCRMP-1 (T628A), eller GFP-LCRMP-1 (T628D) og følgende ved farging med aktin ved hjelp av rhodamin-konjugert phalloidin. I samsvar med våre aktuelle rapporter, immunfluorescens analyse viste at antall filopodia som forårsaket av ektopisk uttrykk GFP-LCRMP-en (WT) i CL1-0 celler var mer enn at ved GFP vektor kontroll. Omvendt antall filopodia formasjon var åpenbart svekket i celler som uttrykker nonphosphorylated mutant GFP-LCRMP-en (T628A) (figur 3A,. 3B, p 0,0001). I tillegg GFP-LCRMP-1 (T628D) ble også indusert mer filopodia som ligner GFP-LCRMP-1 (WT), (figur 3A;. 3B, s 0,0001). Disse data indikerte at fosforylering av LCRMP-en på Thr-628 er avgjørende for filopodia formasjon.
(A) Nonphosphorylated LCRMP-en (T628A) mutant svekker filopodia formasjon. CL1-0 celler ble transient transfektert med GFP-merket LCRMP-en (WT), LCRMP-en (T628A), og LCRMP-en (T628D). Ved 24 timer etter transfeksjon, ble disse cellene fiksert, permeabilisert og deretter immunostained med rhodamin-konjugert phalloidin (rød) for aktin og DAPI (blå) for å visualisere kjerner. Representative immunofluorescence bildene ble visualisert ved hjelp av fluorescens mikroskop. Scale bar, 10 mikrometer. Innfellinger viser høyere forstørrelser (400 ×). (B) Tall fra filopodia ble telt med minst seks celler per gruppe. Data ble presentert som betyr ± SEM.
GSK3p phosphorylates LCRMP-en og modulerer kreftcelle invasjon
For ytterligere å påvise effekten av GSK3p på LCRMP-en (WT) -indusert kreft celle invasjon, lentivirus uttrykker GFP kontroll, ble GSK3p (WT), GSK3p (CA), eller GSK3p (KD) smittet i CL1-0 /LCRMP-1 overekspresjon celler (linje 1015 og 1003) som tidligere har blitt vist sterkt indusere celle invasivitet [10]. I samsvar med våre tidligere funn (Fig. 1B og C), immunblotting-analyse viste at GSK3p (CA) indusert LCRMP-1 med forskjøvet bånd sammenlignet med GFP kontroll (figur 4A, felt 1 og 3;. Spor 5 og 7), men en ikke-forskjøvet bånd ble observert i GSK3p (KD) (fig. 4A, bane 4 og felt 8). Basert på ovennevnte betingelser, ble resultatene av invasjon assay også vist at GSK3p (CA) -introduced CL1-0 /LCRMP-1-celler (1015) kunne fremme celle invasjon sammenlignet med kontrollceller (Fig. 4B). Imidlertid GSK3p (KD) -introduced celler resulterte i en redusert evne i invasjon (Fig. 4B). Samlet utgjør disse resultatene viste at GSK3p kan modulere LCRMP-en aktivitet gjennom en fosforylering avhengig måte å kontrollere kreft celle invasjon.
(A) Lentivirus uttrykt GFP kontroll, myc-merket GSK3p (WT), GSK3p ( CA), eller GSK3P (KD) i CL1-0 /LCRMP-1 (WT) overekspresjon-celler (1015 og 1003). Etter 48 timer postinfection, ble disse cellene lysert og underkastet immunblotanalyse med anvendelse av anti-Flag, anti-Myc, og anti-p-aktin-antistoffer. (B) GSK3p aktivitet påvirker LCRMP-1-indusert kreft celle invasjon. CL1-0 /LCRMP-1 overekspresjon celler (1015) ble infisert med lentivirus uttrykker GFP kontroll, myc-merket GSK3p (CA) eller GSK3p (KD). Etter 48 timer postinfection, ble disse cellene utsatt for den modifiserte Boyden kammer invasjon analysen
in vitro
. Normalisering til GFP kontroll fungerte som andel av invasiv evne.
Lav uttrykk for inaktive GSK3p og høy uttrykk for LCRMP-en korrelerer med dårlig total overlevelse hos NSCLC pasienter
Selv om våre resultater konsekvent foreslo at funksjonen LCRMP-en kan være regulert av GSK3p fosforylering, trenger slike studier ikke fullt ut reflekterer klinisk malignitet. Følgelig utvidet vi vår analyse ved å undersøke inaktiv form GSK3p og LCRMP-1 protein uttrykk nivåer i vevsprøver fra 142 NSCLC pasienter. De kliniske karakteristika for disse pasientene er oppsummert i tabell 1. Serie deler av hver prøve ble farget med antistoffer mot LCRMP-1 og Ser-9-fosforylert GSK3P som indikert status inaktiv form GSK3P på grunn av Akt-formidlet aktivering som fører undertrykkelse av GSK3p aktivitet gjennom fosforylering på Ser-9 [15]. Våre resultater viste typisk farging av LCRMP-en og Ser-9-fosforylert GSK3p i pasientens prøven (Fig. 5A). I samsvar med våre tidligere rapporter, høyt nivå LCRMP-1 hadde signifikant dårlig total overlevelse sammenlignet med lavt nivå LCRMP-1 hos pasienter med NSCLC [10], [11]. Spesielt, analyse av den kombinerte effekt av begge proteiner på pasientenes prognoser viste at pasienter med lav-nivå ekspresjon av inaktiv form GSK3P og ekspresjon på høyt nivå av LCRMP-1 hadde dårligere total overlevelse enn de med høyt nivå inaktiv form GSK3p uttrykk og lavnivå LCRMP-1 uttrykk (fig. 5B, p 0,00001). Multivariable Cox proporsjonal farer regresjonsanalyser, med en trinnvis utvalg modell, var til stede for å evaluere sammenslutninger av ulike uavhengige prognostiske faktorer med pasient overlevelse (tabell 2). Disse resultatene tyder på at høy aktivitet GSK3p og høyt nivå LCRMP-1, eventuelt etterligne den fosforylerte status av LCRMP-en, er forbundet med økende kreft invasivitet og dårligere total overlevelse.
(A) typisk protein expression mønstre fosforylert GSK3p og LCRMP-en ble oppdaget av immunhistokjemi hjelp av anti-fosfor-GSK3p (Ser9) og anti-LCRMP-1-antistoffer (K2) i serie disseksjoner av primærtumorprøver fra 142 NSCLC pasienter som gjennomgikk kirurgiske reseksjoner. Resultatene er vist + og – betegner svulster med og uten overuttrykk med angitte protein hhv. Skala barer, 100 mikrometer. p-GSK3p var representert i fosforylert GSK3p. (B) Kaplan-Meier analyse av total overlevelse for 142 NSCLC pasienter med p-GSK3p
– LCRMP-en
-, p-GSK3p
– LCRMP-en
+, p-GSK3p
+ – LCRMP-en
– og p-GSK3p
+ – LCRMP-en
+.
P
verdier ble utført av to-sidige log-rank tester.
Diskusjoner
Vår studie primært undersøkte reguleringsmekanisme av post -Oversettelse modifikasjon assosiert med kreftcellemigrering og invasivitet av LCRMP-1. Her viste vi at GSK3p-avhengig fosforylering av LCRMP-en positivt regulerer filopodia dannelse, migrasjon og kreftcelle invasjon. På grunnlag av GSK3P-fosforylerte konsensusmotiver, er Thr-628 aminosyrerest av LCRMP-en master fosforyleringssetet for GSK3p (fig. 1). En substitusjon av Thr-628 til Ala i LCRMP-1 ledet til å svekke filopodia formasjon, migrering og invasjon kreftcelle, mens en erstatning av Thr-628 til Asp i stor grad gjenopprettet dens funksjon (Fig. 2 og 3). I samsvar med disse observasjonene, ektopisk ekspresjon av kinase-død GSK3P redusert LCRMP-1-indusert invasiv evne (fig. 4). Videre er klinisk NSCLC pasienter med lav-nivå av inaktive GSK3P og høyt nivå LCRMP-1-protein ekspresjon assosiert med dårlig total overlevelse enn de med høyt nivå inaktiv form GSK3p ekspresjon og lavt-nivå LCRMP-1-ekspresjon (Fig. 5B) . Dermed våre resultater gir bevis for å støtte den avgjørende mekanisme GSK3p-avhengig fosforylering å kontrollere LCRMP-1-mediert filopodia dannelse, migrasjon og invasive egenskaper i kreftceller.
Sekvensanalyse indikerte at det har en cdk5 ( priming kinase) fosforylering nettstedet i både LCRMP-en og CRMP-1 (fig. 1a). Etter fosforylering på Ser-636 ved cdk5, GSK3p i sin tur fosforylerer Ser-632 og Thr-628 sekvensielt. Derfor kan GSK3p indusere langsommere vandrende bånd på LCRMP-1, inkludert både Ser-632 og Thr-628 fosforylering i celler, og båndene som induseres av konstitutivt aktiv GSK3P var mer aktive enn den til villtype GSK3p (Fig. 1B). I detaljert analyse, fant vi at LCRMP-en mutant, T628A, kan blokkere det meste av GSK3p fosforylering indusert trekkbånd (Fig. 1C). Dette kan tyde på at Thr-628 av LCRMP-en kan være den dominerende og viktig fosforylering stedet for GSK3p fosforylering. Vi kan imidlertid ikke utelukke at konstitutivt aktiv GSK3p kan fosforylere andre steder av LCRMP-en.
Prosessen med tumorinvasjon er først og fremst gjennom vekslinger av den ekstracellulære matrise inkludert aktin polymerisasjon og filopodia formasjon [16]. Våre funn viser at blokkering av GSK3p-mediert fosforylering av LCRMP-en på Thr-628 fører til en tilbakegang av filopodia formasjon. En tidligere rapport ble beskrevet som GSK-3-fosforylering for Paxillin er nødvendig for cytoskeletal omorganisering [17]. Dermed spekulerer vi at GSK3p kan positivt fremme regulering av aktin cytoskjelettet og tumorinvasjon. I motsetning til en positiv rolle, er GSK3p også rapportert å utføre sine undertrykkende roller for sine substrater [18]. GSK3P fosforylering for noen atomtranskripsjonsfaktorer, slik som β-catenin og sneglen, trigger proteasomal degradering, følgende med undertrykkelse av epitelial-mesenkymale overgang (EMT) og tumorinvasjon [6], [19] – [21]. GSK3P samtidig lokaliseres i cytoplasma og cellekjernen [22], som i overensstemmelse med resultatene av immunhistokjemisk farging (fig. 5A), og LCRMP-1 er en stabil cytosolprotein [10]. Derfor GSK3P regulerer celle invasjon er muligens avhengig av karakteriseringen av dens proteinsubstrater. Høyt nivå LCRMP-1-ekspresjon er assosiert med dårlig samlet og sykdomsfri overlevelse sammenlignet med lav ekspresjon gruppe i NSCLC [10], [11]. Dermed LCRMP-en fungerer potensielt som beste kandidat til å identifisere høyrisikopasienter. I denne studien viste vi en meget interessant funn at pasienter med lavt nivå fosforylert GSK3p og høyt nivå LCRMP-1 uttrykk hatt verre total overlevelse enn de andre katalog grupper. Med fokus på lavt nivå LCRMP-1 uttrykk eller høyt nivå LCRMP-1 uttrykk gruppe, kunne vi også funnet ut at høyt nivå av fosforylert GSK3P uttrykk kan diskriminere bedre resultat fra lavnivå fosforylert GSK3p uttrykk, henholdsvis. Den kombinerte effekten av inaktiv form GSK3p og LCRMP-1 protein uttrykk kan ha viktige kliniske implikasjoner for å indikere høyrisiko undergruppe av NSCLC pasienter som kandidater for ekstra effektiv adjuvant behandling. Resultatene tyder på at fosforylering av GSK3p LCRMP-en er assosiert med dårlig klinisk resultat. Men det har fortsatt noen begrensninger i våre eksperimenter. Selv referansen indikerte at Ser-9-fosforylert GSK3p kan vise status for inaktiv form GSK3P grunn av Akt-mediert aktivering som resulterer i undertrykkelse av GSK3p aktivitet gjennom fosforylering på Ser-9 [15], enten Ser-9 fosforylering av GSK3p hindrer dens evne til å fosforylere LCRMP-1 er ennå ikke kjent. For å løse dette problemet, genererer en spesifikk anti-fosfor-Thr-628 LCRMP-1 antistoff for immunhistokjemi bør være de viktigste sakene i fremtiden. Dette kan bekrefte den kliniske betydningen av GSK3p indusert fosforylering av LCRMP-en i NSCLC.
I tillegg har vi også funnet at pasienter med lav-nivå (n = 73) eller høye nivåer (n = 69) av Ser-9-fosforylert GSK3p-ekspresjon var nesten lik i fordeling. Celler som eksisterer på ulike faktiske nivå av aktiv GSK3P med mindre distinkte signalveier for inhibering av GSK3p utløses samtidig, slik som MAPK og fosfatidylinositol-3-kinase-OH /Akt trasé [20]. Dermed spekulerer vi at distinkte aktivert omfanget av signalveier for å indusere en hemming av GSK3p aktivitet kan føre til ulike utfall for pasienter med LCRMP-1 uttrykk. Derfor kan videre undersøke oppstrøms signalveien for regulering av GSK3p gi en bedre diagnose for NSCLC pasienter med lav-nivåer eller høye nivåer av LCRMP-1 uttrykk.
I konklusjonen, viser vi en ny reguleringsmekanisme for GSK3p å fosforylere en invasjon enhancer LCRMP-en og dermed ytterligere kan finjustere kreftcelle invasjon evner. I tillegg kan LCRMP-1 uttrykk og Ser-9-fosforylerte GSK3p nivåer har kliniske implikasjoner i utfallet prediksjon av pasienter med NSCLC.
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
denne undersøkelsen ble godkjent av Institutional Review Board of National Taiwan University Hospital og innhentet informert skriftlig samtykke erklæring fra alle deltaker pasienter involvert i vår studie.
pasienter og vevsprøver
Lung vevsprøver kreft ble oppnådd fra pasienter (n = 142) med histologisk bekreftet NSCLC som hadde gjennomgått komplett kirurgiske reseksjoner ved National Taiwan University Hospital (Taipei, Taiwan) mellom 28 desember 1995 og 26. desember 2005. Denne undersøkelsen ble godkjent av Institutional Review styret i National Taiwan University Hospital. De inkluderte pasientene ikke hadde blitt behandlet med neoadjuvant kjemoterapi eller strålebehandling. Alle prøvene ble formalinfiksert, seksjonert, farget med hematoksylin og eosin, og undersøkt ved mikroskopi. Patologisk iscenesettelse ble utført av Dr. Yih-Leong Chang (Avdeling for patologi og Graduate Institute of Pathology, National Taiwan University) i henhold til den internasjonale staging system for lungekreft [23].
Immunhistokjemisk analyse
Immunohistokjemisk farging av tumor vevsprøver fra pasienter med NSCLC ble utført som tidligere beskrevet [11]. I korte trekk, ble seksjonene for analyse av LCRMP-en eller fosforylert GSK3p protein uttrykk først autoklavert i Trilogy Solution (Cell Marque Corp., Rocklin, CA.) eller Antigen Retrieval Citra Solution (Biogenex, San Ramon, California) ved 121 ° C i 10 minutter. Prøvene ble deretter laget en behandling av 3% H
2o
2-metanol, inkubering med DakoCytomation Dual EndogenousEnzyme blokk (DakoCytomation, Inc., Carpinteria, CA) i 10 minutter, Ultra V Block (Lab Vision Corporation, Fremont, CA) i 10 minutter, antistoff-fortynningsbuffer (Ventana Medical Systems, Inc., Tucson, Arizona) i 10 minutter, og til slutt med et fosforylert GSK3p (Cell signalering, Danvers, MA) antistoff i 6 timer i romtemperatur eller et polyklonalt anti-LCRMP-1-antistoff (C2; 1:300 fortynning) over natten ved 4 ° C. Påvisning av farging ble bestemt ved hjelp av Super Sensitive Non-Biotin Polymer HRP Detection System (BioGenex, San Ramon, California) i henhold til produsentens protokoll.
Modifisert Boyden kammer invasjon analysen
Modifisert Boyden kamre med polykarbonat-membran innsatser (porestørrelse 8 pm; Falcon, Becton Dickinson) belagt med 30 ug Matrigel (BD) ble utført celle invasjon analyser. 2,5 x 10
4 celler suspendert i RPMI-medium inneholdende 10% NuSerum (Invitrogen, Eugene, OR) ble platet ut i de øvre kamrene, og 1 ml medium ble tilsatt for å dekke de nedre kamre. Etter 24 timers inkubering ved 37 ° C ble cellene fiksert med metanol ved romtemperatur i 10 minutter. Etter fiksering ble prøvene farvet med en 50 pg /ml oppløsning av propidiumjodid (Sigma, St. Louis, MO) ved romtemperatur i 30 minutter. Hver membran ble fotografert og telles antall celler under et mikroskop ved en forstørrelse på x 50, ved hjelp av Analytical Imaging Station programvarepakke (Imaging Research Inc., St. Catharines, ON, Canada). Hvert eksperiment ble analysert i tre eksemplarer.
immunfluorescens farging for observasjon av filopodia formasjon
Transfekterte eller lentivirus-infiserte celler ble fiksert med 3,7% kald paraformaldehyde, vasket med PBS, etter av permeabilizing med 0,1% Triton X-100. Cellene ble deretter farget med rhodamin-konjugert phalloidin (rød, Molecular Probes, Eugene, OR). Cellene ble montert på objektglass med ProLong® Gold antifade reagens med DAPI (molekylære prober) og deretter undersøkt og fotografert ved hjelp av LSM 700 laserskanning konfokalmikroskop fra Carl Zeiss.
Cell migrasjon analyse
Flytte spor av trekk celler ble utført av video time-lapse mikroskopi som tidligere beskrevet [24]. I korte trekk ble cellene opprettholdt i vekstmedium ved 37 ° C /5% CO
2 og time-lapse bilder ble observert under et AF 6000 LX mikroskop (Meyer Instruments, Inc.) For tidsperioden på 20 timer. Bilder ble tatt med en CoolSNAP HQ CCD-kamera (Roper Scientific, NJ) 5-minutters intervaller og behandles av MetaMorph 5.0 programvare (Universal Imaging, Downing, PA).
Cell kultur og transfeksjon
Den menneskelige lunge adenokarsinom cellelinjer (CL1-0 celler) ble isolert fra en 64 år gammel mannlig pasient med en dårlig differensiert adenokarsinom og valgt i vårt laboratorium ved in vitro Transwell invasjon for å få 5 underlinjer med progressive invasivitet, med lignende genotypiske bakgrunn (betegnet CL1-1, CL1-2, CL1-3, CL1-4, og CL1-5) som tidligere beskrevet [25]. HEK293T cellelinjer ble kjøpt fra American Type Culture Collection (ATCC, USA). De CL1-0 og HEK293T-celler ble dyrket i RPMI og DMEM-medium inneholdende 10% FBS og 2 mM L-glutamin (alle fra Invitrogen, Eugene, OR) ved 37 ° C i en fuktet atmosfære av 5% CO
2- 95% luft, henholdsvis. Alle cellelinjer i dette studiet ble testet med mykoplasma-fri tilstand. Alle transfeksjon eksperimenter ble utført med Lipofectamine eller Lipofectamine 2000 reagenser (Invitrogen) i henhold til produsentens instruksjoner.
proteinsekvenser justering og Plasmider
aminosyresekvenser justering av CRMP-2, CRMP-en og LCRMP-en er basert på deres Gene bank sjonsnummer NP_001377, NP_001304, og NP_001014809 hhv. Den LCRMP-1-ekspresjonen plasmid pCMV-Tag2A-LCRMP-1 (WT) og pEGFP-LCRMP-1 (WT) ble beskrevet som tidligere [10]. Aminosyre-substitusjon mutanter av LCRMP-1 ble dannet ved PCR-basert seterettet mutagenese med en QuikChange kit (Stratagene, Santa Clara, CA) og verifisert ved DNA-sekvensering. FLAG-merket GSK3p (WT, CA og KD form) ekspresjonsplasmider ble subklonet fra pCMV-5A-GSK3p (WT, CA og KD form, en gave fra M.-C. Hung) inn pflag -CMV-5a vektor (Sigma) .
antistoffer
Primære antistoffer for immunblotting var som følger: monoklonale anti-Flag (M2, Sigma), anti-Myc (9E11, Millipore, Billerica, MA), anti-β-actin (Sigma) og polyklonalt anti-LCRMP-1-antistoff. HRP-konjugert geit anti-mus og geit anti-kanin sekundære antistoffer ble kjøpt fra (Amersham Biosciences, Pittsburgh, PA).
Lentivirus produksjon og transduksjon
GFP-merket, ukodet LCRMP-en (WT, T628A og T628D), og myc-merket GSK3p (WT, CA og KD form) ble konstruert ved å klone sin cDNA inn pTYEF lentiviral vektor.
