Abstract
Bakgrunn
Ikke muskel invasiv blærekreft (NMIBC) har høyest tilbakefall av noen kreft og så mange som 70% av pasientene opplever tilbakefall. Avvikende DNA metylering er til stede i alle blæren svulster og kan påvises i urinprøver. Tidligere studier har identifisert DNA metylering markører som viste betydelig diagnostisk verdi. Vi evaluerte betydningen av biomarkører for tidlig deteksjon av svulst tilbakefall i urinen.
metodikk /hovedfunnene
metylering nivåer av
EOMES
,
HOXA9
,
POU4F2
,
TWIST1
,
VIM, etter og
ZNF154
i urinprøver ble målt ved real-time PCR (MethyLight). Vi analyserte 390 urinsedimenter fra 184 pasienter diagnostisert med NMIBC. Urin fra 35 alderstilpassede kontrollpersoner ble anvendt for å bestemme metylering basislinjenivåer. Tilbakefall ble diagnostisert ved cystoskopi og verifisert av histologi. I utgangspunktet sammenlignet vi urin fra blæren kreftpasienter og friske individer og oppdaget betydelig hypermethylation av alle seks markører (P 0,0001) oppnå følsomhet i området 82% -89% og spesifisitet i området 94% -100%. Følgende, validert vi urin hypermethylation for bruk i tilbakefall overvåking og fant sensitiviteter på 88-94% og spesifisitet på 43-67%.
EOMES
,
POU4F2
,
VIM Hotell og
ZNF154
ble oftere metylert i urin fra pasienter med høyere klasse svulster (P≤0.08). Univariat Cox regresjonsanalyse viste at fem markører var signifikant assosiert med tilbakefall av sykdommen;
HOXA9 plakater (HR = 7,8, p = 0,006),
POU4F2 plakater (HR = 8,5, p = 0,001),
TWIST1 plakater (HR = 12,0, P = 0,015)
VIM plakater (HR = 8,0, p = 0,001), og
ZNF154 plakater (HR = 13,9, P 0,001). Interessant, for en gruppe pasienter (n = 15) fant vi at hypermethylation var konsekvent tilstede i urinprøver til tross for mangelen på tilbakefall av tumorer, indikerer tilstedeværelse av et felt defekt.
Konklusjon /Betydning
metylering nivåer av
EOMES
,
HOXA9
,
POU4F2
,
TWIST1
,
VIM, etter og
ZNF154
i urinprøvene er lovende diagnostiske biomarkører for blærekreft tilbakefall overvåking
Citation. Reinert T, Borre M, Christiansen A, Hermann GG, Ørntoft TF, Dyrskjøt L (2012) påvisning av blærekreft tilbakefall basert på Urin Nivåer av
EOMES
,
HOXA9
,
POU4F2
,
TWIST1
,
VIM, etter og
ZNF154
Hypermethylation. PLoS ONE 7 (10): e46297. doi: 10,1371 /journal.pone.0046297
Redaktør: Brock C. Christensen, Geisel School of Medicine ved Dartmouth, USA
mottatt: 07.06.2012; Godkjent: 29 august 2012; Publisert: 03.10.2012
Copyright: © Reinert et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av John og Birthe Meyer Foundation, den danske Rådet for Independent Research, den Lundbeck Foundation, Novo Nordisk Foundation, EU-støtte til UROMOL Consortium no. 201 663, den danske Kreftforeningen, Universitetet i Aarhus, og den danske innenriksdepartementet og Helse. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Kreft i urinblæren er den femte vanligste svulst i de industrialiserte landene. I ca 75% av alle tilfeller vil pasientene presentere med scene Ta eller T1 ikke-muskel invasiv blærekreft (NMIBC), mens de resterende 25% av svulstene vil være muskel invasiv stadium T2-4 kreft (MIBC) [1] . Om lag 60% -70% av pasienter med NMIBC opplever tilbakefall av tumorer innen 3 år etter reseksjon [2], [3] og pasienter kan utvikle tilbakevendende svulster årlig i mange år uten sykdomsprogresjon. Imidlertid vil opp til 25% utvikle seg til muskel invasiv sykdom [4]. Den høye tilbakefall og risikoen for utvikling be behovet for hyppig og lang overvåking, noe som gjør blærekreft den dyreste kreft for å behandle [5], [6]. Etter reseksjon av primærtumor, blir pasientene ofte overvåket av cystoskopi og cytologi. Biopsi som tas ved cystoskopi er gullstandarden for diagnostisering av blære svulster. Sensitiviteten av cystoskopi for NMIBC er nær 80% for hvitt lys cystoskopi, og 96% ved bruk av mer kostbare, fluorescens-guidet cystoskopi ved hjelp av hexaminolevulinate (HAL). For påvisning av dysplasi og carcinoma in situ (CIS), følsomheten av hvitt lys avtar til 48% og 68%, henholdsvis; mens følsomheten av systoskopi ved hjelp av HAL for disse lesjonene forblir i området fra 93% -95% [7] – [9]. Cytologi blir ofte brukt i kombinasjon med cystoskopi, på grunn av en høy spesifisitet på 99% (0,83 til 0,997; 95% CI), men med en lav sensitivitet på 34% (0,20 til 0,53; 95% CI). Følsomheten til cytologi øker for høy-trinns og høy grad av svulster, spesielt for primærsvulster [10]. Det er foreslått at en blære felt feil kan være årsaken til den høye frekvensen av tilbakefall av tumorer i blærekreftpasienter [11]. Flere molekylære endringer har blitt vist å være tilstede i normalt utseende områder av urothelium i pasienter med blærekreft [12], [13], og nylig et epigenetisk felt defekten ble beskrevet [14].
Epigenetikk er studie av mitotisk og /eller meiotically arve endringer i genuttrykk som ikke kan forklares av endringer i DNA sekvens [15]. DNA-metylering er en godt studert epigenetisk mekanisme som er involvert i normale prosesser som utvikling, genomisk preging, og X-kromosom inaktivering [16] – [18]. Endringer i DNA-metylering har vært forbundet med en rekke patologiske humane lidelser, inkludert kreft [19], og transkripsjons- inaktivering av avvikende hypermethylation er et veletablert mekanisme for genet Slå på blærekreft [20] – [23]. Identifisering av DNA metylering markører for påvisning av blærekreft har pågått i noen år. Flere studier har rapportert høy følsomhet og spesifisitet for disse markørene, noe som gjør dem potensielt nyttig som diagnostiske markører for blærekreft [24] – [31]. I en tidligere studie identifiserte vi en rekke DNA-metylering markører (
EOMES
,
HOXA9
,
POU4F2, etter og
ZNF154
) som viste diagnostisk verdi i urinprøver fra BC pasienter [26].
Vi har nå validert diagnostisk og prognostisk verdi av disse biomarkører sammen med tidligere rapportert
TWIST1 product: [25] og
VIM
[30] i urinprøver. Til å begynne med, for å bekrefte viktigheten av de valgte metylering markører, og for å bestemme av markør cut-off-verdier, sammenlignet vi den første urinprøven fra hver pasient med NMIBC til urinprøver fra friske individer. Følgende, vurderte vi diagnostisk og prognostisk verdi av markører for tidlig deteksjon av tumorresidiv bruker urinprøver innhentet ved senere oppfølging besøk.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Informert skriftlig samtykke ble innhentet fra alle pasienter, og forskningsprotokoller ble godkjent av Region Midtjylland komiteer på Biomedical Research Ethics.
Pasient Material
det er totalt 652 annullert urinprøver ble innsamlet ved Institutt for Urologi ved Aarhus universitetssykehus fra 390 pasienter med blærekreft og 47 personer med benign prostatahyperplasi eller blærestein, men ingen historie av blærekreft (kontrollpersoner). Fra disse vi ekskludert 227 prøver, fordi DNA beløpet var under vår terskel (Suppl. Tabell 1), som forlot 425 prøver (390 prøver fra 184 f.Kr. pasienter og 35 fra kontrollpersoner) (Tabell 1 og suppl. Figur 1). Ti til femti ml urin ble samlet ved regelmessige oppfølgingsbesøk. Urinprøver ble samlet umiddelbart før cystoskopi; Cellene ble sedimentert ved sentrifugering og frosset ved -80 ° C. Svulstene ble iscenesatt i henhold til TNM-systemet [32] og gradert etter Bergkvist [33]. Femten av de kontrollpersoner var stix positive for nitritt i urin som angir bakterieinfeksjon. Pasientbehandling og oppfølging ble utført i samsvar med retningslinjene fra European Association of Urology [34].
DNA Extraction og Bisulfite Modification
DNA ble ekstrahert med QIAsymphony Virus /Bakterier Midi kit (96) (Qiagen) ved hjelp av QIAsymphony® SP instrument og ansette Complex800_V5_DSP-protokollen. Fem hundre nanogram DNA var bisulfite endres ved hjelp av EZ-96 DNA metylering D5004 (Zymo Research) i henhold til produsentens anbefalinger og eluert i 60 mL av elusjonsbuffer og lagret ved -20 ° C inntil bruk.
Real- tid Kvantitativ Metylering spesifikke Polymerase Chain Reaction (methyLight)
Metylering analyse ble utført ved hjelp av methyLight [35]. Primere og prober for de seks genene av interesse ble utformet for å omfatte åtte til ti CpG-dinukleotider (Suppl. Tabell 2). For normalisering av DNA innsatsmateriale, brukte vi ALU-C4 repeat element sekvens [36]. qPCR amplifikasjoner ble utført med den TaqMan Universal PCR masterblanding Ingen AmpErase (Applied Biosystems) i henhold til produsentens instruksjoner i duplikater ved bruk av 2 pl (5 ng) av bisulfitt-modifisert DNA i et endelig volum på 5 ul i 384-brønns plater for en ABI 7900 HT Fast real Time PCR System (Applied Biosystems). Hvis duplikater var inkonsekvent, en replikere være positivt for metylering og en negativ for metylering, ble analysen gjentas. Prøven ble utelukket med hensyn til det spesifikke markør hvis en annen inkonsekvent resultat ble oppnådd. Forsterkning protokoller er oppført i suppl. Tabell 2. Forsterkning data ble analysert ved sekvensdeteksjonssystem (SDS 2.4, Applied Biosystems). Hver plate er inkludert en seriefortynning (25-0.04ng) av fullt metylert DNA: CpGenome ™ Universal denaturert DNA) (Millipore) med genet av interesse og ALU-C4 flere templat-kontroller (NTC) brønner, 5 nanogram av et metylert kontrollutvalget [CpGenome ™ Universal denaturert DNA (Millipore)], og unmethylated prøven består av hel-genom forsterket DNA fra perifert blod DNA. Prosentandelen av metylert referanse (PMR) ble beregnet for hver prøve i henhold til ligningen: 100 x [(gen-x kopi verdi) prøve /(ALU-C4 kopi verdi) prøven] /[(gen-x kopi verdi) Universal metylert DNA /(ALU-C4copy verdi) Universal denaturert DNA].
Statistical Analysis
Stata 11 (Statacorp, Texas, USA) ble brukt for alle statistiske beregninger. To-tailed tester ble ansett som statistisk signifikant dersom P 0,05. Metylering forskjeller ble evaluert av parametrisk Wilcoxon-Mann-Whitney test. Fishers eksakte test ble anvendt for å analysere todelte variabler. Den nøyaktige $ x ^ 2 $ test ble brukt for å analysere assosiasjoner mellom klinikk-patologisk parametere med to eller flere kategorier. Korrelasjoner av metylering nivåer av markørene ble beregnet med Spearman korrelasjonskoeffisienter. En ROC-kurve ble laget for hver markør og kombinasjoner av markører ved å plotte følsomhet mot (1-spesifisitet) og arealet under kurven (AUC) ble beregnet. Log-rank tester ble brukt for å evaluere likestilling mellom overlevelse og Kaplan-Meier overlevelses tomter ble brukt for visualisering. Univariat Cox regresjonsanalyse ble brukt til å analysere sammenslutninger av alder, kjønn, scene, klasse, mangfold, og CIS med tilbakefall overlevelse
Resultater
Vår analyse ble delt inn i to deler. 1 ) for å etablere graden av metylering markører cutoff og for å demonstrere betydningen av de utvalgte markører vi analysert den første urinprøven fra hver pasient og sammenlignet for å styre urinprøver fra friske individer; 2) ved hjelp av de bestemte markør cutoff nivåer deretter validert vi diagnostisk og prognostisk verdi av metylering markører i urinprøver tatt under pasientovervåking.
Etablering av test Cut-off nivåer og Initial Validering av Marker Betydning
i utgangspunktet vi definert cut-off nivå med gjennomsnittet metylering nivået til hver markør + 2x standardavviket for metylering nivået i urinprøver fra 35 kontrollpersoner (bare prøver med metylering verdier over null ble inkludert). Cut-off nivåer (PMR verdier – se materialer og metoder) som brukes til å dichotomize metylering markører var:
EOMES
= 0,348,
HOXA9
= 0,077,
POU4F2
= 0,371
TWIST1
= 0,405,
VIM =
0,368 og
ZNF154
= 1,51. Andre cut-off nivå (gjennomsnitt + 1xSD og + 3xSD) basert på metylering nivåer i kontrollurinprøver ble først vurderes (resultater ikke vist). For å validere betydningen av markører for diagnostikk av blærekreft vi sammenlignet den første urinprøven fra 184 pasienter diagnostisert med NMIB til urinprøver fra 35 kontrollpersoner (tabell 1). Alle seks markører var svært betydelig hyper-metylert i urinen fra pasienter med NMIBC sammenlignet med urin fra friske individer (Mann-Whitney, P 0,0001) (tabell 2). Bedre sensitiviteter av markørene ble observert ved analyse av urinprøver fra pasienter med en innfallende tumor sammenlignet med urin fra pasienter med tilbakevendende tumor (Suppl. Tabell 3). Det ble ikke observert mellom de enkelte markører og tumorstadium, men
EOMES
,
POU4F2
,
VIM
, og
ZNF154
var mer metylert i klasse III lesjoner sammenlignet med karakteren jeg lesjoner (Fishers eksakte test, P≤0.048) (Suppl. tabell 4).
EOMES
,
POU4F2, etter og
ZNF154
var mindre metylert i svulster med en størrelse under 3 cm. (Fishers eksakte test, P≤0.047) (Suppl. Tabell 4).
Påvisning av anfall ved metylering Markers
Vi validert klinisk nytteverdi av markører for blærekreft overvåking. Vi stratifisert vår analyse for å bare inkludere pasienter som i utgangspunktet viste hypermethylation av en eller flere metylering markører. Avhengig av markør studert, 11-18% av pasientene viste ingen metylering i den første svulsten og ble derfor ikke inkludert. Dette begrenset analysen til 158 pasienter og 206 urinprøver fra oppfølgingsbesøk; 139 Urinprøvene var fra pasienter med tilbakevendende blære tumor og 67 urinprøver var fra pasienter uten tumorresidiv (tabell 1). Ansette cut-poeng bestemmes i utgangspunktet å bruke urin fra friske individer; Vi oppnådde sensitiviteter i området fra 87% til 94%, og spesifisiteter i området fra 28% til 47% (tabell 3). Til sammenligning følsomheten til cytologi var 77% og spesifisiteten var 60%. Vi observerte ingen signifikante sammenhenger mellom metylering nivåer og clinicopathologic variabler for denne pasienten kohort med tilbakevendende tumorer (Suppl. Tabell 5).
De molekylære tester kan ha en høyere sensitivitet i forhold til gullstandarden cystoskopi. For å møte dette brukte vi derfor cystoskopi resultater fra en 12 måneders periode etter at urinen ble samplet. Vi fant mange av prøvene tidligere klassifisert som falske positiver å være sanne positive; de bare hadde en positiv ledetid sammenlignet med cystoskopi. Den oppnådde følsomhet varierte fra 88% til 94%, og spesifisitet varierte fra 43% til 67% (tabell 4). Inkludert svulster diagnostisert i løpet av en 12 måneders oppfølgingsperiode og kombinere to markører med kravet om at begge merkene var positive for et positivt testresultat sensitiviteten redusert (område: 86-93%), mens spesifisitet økt (område: 50-73 %). Hvis bare en av de to markørene skal være positiv, følsomheten økes (område: 92-98%), mens spesifisiteten redusert (område: 29-60%) (.. Suppl Tabell 6 og Tabell 7 Suppl, henholdsvis). Totalt sett, kombinasjoner av markører ble ikke bedre både sensitivitet og spesifisitet av testene.
prognostisk verdi av metylering markører for å forutsi senere anfall
For å møte den prognostiske verdien av metylering markørene vi analyserte urinprøver fra pasienter på besøk der ingen svulster ble diagnostisert ved hjelp av cystoskopi. For alle merkene fant vi at en positiv markør på en tumor-negative besøk var signifikant assosiert med senere tumorresidiv under 24- og 60-måneders oppfølgingsperioder (log-rank test, P≤0.04) (figur 1 og suppl. Figur 3). Det ble ikke observert de mest betydelige forskjeller i den 24-måneders tidsramme for
POU4F2 Hotell og
ZNF154 plakater (log-rank test, P 0,0001) hvor bare 12% (3/25) og 8% (2/26) uten metylering opplevd et tilbakefall innen 2 år, henholdsvis. For de metylering-positive prøvene prosentandelen av pasienter med senere tilbakefall var 68% (21/31) for
POU4F2 Hotell og 63% (20/32) for
ZNF154
. Univariat Cox regresjonsanalyse viste at
HOXA9 plakater (HR (95% KI) = 7,8 (1,8 til 33,7)),
POU4F2 plakater (HR (95% KI) = 8,5 (2,5 til 28,5) ),
TWIST1 plakater (HR (95% KI) = 12,0 (1.6-88.6)),
VIM plakater (HR (95% KI) = 8,0 (2,4 til 26,8)), og
ZNF154 plakater (HR (95% KI) = 13,9 (3.3-59.7)) var signifikant assosiert med tilbakefall overlevelse. Alder, kjønn, tidligere stadium, tidligere klasse, tidligere mangfold, og tidligere CIS var ikke signifikant assosiert med tilbakefall overlevelse (P 0,05). Følgelig er nærværet av en endret metylering av DNA i urinen så ut til å være sterkt relatert til prognosen.
DNA metylering er assosiert med påfølgende tumor tilbakefall i løpet av 24 måneder for pasienter uten svulst, men med metylering-positive urinprøver. Kaplan-Meier plott av tilbakefall overlevelse som en funksjon av dikotomert metylering nivåer for
EOMES product: (P = 0,0397) (A),
HOXA9 product: (P = 0,0009) (B),
POU4F2 product: (P 0,0001) (C),
TWIST1 product: (P = 0,0017) (D),
VIM product: (P = 0,0001) (E), og
ZNF154 product: (P 0,0001). (F)
Identifisering av pasienter med mulig epigenetisk Feltet Defect
Hvis metylering av biomarkører ble begrenset til ondartede celler, vi må bare oppdage markører i urin når en svulst var til stede, eller skjer innenfor en overskuelig fremtid avhengig av veksten av svulsten. Men resultatene viser at selv høye urinnivåer av metylering kan være til stede ved ferdsel uten tilbakefall (Suppl figur 2, pasienter C og D,.. Suppl figur 3). Vi kunne identifisere en gruppe på 15 pasienter (31%) som metylering var til stede i urinen ved første besøk og fortsatte å være til stede i urinprøver tatt ved senere oppfølging besøk, selv om ingen svulst skjedde. Som et eksempel ble en metylering-positiv pasient med mest mulig langvarig oppfølging diagnostisert med CIS etter 118 år, men hadde ingen lesjoner i mellom. De 15 pasienter med en feltfeil, men ingen tilbakefall, har et betydelig lavere antall svulster ved tidligere besøk (P = 0,02) sammenlignet med pasienter med tilbakefall av sykdommen.
Modifisert fra Hermann GG et al. (https://skejby.net/Webudgaven/DaBlaCa2010.htm.).
Diskusjoner
I denne studien har vi utført en uavhengig validering av
EOMES
,
HOXA9
,
POU4F2
,
TWIST1
,
VIM
, og
ZNF154
metylering for urin diagnose i blærekreft overvåking. Vi fikk følsomhet i området 87% -93% og spesifisitet i området 28% -47%. Når inkludert svulster resected i en 12 måneders oppfølgingsperiode vi fått følsomhet i området 88% -94% og særegenheter i området 43% -67%. Univariat Cox regresjonsanalyse viste at metylering markører spådde fremtidige tilbakefall med hazard ratio i området 7,8 til 13,9 (P≤0.015). Forrige scenen, klasse, mangfold og CIS var ikke signifikant assosiert med tumor tilbakefall. Interessant, vi også observert at enkelte pasienter med blærekreft uten tilbakefall fortsatt opprettholdt avvikende urin metylering som skilte dem fra kontrollpersoner. Vi tror at dette kan være forårsaket av en generell epigenetisk blæreslimhinnen endring.
De kontroller som anvendes i denne studien var fra pasienter med benign prostatahyperplasi (BPH) eller blærestein og 43% av kontrollene var nitritt positive, indikerer blære infeksjoner. Noen av cellene i urinen til kontrollene kan stamme fra hyperplasia, eller kan være immunologiske eller bakterieceller. Lignende kontrollprøver ble anvendt ved markørene ble først undersøkt som markører for blærekreft, noe som tyder på at metyleringen frekvensen av de utvalgte markører er lav i disse celletyper [25], [26], [30]. Celler fra prostata eller fra en blære infeksjon kan likevel skjevhet av de oppnådde resultater ved fortynning av tumorcellene. Dette kan føre til falske negative testresultater. Bakterielle infeksjoner er mye mindre vanlig og i studien infeksjoner ble ikke signifikant assosiert med markør metylering, noe som indikerer at infeksjoner påvirket ikke markør følsomhet (Suppl. Tabell 4).
Det er bemerkelsesverdig at bare 9% av tilbakefall er klasse I. Derfor de beregnede følsomheten markørene kan være høyere sammenlignet med følsomhet som ville bli hentet fra en rekke av lav-risiko pasienter med et mye høyere antall verne svulster.
en av de hoved~~POS=TRUNC utfordringene~~POS=HEADCOMP ved hjelp av urin markører blir nok kreftceller, og mens MethyLight er en svært følsom metode vi hadde fortsatt å utelukke 227 (35%) prøver fra studien på grunn av utilstrekkelige mengder av DNA. Vi har observert at hvis vi inkluderte prøver med mindre enn 5 ng DNA som templat i analysen, redusert følsomhet, og for pasienter under overvåkning spesifisiteten økt. Ved å utelukke pasienter basert på mengden av DNA ekstrahert fra annulleres urinprøver, opprettholder vi integriteten til MethyLight analysen på bekostning av å innføre en forspenning, hvor spesielt pasienter med stadium Ta Grade I svulster er utelukket, som klasse I-lesjoner peeling den minste antall celler [37] (Fishers eksakte test, P 0,05) (. Suppl tabell 1). Nylig, en studie av Zuiverloon et al. rapportert en økning i følsomheten for
FGFR3
mutasjon som en markør for tumorresidiv fra 75% til 100% når volumet av urin som brukes under prøven ble øket [38]. Ved å øke volumet av oppsamlet urin fra dagens 10 til 50 ml, vil færre prøvene må utelukkes [39], [40]. Andre muligheter for å bedre analyse for å avdekke metylering kan omfatte analyse av to eller flere prøver separat eller å bruke en annen teknologi enn Methylight (f.eks Nøstet PCR).
metylering markør test kan bli supplert med
FGFR3
mutasjon analyse.
FGFR3
mutasjoner er til stede i ca 70% -80% av lavgradig NMIBC, og mutasjoner i
FGFR3
genet har vist seg å være synlig i DNA fra annullert urin [41], [42]. I likhet med den metylering analyse,
FGFR3
analysen er basert på DNA, og den primære besøk kan brukes til å stratifisere for tilstedeværelsen av mutasjonen. Nyere studier med
FGFR3
mutasjoner alene for å oppdage NMIBC tilbakefall rapportere en sensitivitet på 58% for samtidige tilbakefall. Sensitiviteten økte når 12 måneders oppfølging var inkludert [43]. Kombinasjonen av
FGFR3
mutasjoner og metylering markører har blitt testet av Serizawa et al., Og de observerte en økning i følsomheten av DNA fra annullert urin når du kombinerer metylering markører og
FGFR3
mutasjoner [44 ]. Det er bemerkelsesverdig at de observerte en invers korrelasjon mellom hypermethylation og
FGFR3
mutasjoner.
Det faktum at vi ikke finner noen sammenheng mellom metylering og clinicopathologic variabler når du bruker bare urin fra pasienter med tilbakevendende svulster er spennende , men det kan være at den lavere følsomhet observert i lav grad av tumorer ikke bare forårsaket av noen få ekspandert tumorceller i urinen, men snarere at hypermethylation ikke er tilstede i tumoren eller i den omgivende urothelium, og ved stratifying for metylering på et tidligere besøk disse pasientene er utelukket. Det er mulig at pasienter med ingen metylering er å anse som en distinkt gruppe av blæretumorer. Endelig kan mangelen på sammenheng mellom metylering og klinikk-patologisk variabler også være en konsekvens av den relativt lille datasettet.
metylering markørene har spesifisitets-verdier i området 43% til 67%, noe som er lav med tanke at de alle har mellom 94% -100% tumor spesifisitet når sammenlignet med kontrollpersoner. En tilsvarende lav spesifisitet ble observert i en studie undersøker mRNA nivåer av hTERT, SENP1, PPP1CA, og MCM5 i urinen hentet fra pasienter under sykdomsovervåking [45]. Lav spesifisitet ble også observert av Zuiverloon et al. når studere
FGFR3
mutasjoner for å oppdage blærekreft tilbakefall [38]. Videre lav spesifisitet metylering markører ble tidligere rapportert andre steder av to studier som tar sikte på å oppdage NMIBC tilbakefall [46], [47].
metylering observert i urinprøver fra cystoskopi-negative besøk kan ha flere kilder, ( i) en liten tumor ikke detektert av systoskopi, (ii) gjenværende tumorceller på stedet av reseksjon, eller (iii) det kan være et symptom på epigenetiske endrede urotelialceller tilstede i urothelium som omgir svulsten eller på andre steder (felt defekt ) som ikke har noen fenotype for å skille dem fra normale urotelialceller – et epigenetisk urothelial methylator fenotype [14]. Noen av de falske positive prøver med et tilbakefall i løpet av 12 måneder etter systoskopi er mest sannsynlig forårsaket av tapte svulster eller gjenværende tumorceller, men for resten av de falske positive prøver denne forklaringen er usannsynlig og våre resultater samsvarer godt med tilstedeværelse av en blære feltet defekt. Nyere data understøtter ideen om at det er et DNA-hypermethylation felt defekt i blærene fra BC-pasienter hvor normal-vises vev inneholder omfattende DNA-metylering [14]. Wolff og medarbeidere foreslår at den avvikende metylering er ikke på grunn av klonal ekspansjon, men i stedet er forårsaket av generell epigenetisk forandring i urothelium over blæren. Det er blitt foreslått at dette utbredt feltet av aberrant metylert normal-vises urothelium kan være opphavet til stor grad av tilbakefall i blærekreft [14].
Med oppdagelsen av metylering markører med meget høy følsomhet, gjennomføring av metylering markører innen overvåking av pasienter med lavgradig NMIBC virker sannsynlig. På tidspunktet for diagnose, har metylering nivået for hver metylering markør for å være etablert før markøren kan brukes til overvåkning. I forkant av neste kontroll besøk, kan pasienten levere en urinprøve for analyse, og tre mulige utfall finnes: i) hvis testen er positiv pasienten vil ha en cystoskopi gjort, og 67 pasienter av 100 en tilbakevendende svulst vil bli funnet, mens de resterende 33 pasientene ikke vil ha en svulst tilbakefall. Dette er ikke et stort problem, da de falske positive pasienter ville ha hatt en systoskopi gjøres i ethvert tilfelle; ii) en negativ test vil tillate pasientene å hoppe over gjeldende cystoskopi. Med dagens ytelse av analysen, er 94 av 100 BC pasienter med svulst tilbakefall riktig diagnostisert og seks pasienter blir feilaktig diagnostisert som ikke har en svulst tilbakefall. Denne mengden av falske negative er sammenlignbar med HAL-guidet cystoskopi og bedre enn hvitt lys cystoskopi, hvor 20 pasienter kan forventes å bli feilaktig diagnostisert som ikke har en svulst tilbakefall [7] – [9]. Men i denne studien
ZNF154
markør unnlatt å diagnostisere to muskel-invasiv blærekreft som gått fra to T1 klasse III svulster. Dette ville ikke være akseptabelt i en klinisk setting, og indikerer at pasienter med høy risiko for progresjon (f.eks alle T1, klasse III svulster, eller CIS) må fortsette med den vanlige behandlingsregime. Et annet alternativ kan være å bruke en mer konservativ cut-off. Ved å definere cut-off verdier som gjennomsnittet pluss 1x standardavvik til metylering nivå, de to muskel invasive svulster ville ikke ha vært savnet; iii) en urinprøve med utilstrekkelig DNA bør føre til videreføring av den opprinnelige behandlingsregime. I alle tre tilfeller pasienten vil levere en ny urinprøve før neste kontroll besøk som vil avgjøre hvorvidt pasienten må ha en cystoskopi utført. De metylering markører kan også øke deteksjonsraten av CIS lesjoner, som en positiv test med en negativ cystoskopi kan da bli etterfulgt av en annen cystoskopi inkludert HAL.
I konklusjonen, ved å bruke en svært følsom og semi-kvantitativ metodikk for påvisning av blærekreft tilbakefall og stratifisering for metylering statusen til den innledende tumor, har vi vist at bruk av en enkelt markør (
ZNF154
) kan vi påvise en samtidig tumorresidiv med en sensitivitet på 94% og en spesifisitet på 67 %. Ifølge EAU Retningslinjer for NMIBC, gjeldende behandlingsregime for lav risiko NMIBC pasienter er cystoskopi på 3 og 12 måneder etter TUR, og deretter hvert år i ytterligere 4 år [48]. Denne studien tyder på at metylering markører kan benyttes som markører for blærekreft tilbakefall for å redusere antallet cystoskopier i lav-risiko pasienter uten samtidig tumor (figur 2) og dermed forbedre livskvaliteten for pasientene samt redusere helsevesenet utgifter.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
flytskjema som illustrerer strømningen av prøvene i løpet av studien.
doi: 10.1371 /journal.pone.0046297.s001
(EPS)
Figur S2.
Eksempler på metylering nivåer ved første besøk og to påfølgende besøk for 5 pasienter med eller uten tilbakefall. Pasienter med to påfølgende residiv (A og B). Pasient uten tilbakefall ved første kontroll besøk, men tilbakefall på et senere kontrollbesøk (C og D). En pasient med noen påfølgende tilbakefall (E). PMR er prosentandelen av relativ referanse. En verdi på 0% betyr ingen metylering og en verdi på 100% betyr fullt denaturert. En mørk stolpe representerer et besøk ved samtidig svulsten og en grå linje representerer et besøk uten tumor
doi:. 10,1371 /journal.pone.0046297.s002 plakater (EPS)
Figur S3.
Kaplan-Meier plott av tiden til tilbakefall. DNA metylering er assosiert med påfølgende tumorresidiv innen 60 måneder for pasienter uten tumor, men med metylering positive urinprøver.
