Abstract
ionekanaler og ion fluks styre mange aspekter av vev homeostase. Under onkogene transformasjon, kan kritiske ion kanalfunksjoner bli forstyrret, men konservert kreft bestemt ion flukser gjenstår å bli definert. Her har vi brukt tumorici-dal-protein-lipidkompleks Hamlet som en probe for å identifisere ion flukser som er involvert i tumor celledød. Vi viser at Hamlet aktiverer en ikke-selektiv kation strøm, som nådde en størrelse av 2,74 ± 0,88 nA innenfor 1,43 ± 0,13 min fra HAMLET søknad. Rapid ion flukser var avgjørende for HAMLET-indusert kreft celledød som hemmere (amilorid, bacl
2), hindrer endringer i gratis mobil Na
+ og K
+ konsentrasjoner også forhindret avgjørende skritt medfølgende karsinom celledød , inklusive endringer i morfologi, opptak, global transkripsjon og MAP kinase aktivering. Gjennom globale transkripsjonen analyse og fosforylering arrays, ble en sterk ion flux avhengig p38 MAPK respons oppdaget og hemming av p38 signal forsinket HAMLET-indusert død. Friske, differensierte celler var resistente mot Hamlet utfordring, som ble fulgt av medfødt immunitet i stedet for p38-aktivering. Resultatene foreslår, for første gang, en samlende mekanisme for igangsetting av Hamlet brede og hurtig dødelig effekt på tumorceller. Disse funnene er spesielt viktig i lys av Hamlets dokumentert terapeutisk effekt i studier på mennesker og dyremodeller. Resultatene tyder også på at HAMLET tilbyr en to-lags terapeutisk tilnærming, å drepe kreftceller og stimulerer en medfødt immunrespons i omliggende friskt vev
Citation. Storm P, Kjaer Klausen T, Trulsson M, Ho CS J, Dosnon M, Westergren T, et al. (2013) en samlende mekanisme for Cancer Cell Død gjennom Ion Channel Aktivering av HAMLET. PLoS ONE 8 (3): e58578. doi: 10,1371 /journal.pone.0058578
Redaktør: Irina V. Lebedeva, Enzo Life Sciences, Inc., USA
mottatt: 14. august 2012; Godkjent: 06.02.2013; Publisert: 07.03.2013
Copyright: © 2013 Storm et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av Sharon D. Lund fundament stipend og American Cancer Society, den svenske Kreftforeningen, det medisinske fakultet (Universitetet i Lund), den Söderberg Foundation, Segerfalk Foundation, Anna-Lisa og Sven-Erik Lundgren Foundation for medisinsk forskning , Knut og Alice Wallenberg-stiftelsen, Lund by Jubileumsfond, John og Augusta Persson Foundation for medisinsk forskning, Maggie Stephens Foundation, Gunnar Nilsson Cancer Foundation, Inga-Britt og Arne Lundberg Foundation, HJ Forssman Foundation for medisinsk forskning og Royal physiographic Society. Støtte ble også hentet fra det danske Rådet for Independent forskning (Medisinske fag). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser: HAMLET patenter er holdt av HAMLET Pharma – et kommersielt inaktive selskap.. De er beskrevet i dette manuskriptet studier ble ikke støttet av kommersielle kilder /partnerskap. Forfatterne har innlevert en patent som inneholder informasjon som er relevant for denne utredningen. Søknadsnummeret er WO 2012/069836. Forfatterne bekrefter herved at dette patentet ikke endrer forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer, som beskrevet på nettet i veiledningen for forfatterne.
Innledning
ionekanaler er en forutsetning for normal cellefunksjon. De er sterkt konservert gjennom evolusjon, og blir aktivert av en rekke signaler inkludert mekaniske krefter, spenning, pH, matriks-interaksjoner og vekstfaktor-reseptor-aktivitet [1], [2], [3], [4], [5] , [6]. Som et resultat av ionekanaler lette cellulær tilpasning til forskjellige fysiske omgivelser, ved å regulere proliferasjon og apoptose, organutvikling og homeostase. Ionekanal-aktivering har vært foreslått for å regulere aktiviteten av essensielle cellulære signalkaskader, inkludert p38-mitogenaktiverte proteinkinaser (MAPK), lite guanin trifosfat hydrolaser (GTPases), fosfatidyl-inositol-3-kinase (PI3K) -Akt vei, NFκB- og Ca
2 + -avhengige signalveier [7], [8]. Nylig har ionekanal feilregulering foreslått å også fremme ondartet transformasjon, tumorigenesis og metastasering, noe som tyder på en sentral rolle i ionekanaler for kreftutvikling. Faktisk, et bredt spekter av ionekanaler, inkludert Ca
2+, K
+, Na
+ og Cl
– kanaler, og ikke-selektive sjonskanaler, har vært innblandet i ulike aspekter av kreftutvikling (for oversikt, se [1], [9], [10], [11], [12], [13], [14], [15]).
HAMLET (human alfa-lactalbumin laget hang ikke tumorceller) er det første medlemmet av en ny familie av tumorici-dal molekyler med bemerkelsesverdige egenskaper. Dannet fra delvis utbrettet α-lactalbumin og med oljesyre som en integrert bestanddel [16], [17], ble HAMLET oppdaget av serendipity når man studerer muligheten for morsmelk for å hindre bakterier fra å binde seg til vertsceller. Tidlig
in vitro
eksperimenter viste at HAMLET viser bred anti-tumor aktivitet med en høy grad av tumor selektivitet [16], [17]. Påfølgende terapeutiske studier i pasienter og dyremodeller har bekreftet HAMLET’s tumorici-dal aktivitet og relativ selektivitet for svulstvev
in vivo
. HAMLET behandlingen utsatt tumorprogresjon og førte til økt overlevelse i et rotte glioblastom xenograft modell uten tegn på celledød i friskt hjernevev [18]. Aktuelt HAMLET administrasjon fjernet eller redusert størrelsen på huden papillomer, som vist ved hjelp av en placebo-kontrollert protokollen med en to-års oppfølging [19]. Lokal instillasjon av Hamlet i pasienter med blærekreft hurtig drepte tumorceller uten toksiske effekter på friskt vev som omgir tumoren [20] og terapeutisk effekt av Hamlet ble demonstrert i en murin modell blærekreft [21]. Nylig har peroral administrering Hamlet vist terapeutiske så vel som profylaktisk effekt mot koloncancer i APC min mus (GUT, i trykk).
følsomhet for Hamlet i det minste delvis gjenspeiler øket c-myc onkogen ekspresjon og feilregulert glykolyse i tumorceller [22], men de spesifikke membran interaksjoner som starter den hAMLET-indusert celledød prosessen er ikke definert. Cellulære responser til Hamlet er ganske hurtig i forhold til celledødsinduse som FAS-ligand eller TNF-α [23], hvilket innebærer en mer umiddelbar og generell mekanisme for Hamlet avføling på cellemembranen enn via tradisjonelle ytre apoptose-induksjon. I tidlige studier, vi har oppdaget rask Ca
2 + flukser etter tumorcelle eksponering for HAMLET [17], noe som tyder på at ionekanaler og /eller transportører kan bli aktivert. Nylig har dramatiske endringer i strukturen av kunstige, reseptor-fri membraner og plasmamembranvesiklene fra kreftceller er observert etter Hamlet utfordring [24]. Avrundede, definert vesikler endret morfologi til amorfe former, som gjenspeiler dannelsen av lange membran distensions med økt flyt. En tilsvarende reaksjon på HAMLET ble observert i plasma membran vesikler fra carcinoma celler, noe som tyder på at direkte membran effekter kan bidra til tumorici-dal effekten av HAMLET. Normale differensierte celler viste ingen tegn på membran forstyrrelse [24], noe som tyder på at membranen forstyrrelsene kan karakterisere HAMLET sensitive kreftceller.
Denne studien preget ion fluks utløst av HAMLET og undersøkt deres rolle i tumor celledød. Vi viser at HAMLET aktiverer en hel celle ikke-selektiv kation strøm, som vi karakteriserer elektrofysiologisk. Viktigere, viser vi at ion flukser er nødvendig for å initiere Hamlet-fremkalt tumor celledød og å skille tumorceller fra normale celler i denne sammenheng. Effektene av HAMLET på kreftcellen levedyktighet ble reversert av amilorid eller bacl
2, ikke-spesifikke hemmere av flere ionekanaler og transportører. Parallelt endringer i morfologi, ion flukser, global transkripsjon, ble MAPK signal og p38 MAPK avhengig svulst celledød også avskaffet. Videre responsen av normale, differensierte celler i Hamlet viste tydelige forskjeller fra den på kreftceller, definert av mønsteret av endringer i den globale transkripsjon, signalveien aktivering og overlevelse. Etableringen av et ikke-selektive, amilorid-sensitive cation kanal som avgjørende for HAMLET-indusert kreft celledød beskriver en hittil uløste mekanisme og kan representere en ny terapeutisk alternativ.
Materialer og metoder
HAMLET Produksjon
α-Lactalbumin ble renset fra human melk avfettet ved ammoniumsulfatutfelling og hydrofob interaksjonskromatografi og omdannet til Hamlet ved delvis utfolding og binding til oljesyre, slik som tidligere beskrevet [16]. I korthet ble innfødt α lactalbumin oppløst i Tris (10 mM Tris /HCl pH 8,5) og Ca
2+ ble fjernet ved tilsetning av 3,5 mM EDTA. Det delvis ufoldet protein ble applisert på en DEAE-Trisacryl M matrise pre-kondisjonert med oljesyre ved pH 8,5 (Sigma Aldrich, St. Louis, MO). Grenda kompleks ble eluert med en NaCl gradient. Dialyse ble brukt for å fjerne overskudd av salt og Hamlet ble lyofilisert og lagret ved -20 ° C. Renheten av hver Hamlet porsjonen ble bekreftet ved SDS-PAGE (Nupage, Invitrogen) og aktivitet ved å kvantifisere celledød, som beskrevet nedenfor.
human melk ble oppnådd fra individuelle givere etter tegnet informert samtykke. Hver giver var klar over at prøvene kan bli anvendt i vitenskapelig forskning. Prøvene ble avidentifisert og skritt ble tatt for å beskytte deltakernes identitet. Prosedyren ble godkjent av menneskelig etikk komité av Det medisinske fakultet, Universitetet i Lund, Lund, Sverige.
Cells
For å identifisere konserverte respons trasé som forklarer de brede tumorici-dal effektene av HAMLET [25] svulst celler ulik vev opprinnelse, onkogen repertoar, cellemembranen sammensetning, ionekanal uttrykk og vekstevnen ble brukt. T-celle-lymfom-celler (Jurkat), lungekarsinom (A549), eggstokk-karsinom (HeLa) og nyre (A498) karsinomceller (ATCC, Manassas, VA) ble dyrket i RPMI-1640 med ikke-essensielle aminosyrer (1:100 ), 1 mM natriumpyruvat, gentamicin (50 pg /ml, Gibco, Paisley, UK), og 5% (A549 og Jurkat) eller 10% (HeLa og A498) føtalt kalveserum (FCS, Gibco), henholdsvis. Helsekost, differensierte humane renale epitelceller (HRTEC) i primærkultur ble vennlig levert av professor D. Karpmans (Universitetet i Lund, Lund, Sverige) etter etisk godkjenning fra Medical Ethics Committee av Universitetet i Lund medisinske fakultet (avgjørelse nummer LU 456- 96). Disse cellene har tidligere vist seg å være motstandsdyktige mot de letale effekter av Hamlet [16]. HRTECs ble dyrket i DMEM /F12 med 15% FCS (som i [26]) Primære RPTEC-celler (humane nyreproksimaltubul epitelceller) ble anskaffet fra Lonza (Basel, Sveits) og dyrket i DMEM-F12 supplert med NEAA, natriumpyruvat , gentamicin, Glutamax og 15% FBS (Gibco).
celledød Analyser
carcinoma celler ble løsrevet fra cellekulturflasker med Versen (0,2 g EDTA i 200 ml H
2o og 800 ml PBS), vasket med PBS og resuspendert i serumfritt RPMI-1640. Celler ble sådd ut i en tetthet på 50.000 /brønn i en 24-brønners plate og tillatt å holde seg over natten i vekstmedium. HAMLET oppløst i PBS ble inkubert med celler i serumfritt medium og FCS ble tilsatt etter 1 time. Jurkat-celler i suspensjon (mer enn 80% levedyktige) ble blandet med Hamlet ved 37 ° C ved en tetthet på 10
6 /ml i serumfritt medium. Alle celledøds målinger ble utført i tre timer etter Hamlet tillegg, med mindre annet er angitt. Celledød ble kvantifisert ved trypan blå eksklusjon (Chroma Gesellschaft Schmid 0,99) og nBruk (normalisert uskalert feil) verdier nær 1 (område 0,994 til 1,008). For å utlede forskjellig uttrykte gener en lineær modell ble montert med Bioconductor limma pakken og gener med empiriske Bayes justerte p-verdier og 0,05 og log2 fold endringer en ble vurdert forskjellig uttrykt og ble funksjonelt preget bruke Database for kommentering, visualisering og integrert Discovery (DAVID,.. (Dennis et al, 2003) og oppfinnsomhet Pathway Analysis For den utvidede microarray analyse ble genuttrykk vurdert av hele genomet Illumina mikromatriser (HumanHT-12 Expression BeadChip) data ble normalisert ved hjelp av krysskorrelasjons [32. ] Gener med en Benjamini-Hochberg justerte p-verdi. . 0,05 og log2 ganger endring ≥1.2 i tumorceller og ≥2.0 i normal, differensierte celler som helst punkt ble ansett som forskjellig uttrykt Alle microarray data ble registrert i NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) database (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/geo) med tiltredelse antall GSE23772.
Western avsetninger og cytokin Kvantifisering
For vestlige blotter , 200.000 celler som ble tillatt å holde seg over natten i en 6-brønns plate, eksponert for forskjellige eksperimentelle betingelser og lysert i M-PER lyseringsbuffer (Pierce, Rockford, IL) som inneholder Complete Protease inhibitor cocktail og PhosSTOP fosfatase-inhibitor cocktail (begge fra Roche, Mannheim, Tyskland). Lysatene ble tømt ved sentrifugering, og proteinkonsentrasjoner ble målt ved bruk av DC-proteinanalyse (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) på en Tecan Infinite plateleser. Like mengder protein ble separert ved SDS-PAGE på 4-12% Bis-Tris geler (Invitrogen) og blottet på PVDF membraner (GE Healthcare). Membraner ble mettet med BSA (GAPDH), fettfri tørrmelk (fosfor-p38 MAPK, p38 MAPK, fosfor-ERK1 /2, ERK1 /2, ATF6, fosfor-eIF2α) eller lør-en og lør-2 (α-lactalbumin) og inkubert med anti-bovin α-lactalbumin (1:500, Bethyl Laboratories, Montgomery, Texas), anti-p38 MAPK, anti-fosfo (Thr180 /Tyr182) p38 MAPK, anti-ERK1 /2, anti-fosfo ( Thr202 /Tyr204) -ERK, anti-fosfor-eIF2α (Ser51) (alle 1:500-1000, Cell Signaling Technology, Danvers, MA), anti-ATF6 (1:1000, IMG-273, IMGENEX) eller anti-GAPDH (1:3000-5000, Novus Biologicals) antistoffer etterfulgt av pepperrot peroksidase-konjugert anti-kanin (1:1000, DakoCytomation, Glostrup, Danmark), anti-geit (1:1000, Sigma Aldrich) eller anti-mus (1: 40,000 til 50,000, Novus Biologicals) sekundære antistoffer for farging. Bundet antistoff ble påvist med ECL Plus Western blotting Reagens (GE Healthcare, Little Chalfont, UK) og GelDoc utstyr (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). For å kontrollere for lik belastning, ble membraner strippet med Restore Western Blot Stripping Buffer (Pierce), blokkert og reprobed med nye antistoffer. For siRNA forsøk ble like volumer av lysatene separeres ved SDS-PAGE på 4-12% Bis-Tris-geler (Invitrogen) og blottet på PVDF-membraner.
MAPK fosforylering ble analysert på en human Phospho-MAPK array ( Proteome Profiler Array, R 0,05 ble betraktet som signifikant. Feilen barer i alle grafene representerer SEM fra minst tre uavhengige biologiske replikater.
Resultater
Na
+, K
+ og Ca
2 + flukser indusert av HAMLET i tumorceller
endringer i intracellulære ion konsentrasjoner indusert av HAMLET (35 mm) i tumorceller ble preget av fluorometri (figur 1A) og sanntids confocal imaging (Figur 1B). HAMLET utløste en rask økning i [Na
+]
i i Jurkatceller forhåndslastet med Na
+ fluorophore Corona Green. Åpning av en plasmamembran K
+ transportveien i respons til Hamlet ble tatt opp i A549 lunge karsinom celler ved hjelp av FluxOR ™ assay, som overvåker tilstrømningen av thallium som en surrogatmarkør for K
+ [34]. Gitt den drivende kraft for K
+ fluks over plasmamembranen dette tilsvarer K
+ utstrømming, forutsatt at transportveien er en kanal (se diskusjon). HAMLET utløste også en rask og vedvarende økning i [Ca
2 +]
i i Fluo-4 AM forhåndslastet lunge carcinoma celler (figur 1A). I kontrast, gjorde innfødte α-lactalbumin eller oljesyre ikke indusere Na
+, K
+ eller Ca
2 + flukser (figur 1A).
(A) Estimater av den relative gratis, intracellulære konsentrasjoner av Na
+, K
+ og Ca
2 + ([Na
+]
i, [K
+]
i, og [Ca
2 +]
i, henholdsvis) ble erholdt i A549-celler (K
+ og Ca
2+) og Jurkat-celler (Na
+) ved hjelp av fluorescens-spektrometri CORONA Grønn , FluxOR og Fluo-4. Rapid ion flussmidler ble påvist, og disse effektene var Hamlet spesifikk, som α-lactalbumin, oljesyre eller PBS hadde ingen effekt. (Midler av fire eksperimenter, p. 0,05 (Students t-test ved t = 2 minutter) (B) Forskjell i HAMLET-indusert ion fluks mellom kreftceller og friske celler Ca
2 + og K
+ flukser er visualisert ved sanntid confocal avbildning av A549 lunge carcinoma celler og HRTEC sunt, differensierte nyreceller, lastet med Ca
2 + og K
+ fluorophores og behandlet med HAMLET (35 mm) for opp til 290 sekunder. Representative tall fra tre eksperimenter er vist. (C) kalsium ionofor (A23187, 1 uM) respons i A549 lunge carcinoma celler lastet med Fluo-4. Representative tall fra tre eksperimenter. (D) Inhibering av intracellulært kalsium-frigjøring fra eR reduserer Ca
2+ flukser. A549-celler ble forbehandlet med et PLC-inhibitor (10 uM, U73122), dens inaktive analoge (10 uM, U73343) eller EDTA (1 mM) i 30 minutter og behandlet med Hamlet som angitt. Midler for tre eksperimenter. (E) Amiloride (Amil, 1 mM) hemmet Na
+ og Ca
2 + flukser i A549 celler (Ca
2 +) og Jurkatceller (Na
+) indusert av HAMLET (merket som H i figuren). Bacl
2 (1 mm) hemmet Na
+, K
+ og Ca
2 + flukser. Celler ble forhåndslastet med de respektive fluorophores, forbehandlet med hemmere (30 minutter) og utfordret med HAMLET (35 mm) for inntil 5 minutter. Effekter av amilorid på K
+ flukser kunne ikke bestemmes på grunn av auto fluorescens. Ruthenium rød (RR, 30 mm) redusert Ca
2 + flukser mens tetranidrine (Tet, 10 mm) hadde ingen signifikant effekt.
[Ca
2 +]
i og K
+ ion fluks ble også visualisert ved hjelp av konfokal mikroskopi og er vist å forekomme i nesten alle celler (figur 1B). Disse raske ion fluks ble ikke observert av confocal microcopy i friske, differensierte celler i primær kultur (HRTEC). Confocal avbildning av Fluo-4 lastet celler viste en forskjell i kinetikk og omfang mellom svarene til HAMLET eller Ca
2 + A23187 (figur 1C), noe som tyder på at de fungerer ved forskjellige mekanismer. Ca
2 + -chelation med EGTA hadde liten effekt på økningen i [Ca
2 +]
i, noe som tyder på at involvering av ekstracellulært Ca
2+ var minimal (figur 1D). Men hemming av InSP3-gated ER Ca
2 + kanaler med U73122 hovedsak avskaffet økning i [Ca
2 +]
i, noe som tyder på at den stammer hovedsakelig fra intracellulære lagre (figur 1D, [35] ).
hAMLET-indusert Ion flukser er amendable til Ion Channel hemmere
Et panel av godt karakterisert ionekanal hemmere ble brukt til å undersøke nærmere hAMLET indusert ion fluks. Endringen i [Na
+]
i i Jurkatceller ble hemmet av amilorid og bacl
2, K
+ flux i lungekarsinom celler ved bacl
2 og Ca
2+ flux av amilorid og bacl
2 (figur 1E). Effekten av amilorid på K
+ fluks ble ikke testet, på grunn av autofluorescens. Den molekylære natur HAMLET-aktiverte strøm ble videre undersøkt ved bruk av bredspekt Ca
2 + kanal hemmere, Ruthenium rød og tetrandrine, og ingen av disse betydelig påvirket dagens (figur 1E).
HAMLET aktiverer en selektive Whole Cell Kasjon Current i carcinoma celler
De observerte endringene i intracellulære ion konsentrasjoner var en indikasjon på at HAMLET aktivert en ikke-selektiv ion-kanalen. Denne hypotesen ble bekreftet av helcelle patch clamp eksperimenter (figur 2). HAMLET (35 pM) aktiveres en hel cellestrømmen, som nådde en størrelse av 2,74 ± 0,88 nA innenfor 1,43 ± 0,13 min. Den nåværende oppviste en ganske lineær strøm-spenning-forhold (figur 2A, B) og en klar tidsavhengig inaktivering ved depolariserte potensialer (figur 2C). Initial strømaktivering oppviste en forsinkelse på 0,88 ± 0,13 min fra HAMLET søknad. I motsetning til dette, α-laktalbumin eller oleat, var inaktive, understreker behovet for Hamlet komplekset for å aktivere cellestrømmen (figur 2A-B). Reverse potensial (V
rev) i Cs-baserte løsninger var -5,1 ± 0,99 mV, tilsvarende den beregnede Nernst potensial 4,85 mV, mens V
rev var -8,3 ± 1,3 mV og 2.4 ± 2 mV i Na
+ og K
+ baserte løsninger, henholdsvis, noe som gir en permeabilitet forholdet mellom P
Cs (1) P
K (0,88 ± 0,1) P
Na (0,48 ± 0,03 ) (figur 2D).
