Abstract
Mekanismer av unormal protein fosforylering som regulerer celle invasjon og metastasering i kreft i bukspyttkjertelen er fortsatt uklar. I denne studien brukte vi høy gjennomstrømming fosforylering array å teste to bukspyttkjertelkreft cellelinjer (PC-1 celler med lav og PC-1.0 celler med et stort potensial for invasjon og metastasering). Vi merket oss at totalt 57 proteiner avdekket en differensial uttrykk (endring ≥ 2,0). Seks kandidat proteiner ble ytterligere bekreftet ved western blot med resultater funnet å være i overensstemmelse med tabellen. Av 57 proteiner, 32 oppregulert proteiner (f.eks CaMK1-a og P90RSK) var hovedsakelig involvert i ErbB og neurotrofin signalveier som bestemmes ved hjelp DAVID programvare, mens 25 nedregulert proteiner (f.eks BID og BRCA1) ble tett involvert i apoptose og p53 signalveier. Videre ble fire proteiner (akt1, Chk2, p53 og P70S6K) med forskjellige fosforyleringsseter funnet, ikke bare blant oppregulert, men også blant nedregulert proteiner. Viktigere, kan spesifikke fosforyleringsseter påvirke cellebiologiske funksjoner. CentiScaPe programvare beregnet topologiske egenskapene til hver node i protein-protein interaksjon (PPI) nettverk: Vi fant at akt1 eier de maksimale node grader og betweenness i oppregulering protein PPI nettverk (26 noder, gjennomsnittlig banelengde: 1,89, Node grader : 6.62 ± 4.18, betweenness: 22,23 ± 35,72), og p53 i nedregule protein PPI nettverk (17 noder, gjennomsnittlig banelengde: 2.04, node grader: 3,65 ± 2,47, betweenness: 16,59 ± 29,58). I konklusjonen, kan identifisering av unormal protein fosforylering relatert til invasjon og metastase tillate oss å identifisere nye biomarkører i et forsøk på å utvikle nye terapeutiske narkotika mål for kreft i bukspyttkjertelen behandling
Citation. Tan X, Liu P, Huang Y, Zhou L, Yang Y, Wang H, et al. (2016) Phosphoproteome Analyse av Invasion og metastaserelaterte faktorer i kreft i bukspyttkjertelen celler. PLoS ONE 11 (3): e0152280. doi: 10,1371 /journal.pone.0152280
Redaktør: Dong Wang, Harbin Medical University, Kina
mottatt: 14 november 2015; Godkjent: 12 mars 2016; Publisert: 25 mars 2016
Copyright: © 2016 Tan et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Natural Science Foundation of China (nr 2014021006) Liaoning
Konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer.
Innledning
kreft i bukspyttkjertelen er en svært ondartet sykdom med en svært dårlig prognose. Til tross for betydelige fremskritt i radiologiske og endoskopisk ultralyd teknikker, den presenterer ofte som en lokalavansert eller metastaserende sykdom hos de fleste pasientene, og bare ca 10-20% av pasientene er vurdert kandidater til kirurgi [1, 2]. Bortsett fra kirurgi, trenger andre effektive metoder for behandling ikke eksisterer, og overlevelse for resected pasienter er også svært lav. Den viktigste årsaken til dårlig prognose er lokale residiv og /eller fjernmetastaser etter operasjonen. Dette tyder på at det å forstå de cellulære og molekylære mekanismer som er involvert i invasjon og metastasering av kreft i bukspyttkjertelen er viktig og krever videre utforskning.
Men protein post-oversettelses endringer i bukspyttkjertelen kreft cellelinjer som kan spille viktige roller i regulering av cellulære responser, ikke er blitt tydelig vist. Det er derfor viktig å identifisere eventuelle fosforylering hendelser og for å bestemme hele protein fosforylering profiler av tumorceller. Nylig, ved å sammenligne phosphoproteomes på forskjellige utviklingsstadier av hudkreft hos mus, proteiner assosiert med tidlige og sene cellulære responser ble identifisert, og gir ny innsikt i utviklingen av sykdommen [3]. Batchu et al. funnet at MIR-26a behandling kunne gjenopprette villtype funksjoner av mutant p53 via fosforylering ved sine Ser9 og Ser392 rester, noe som resulterer i inhibisjon av cellevekst [4]. Derfor spiller setespesifikk fosforylering av proteiner en viktig rolle i regulering av celleprosesser.
Imidlertid, så vidt vi vet, har studier ikke analysert phosphoproteome profilene for de to homogene cellelinjer (PC-en med en lav, og PC-1.0 med et stort potensial for invasjon og metastasering) [5, 6] i bukspyttkjertelkreft forskning. Vårt mål er å sammenligne endringer på 582 fosforyleringsseter av 452 proteiner mellom PC-en og PC-1.0 celler ved å utnytte Phospho Explorer Antistoff Array teknologi. I tillegg, som trasé og nettverk knyttet til fosfoproteiner identifisert i vår studie viser viktige variasjoner i sine komponenter.
Materialer og metoder
Cellelinjer og cellekultur
To hamster bukspyttkjertelkreft cellelinjer ble brukt: svakt invasiv og metastatiske celler (PC-en), og svært invasive og metastatiske celler (PC-1.0). PC-en cellelinje ble etablert fra bukspyttkjertelen duktale adenokarsinomer indusert av BOP i en syrisk gyllen hamster. PC-1.0 cellelinje ble etablert fra en subkutan svulst produsert etter inokulering av en hamster ved PC-1 celler [5,6].
In vitro
, PC-1.0 celler er i hovedsak enkeltceller, mens PC-1 celler vokse som øy-lignende cellekolonier.
In vivo
, lokal invasjon av PC-1.0 celler og lokal utvidelse av PC-1 celler ble observert [7].
PC-1.0 og PC-1 celler ble inkubert i RPMI-1640 (Gibco-BRL, Grand Island, NY, USA), supplert med 10% føtalt bovint serum (Bioserum, Canterbury, Victoria, Australia), 100 U /ml penicillin G og 100 ug /ml streptomycin ved 37 ° C i en fuktig atmosfære av 5% CO
2/95% luft.
Phospho-protein profilering av Phospho Explorer antistoff Array
Cellelysater oppnådd fra PC-1 og PC-1,0-celler ble anbrakt på en phospho Explorer antistoff Array (Full Moon Biosystems, Sunnyvale, CA, USA). Matrisen inneholdt 1318 antistoffer. Hver av de antistoffene har to replikater som er trykt på bestrøket glass objektglass, sammen med flere positive og negative kontroller. Kort sagt ble cellelysatene ekstrahert med antistoff Array Assay Kit som inneholdt en protease inhibitor cocktail og fosfatase-inhibitor, og ble utført i henhold til produsentens protokoll. 25 ug av cellelysater ble merket med 3 ul biotin. Antistoff microarray glass ble først blokkert i en blokkeringsløsning i 30 minutter ved romtemperatur, skylt med Milli-Q kvalitet vann, og tørket med komprimert nitrogen. Og deretter inkubert med biotin-merkede cellelysater i kobling av oppløsningen ved værelsestemperatur i 2 timer. Array Platene ble vasket fire ganger med 60 ml av 1 x vaskeløsning og skylt grundig med Milli-Q vann grad før deteksjon av bundne biotinylerte proteiner ved anvendelse Cy3-konjugert streptavidin. Glassene ble skannet på en GenePix 4000 scanner og bildene ble analysert med GenePix Pro 6.0 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA).
En fosforylering forholdet endringen ble beregnet basert på følgende ligning der uttrykk for fosforylert proteinene ble normalisert til tilsvarende ufosforylerte protein-ekspresjon i både eksperimentelt (PC-1,0) og referansedata (PC-1). Fosforylerte proteiner ble ansett for å være forskjellig uttrykt når en økning (≥ 2,0) eller reduser (≤ 0,5) skjedde i forholdet mellom uttrykk nivåer mellom PC-1.0 og PC-1 celler. Proteinfosforylering data ble bekreftet av western blot.
Antistoffer og reagenser
Kanin polyklonale antistoffer dannet mot epitoper av menneskelig Abl1, pAbl1-Tyr204 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA), ITGB4 , ITGB4-Tyr1510 (Abcam, Cambridge, MA, USA), Myc, pMyc Ser62, Fos, PFOS-Thr232, IRS-1, Pirs-en-Ser636, Raf1, pRaf1-Tyr341 og ß-aktin (Santa Cruz Biotechnology, Dallas , TX, USA) ble brukt som primære antistoffer. Pepperrotperoksidase-konjugert sekundære antistoffer eller FITC-merket fluorescerende antistoffer (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA) ble brukt som sekundære antistoffer for western blotting. FOS og IRS-1 siRNA ble kjøpt fra Santa Cruz Bioteknologi (Dallas, TX, USA). RAF1 inhibitor (GW5074) ble kjøpt fra Selleck Chemicals (Houston, Texas).
Western blot
Western blotting ble utført som beskrevet tidligere [7]. Celler ble oppsamlet på is ved hjelp av RIPA-buffer supplert med protease inhibitor cocktail og fosfatase-inhibitor i 30 minutter. I korte trekk, ble prøver av tilsvarende totalt protein (20 pg) kjøres i en 5% polyakrylamid slab-gel og overført til en polyvinyliden fluorid (PVDF) membran (Bio-Rad, Anaheim, CA, USA). Membraner ble inkubert med primært antistoff, fortynnet i 0,1% Tween-20 /PBS, over natten ved 4 ° C. Blottene ble deretter inkubert med pepperrot-peroksidase-konjugert sekundært antistoff (fortynnet 1: 5000) i 0,1% Tween-20 /PBS. Proteinene ble visualisert ved hjelp av forbedrede chemiluminescence gjenkjenning reagenser (Santa Cruz Biotechnology).
In vitro
invasjon og migrasjonsanalyser
PC-1.0 celler ble transient transfektert med forskjellige sirnas hjelp Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Grand Island, New York), eller ble undertrykkes ved hjelp av RAF1 inhibitor. For invasjonsTransWell-analyser, de transfekterte celler (5 x 10
4 celler /ml) i serumfritt medium ble tilsatt til de øvre kamrene, som ble kjøpt fra Costar (8 um pore-størrelse filtre, New York, NY) og belagt med Matrigel (dilution1: 4). De nedre kamre ble fylt med RPMI-1640 inneholdende 10% serum. Etter 24 timer inkubering ble cellene igjen i de øvre kamrene fjernet, og invasive celler i de nedre kamre ble fiksert med 4% paraformaldehyd (Sigma-Aldrich), farget med krystallfiolett ved romtemperatur, og tellet under et mikroskop. For sårheling migrering assay, ble de transfekterte cellene sådd ut på 6-brønners plater i 24 timer. En 1 mm bred sår ble laget på tvers av monolaget ved hjelp av spissen på en 200 ul pipette. Deretter bildene ble tatt ved 0, 6 og 12 timer ved hjelp av et mikroskop. PC-1,0-celler ble utført som ovenfor beskrevet som en kontroll. Hvert eksperiment ble utført i duplikater og tre ganger. For å bekrefte graden av tre proteiner i knockdown cellen, ble cellene utsatt for real-time PCR og Western blot-analyse ved anvendelse av spesifikke primere og antistoffer, henholdsvis. Primere som brukes til forsterkning av FOS og IRS-1 er oppført i S1 tabell.
Gene ontologi og Kyoto Encyclopedia of gener og genomer (KEGG) pathway analyser og søkeverktøy for henting av Samspill Gener /Proteiner
for deteksjon av betydelig beriket Gene Ontologi (GO) termer ble Cytoscape plugin BINGO brukt [8,9]; forskjellig uttrykt fosforylerte proteiner ble automatisk satt sammen til kategorier av biologisk prosess, molekylær funksjon eller mobil komponent. GÅ grupper med en korrigert
P
-verdi 0,01 ble betegnet for ulike betydning nivåer. Pathway analyser av forskjellig uttrykt fosforylerte proteiner ble utført ved bruk av DAVID (Database for kommentering, visualisering og integrasjon Discovery) bioinformatikk ressurser (https://david.abcc.ncifcrf.gov/) [10] bioinformatikk og betydelig endret signalveier ble valgt ut på en
P
-verdi 0.01, og FDR (False Discovery Rate) 10%. Anrikning kan derfor bli målt kvantitativt ved å bruke en modifisert Fishers eksakte test. Ved hjelp av et søkeverktøy for henting av å samhandle Gener /Proteins (STRING) (https://www.string-db.org/) database, fikk vi en protein-protein interaksjon (PPI) nettverk [11]. En PPI Nettverket ble bygget når en tillit score på mer enn 0,9 viste at bare interaksjoner med en høy grad av tillit ble ansett som gyldige lenker i PPI nettverket.
Topological analyse av PPI nettverk
for en bedre forståelse av PPI-nettverket, ble CentiScaPe programvare [12] benyttes til å analysere de topologiske karakteristika for nettverket og til å beregne node grad fordeling, gjennomsnitt veilengde, topologisk koeffisient og betweenness. Vi kunne rett analysere molekylær interaksjon nettverk ved hjelp visualisert verktøy, og fått interessante viktige proteiner. Videre ble en GeneMANIA (https://www.genemania.org/) webserveren ansatt for å forutsi nettverkene. Et slikt web server verktøy laget effektive genet funksjon spådommer, inkludert co-uttrykk, fysiske interaksjoner, stier og spådd nettverk, som er basert på tidligere rapportert eksperimentelle data [13]. I denne rapporten har vi benyttet en automatisk valgt vekting metode og brukes menneskelig som en kilde arter å forutsi nettverk.
Statistikk analyse
Statistisk analyse og grafikk ble foretatt ved hjelp av GraphPad Prism 6.0 (GraphPad Software, San Diego CA). Resultatene er presentert som gjennomsnitt ± standard feil av gjennomsnittet (SEM). Sammenligninger av kvantitative data ble analysert ved Student
t
test eller ANOVA mellom to grupper (tosidig;
P
-verdier 0,05 ble ansett for å være statistisk signifikant).
Resultater
forskjellig uttrykte protein fosforylering identifisert av PEX100 i høyt (PC-1.0) og svakt (PC-en) invasive og metastatiske bukspyttkjertelen celler
For å identifisere forskjellig uttrykt signaliserer-forbundet fosforylerte proteiner mellom høyt (PC-1.0) og svakt (PC-en) invasiv og metastatisk kreft celler, uttrykk nivåer av fosfo-antistoff spesifikke proteiner i de to bukspyttkjertelkreft cellelinjer ble sammenlignet. Av de 1318 antistoffer analysert i microarray eksperimenter, totalt 57 proteiner viste differensial uttrykk ved hjelp av en fold ratio ≥ 2 som kriterium cutoff. Av disse 57 proteinene, ble uttrykket nivåer av 32 proteiner markert økt i PC-1,0 sammenlignet med PC-1-celler (Tabell 1 viser de ti mest oppregulert proteiner). I motsetning til dette ble uttrykket nivåer av 25 proteiner signifikant redusert i PC-1,0 sammenlignet med PC-1-celler (tabell 2 viser de ti mest downregulated proteiner). Forholdene vist representerer uttrykk nivåer i PC-1.0 celler sammenlignet med uttrykk nivåer i PC-1 celler. CaMK1-α ble over-uttrykt ved høye nivåer i PC-1.0 celler mens Smad1 ble nedregulert, avslører en lav rekke intensitet. Videre ble fire proteiner (akt1, Chk2, p53 og P70S6K) med forskjellige fosforyleringsseter funnet, ikke bare blant oppregulert, men også blant nedregulert proteiner. Den faktiske rekke chip bildene ble vist i S2 tabell og uttrykk for alle proteiner ble oppført i S3 tabell.
Validering av fosforylering proteiner ved western blot, og differensielt proteiner spiller en viktig rolle i celle migrasjon og invasjon av PC-1.0 metastatisk
for å validere proteinfosforylering data, uttrykket nivåer av seks tilfeldig utvalgte proteiner fra sammenligninger av PC-1.0 og PC-1 celler ble re-undersøkt ved western blot (fig 1). Western blot viste at alle seks proteiner viste økt fosforylering i PC-1.0 celler i samsvar med vår rekke data, noe som bekrefter sistnevntes pålitelighet. For å forstå funksjonelle relasjoner av differensial endring i protein fosforylering i svært metastatiske PC-1.0 celler, ble invasjon og migrasjonsanalyser utført. Western blot og real-time PCR-analyser ble utført for å bekrefte effektiviteten av siRNA eller inhibitor nedregulering (Som vist i Tabell S3). Det ble observert en kraftig inhibering av migrering for FOS, IRS-1 og RAF1 ved hjelp av siRNA eller antistoff-blokkerende (figur 2A), og med hensyn invasjon, FOS, IRS-1 og RAF1 også forårsaket en signifikant reduksjon i invasjonen evne (figur 2B).
Som vist, er den totale ekspresjon av hvert protein var lik i begge cellelinjene, mens den på fosforylering nivå, ekspresjon av seks proteiner var sterkere i PC-1,0-celler enn PC-1 celler. Molekylære markører er indikert.
(A) Effekt av tre proteiner på migrasjon etter bruk siRNA eller antistoff som blokkerer i svært metastatisk PC-1.0 celler. Cellene ble inkubert i 24 timer. Prosentandelen migrasjon ble beregnet og grafisk. * Sammenlignet med PC-1.0,
P
-verdi 0,01. (N = 3) (B) Kvantifisering av transwell analyse for-behandlede gruppen og kontrollgruppen. Cellene ble telt i tre eksemplarer brønner og i tre identiske eksperimenter, * Sammenlignet med PC-1.0,
P
-verdi 0,01. (N = 3)
Funksjonell klassifisering, nettverk og sti analyse
For å forstå lignende biologiske prosesser som korrelerer med invasjon og metastasering av kreft i bukspyttkjertelen celler, vi utforsket disse igjen ved hjelp av online funksjonell annotering verktøy, trasé DAVID, og med KEGG analyse. GO sikt analyse viste at målene ble beriket i mange prosesser (tabell 3-5), inkludert aminosyre fosforylering og post-translasjonell proteinmodifisering. Pathway analyser avslørte slike oppregulert mål ble beriket på 27 KEGG baner (figur 3A), som var viktig for metabolisme (insulin signalveien og cellesyklus), immunitet (T-celle reseptor signalveien) og utvikling (ErbB signalveien). Proteiner dannes et PPI nettverk og er innblandet i å endre og kontrollere cellulær invasjon i forskjellige biologiske systemer. Dataene er vist i figur 3B og 3C. Fig 4A og 4D viser samspillet nettverk bygget i STRING etter å spørre på 32 oppregulert og 25 nedregulert proteiner som finnes i PC-1.0 celler. I tillegg, når tilliten stillingen 0.900, CAMK1-α, PIM-1og MKK7 /MAP2K7 ikke lenger var med i en oppregulert nettverk, samt MAPKAPK2, cytokeratin 8, GATA1, GRK1, ACC1, PDGFRA og Smad1 i en nedregulert nettverk. Markov (MCL) og K-Means cluster algoritmer ble deretter brukt for å analysere PPI-nettverk. Til sammenligning fikk vi en omtrentlig konsekvens av klyngen hvor MCL cutoff var 2 og K-Mean cutoff var fire i både oppregulert (fig 4B og 4C) og nedregulert (Fig 4E og 4F) PPI-nettverk. Proteiner med færre eller ingen interaksjon ble funnet mer mot periferien av nettverket. Videre eksperimentelle undersøkelser som kreves av disse urelaterte proteiner for å forstå deres virkelige funksjon i en PPI nettverk.
KEGG og BioCarta pathway funksjonelle kommentarer av forskjellig uttrykt oppregulert (A, C) og nedregulert (B ) proteiner (
P
-verdier 0,01, Benjamin 0,05). Berikelse score svarer til hver vei levert av DAVID merknad verktøyet vises som -log
P
-verdier. Nedregulert proteiner som var BioCarta pathway funksjonelle anmerkninger bare var anriket på apoptotisk signalering i respons til DNA-skade.
(A) En PPI-nettverk, slik som vist i den interaktive visning, generert av en STRING database å avdekke funksjonelle interaksjoner mellom opp-regulerte proteiner. Hver node representerer et protein, og hver kant representerer en interaksjon (
P
-verdier = 6.06E-12); (B) oppregulert proteiner «MCL klase algoritmer avledet ved hjelp STRING. MCL = 2; (C) oppregulert proteiner «K-Means klase algoritmer. K-Means = 4; omtrentlig samme konsekvensene av to klynger; (D) En PPI nettverk avslører funksjonelle interaksjoner mellom nedregulert proteiner (
P
verdi = 1.47E-6); (E) nedregulert proteins’MCL klase algoritmer. MCL = 2; (F) nedregulert proteiner «K-Means klase algoritmer. K-Means = 4.
Videre CentiScaPe programvare som beregner topologiske egenskaper ved hver node, ble brukt for å få en grundig forståelse av de biologiske egenskaper av PPI-nettverket, men ikke inkludert urelaterte proteiner. Oppreguleringen PPI nettverk besto av 26 noder med en midlere banelengde på 1,89. Node grad var 6,62 ± 4,18, og betweenness var 22,23 ± 35,72 (tabell 6). Med samme fremgangsmåte, fremvist vår nedregule PPI nettverk 17 noder med en midlere banelengde på 2,04. Node grad var 3,65 ± 2,47, og betweenness var 16,59 ± 29,58 (tabell 7). Proteiner med høy verdi var viktigere i nettverket, og dette antydet en sentral rolle i å opprettholde funksjonalitet og indre sammenheng i signaleringsmekanismer. I vår oppregulert PPI nettverk, hub proteiner med høy node grad og betweenness ( Means) var akt1, CTNNB1, FOS, NFkB-p65, SYK, TP53 og MYC. På den annen side, nedregulert nettverk inkludert BRCA1, LCK, akt1, og TP53 (figur 5). Spesielt akt1 og TP53 vises den høyeste poengsummen for alle beregnede centralities, noe som tyder sin sentrale regulerende rolle i oppregulert proteiner og i en nedregulert nettverk.
Alle noder som har en sentralitet verdi større eller lik terskelen er markert med en lys grå farge i nettverket visningen. (A) oppregulert proteiner; (B) nedregulert proteiner.
Deretter forskjellig uttrykt fosfoproteiner ble lastet opp på en GeneMANIA verktøy for å forutsi en co-uttrykk nettverk. Som et resultat ble 20 gener tilsatt til nettverket (figur 6, tabell 8). Et slikt samarbeid uttrykk nettverk bidrar til å forklare ulike prosesser som finnes i bukspyttkjertelen kreft cellelinjer. Generelt kan slike topologiske egenskaper ved nettverk forbedre vår forståelse av sentrale gener assosiert med invasjon.
Et nettverk av differensial gener ble generert ved hjelp GeneMANIA. Den venstre nettverk representerer oppregulert gener og riktig nettverks representerer nedregulert gener. I tillegg fem gener eksisterer i både opp- og ned-regulert nettverk (TP53, CHEK2, akt1, RPS6KB1, RAF1). Query gener er angitt med sorte prikker og co-uttrykk er angitt med rosa linjer. Grå noder indikerer spådd gener.
(Vekt ≥ 0,04).
Diskusjoner
I de senere årene har mange forskere har brukt endoskopisk ultralydveiledet bot nål aspirasjon (EUS-FNA) som en preoperativ diagnostisk metode for å redusere unødvendige kirurgiske inngrep i et forsøk på å oppnå høyere overlevelse [14,15]; imidlertid, har resultatene vært utilfredsstillende. Hvordan redusere invasjon og metastasering av kreft i bukspyttkjertelen er fortsatt en intens forskningsområde og pågående problem. Fosforylering er det viktigste og er involvert i mange cellulære prosesser (for eksempel proliferasjon, differensiering, signaltransduksjon, metabolisme, apoptose, cellulære signalering, transkripsjons- og translasjons-regulering) [16-23].
Som beskrevet i vår tidligere studie har vi etablert to bukspyttkjertelkreft cellelinjer fra en eksperimentell kreft i bukspyttkjertelen modell [5,6]. Ikke-dissosierte celler (PC-en) og dissosierte celler (PC-1.0) viser høye histologiske likheter, men varierer i sine invasive og metastatiske evner. Vi har rasjonalisert at ved anvendelse av slike cellelinjer ville minimere innvirkningen av anvendelse av celler fra forskjellige vev opprinnelse. Derfor er analysen av differensielt uttrykte phosphoproteomes i to cellelinjer (PC-1,0 og PC-1) særlig viktig for studiet av kreft i bukspyttkjertelen invasjon og metastase mekanismer.
For ytterligere å forstå forskjellige biologiske funksjoner produsert ved forskjellige fosforylering modifikasjoner av det samme proteinet i de to cellelinjer (PC-1,0 og PC-1), ble en high-throughput-fosforylering matrise teknikk som brukes i våre analyser. Matrisen har oppdaget fosforylering nivåer av proteiner på spesifikke aminosyrerester (f.eks Ser, Thr, Tyr), og gitt nøyaktig og effektiv phosphoproteome profilering av hver bukspyttkjertelkreft cellelinje. Etter data mining, har vi observert at av de 57 signatur differensial uttrykk proteiner, seks gener kodet 12 proteiner, med fosforylering skjer på forskjellige steder (dvs. NFkB-p65, P70S6K, Smad2, Chk2, p53 og akt1). Den stedsspesifikke fosforylering av proteiner som normalt resulterer i ulike biologiske funksjoner [24]. Men rollene til flere fosforyleringsseter i en enkelt proteinmolekyl ikke har vært tydelig belyst. Derfor Guo et al. brukte nanofluidic proteomikk immunoassay (NIA) for å analysere og karakterisere protein fosforylering av flere ulike områder [25]. Sammenlignet med Guo et al. Studien, våre resultater tyder på at fosforylering på Thr72 og Ser124 av akt1 har en viktigere rolle og kan være nært knyttet til kreft i bukspyttkjertelen invasjon og metastasering.
Generelt kjemokiner er små proteiner som spiller en viktig rolle i å kontrollere migrering av forskjellige celler [26]. Våre resultater viser at 10 proteiner som vi identifiserte kunne bli klassifisert som chemokiner (dvs. ITGB4, PLCG2, IRS-1, FOS, CTNNB1, PLCG1, CD227, PKD1, P53 og ACTC1), ifølge https://www.phosphosite.org [27]. Andre invasjon relaterte proteintyper var transkripsjonsfaktorer (MYC, Rb, FOS, CTNNB1, NFkB-P65, P53, BRCA1, GATA1, Smad1 og Smad2) og cytoskeletal proteiner (Lamin A, cytokeratin 8 og ACTC1).
Gjennom KEGG pathway analyser, fant vi at disse differensial uttrykk proteiner eksistert i to hovedsignalveier (ErbB og neurotrofinspesifisiteter signalveier som vist i figur 2A). Blant de endrede veien, fant vi PI3K og MAPK som hovedaktørene i ferd med cellemotilitet. I våre tidligere studier, fant vi at aktivering av EGFR-medierte MEK /ERK signalveien indusert celle invasjon i PC-en celler omvendt, EGFR-hemmer AG1478 kunne hemme over veien og redusere celle invasjon i PC-1.0 celler [28] . I denne studien, vi har oppdaget hyperfosforylering av ErbB3, ErbB4, Raf1, P90RSK, MSK1, MYC og FOS i PC-1.0 celler sammenlignet med PC-en celler, men endringer i GRB2, MEK, ERK og Elk1 ble ikke observert. Videre anvendes vi Raf1 inhibitor og FOS siRNA å studere forholdet mellom protein og invasjon. Resultatene viste at knockdown av FOS eller Raf1 vesentlig hemmet migrasjon og invasjon av PC-1.0 celler. Våre resultater, GRB2 /MEK /ERK signal ble ikke observert, kanskje skyldes metodologiske begrensninger. Våre data viser at P90RSK ble hyperfosforylert, imidlertid, Kang et al. rapportert at P90RSK2 fremmet invasjon og metastasering av menneskelig hode og hals plateepitelkarsinom (HNSCC) [29]. P90RSK kan være involvert i reguleringen av kreft i bukspyttkjertelen celle invasjon og metastasering.
Den andre signalveien (PI3K /AKT) vanligvis innebærer i celleproliferasjon og cellesyklus [30]. I våre data, testet vi flere oppstrøms regulatorer av PI3K /AKT som VEGFR1 /2/3, ErbB2 /3/4, PDGFRα, MET, EGFR, FLT3, KIT, og IGF-1R. Blant disse proteiner, ErbB3 og ErbB4 er sterkt fosforylert, i motsetning, er PDGFRα og KIT betydelig redusert. Samtidig observerte vi at IRS-1 fosforylering på Ser 636 ble markert økt, men IGF-1R ble ikke endret. Spesielt, kan IRS-1 fosforylering bli negativt regulert ved aktivering av P70S6K i PI3K /AKT /mTOR signalveien [31]. I denne studien fant vi en økning i P70S6K fosforylering på Ser371 og Thr 421, og nedgang på Ser 418 fosforylering. Derfor våre studier antydet at PDGFRα og KIT downregulation i bukspyttkjertelkreft fører til redusert p70S6K fosforylering på Ser 418, og økt IRS-1 fosforylering på Ser 636 via økt PI3K /AKT mTOR /P70S6K signalering. Hyperfosforylering av IRS-en senere mediert aktivering av PI3K /AKT veien. Funnene kan tyde på mekanismen av resistens i kreft i bukspyttkjertelen, som et resultat, bør kombinasjons kliniske studier på kreft i bukspyttkjertelen vurderes.
I sammendraget, identifisere forskjellig uttrykt phosphoproteomes, som åpenbart i vår studie, vil peke på mekanismene bak invasjonen og metastasering av kreft i bukspyttkjertelen. I fremtiden må vi betale mer oppmerksomhet til å identifisere den aktiverte phosphoproteome, særlig spesifikke aminosyreresidier. Til sammen identifisering av unormal protein fosforylering, som er relatert til invasjon og metastasering, kan tillate oss å identifisere nye biomarkører for tidlig deteksjon av kreft i bukspyttkjertelen.
Hjelpemiddel Informasjon
S1 Table. Primersekvenser og inhibitor som brukes i den analysen.
Sanntids-PCR ble utført for å analysere nivået av FOS eller IRS-1 mRNA i knockdown cellelinjer. Nivået på Raf1 knockdown ble bekreftet ved hjelp av Western blot
doi:. 10,1371 /journal.pone.0152280.s001 plakater (docx)
S2 Table. Den Phospho Explorer Antistoff Array ble skannet på en GenePix 4000 scanner
doi:. 10,1371 /journal.pone.0152280.s002 plakater (docx)
S3 Table. Uttrykket av alle proteinene i Phospho Explorer Antistoff Array ble presentert
Koordinatene og proteiner ble vist i tabellen
doi:.. 10,1371 /journal.pone.0152280.s003 plakater (XLSX)
