Abstract
Tykktarmskreft er en av de vanligste krefttyper, og det er behov for identifisering av prognostiske biomarkører. I denne studien proteinet er det etablert ekspresjonsprofiler for kolorektal cancer og normal tykktarmsslimhinne ved proteomforskning ved hjelp av en kombinasjon av to dimensjonal gelelektroforese med fersk frossen seksjoner av paret Dukes B kolorektal cancer og normal tykktarmsslimhinne (n = 28), gel-bildeanalyse og væskekromatografi med høy ytelse-tandem massespektrometri. Hierarkisk klyngeanalyse og hovedkomponentanalyse viste at protein expression profiler av tykktarmskreft og normal tarmslimhinne gruppert i forskjellige mønstre av proteinekspresjon. Førtifem proteiner ble identifisert som vist på minst 1,5 ganger øket ekspresjon i tykktarmskreft og identiteten til disse proteiner ble bekreftet ved væskekromatografi-tandem massespektrometri. Femten proteiner som viste økt uttrykk ble validert ved immunhistokjemi hjelp av en godt karakterisert kolorektal kreft vev microarray som inneholder 515 primære kolorektal kreft, 224 lymfeknutemetastaser og 50 normale colonic slimhinneprøver. Proteinene som viste størst grad av overekspresjon i primær kolorektal kreft sammenlignet med normal tarmslimhinnen var heat shock protein 60 (p 0,001), S100A9 (p 0,001) og translatorisk kontrollert svulst protein (p 0,001). Analyse av proteiner individuelt identifisert 14-3-3β som en prognostisk biomarkør (χ
2 = 6,218, p = 0,013, HR = 0,639, 95% KI 0,448 til 0,913). Hierarkisk klyngeanalyse identifisert forskjellige fenotyper assosiert med overlevelse og en to-protein signatur bestående av 14-3-3β og aldehyd dehydrogenase 1 ble identifisert som viser prognostisk betydning (χ
2 = 7,306, p = 0,007, HR = 0,504, 95 % KI 0,303 til 0,838) og som forble uavhengig prognostisk (p = 0,01, HR = 0,416, 95% KI 0,208 til 0,829) i en multivariat modell
Citation. O’Dwyer D, Ralton LD, O « Shea A, Murray GI (2011) De Proteomics av tykktarmskreft: Identifisering av et protein signatur knyttet til prognose. PLoS ONE 6 (11): e27718. doi: 10,1371 /journal.pone.0027718
Redaktør: Christina Lynn Addison, Ottawa Hospital Research Institute, Canada
mottatt: 08.09.2011; Godkjent: 23 oktober 2011; Publisert: 18.11.2011
Copyright: © 2011 O’Dwyer et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne forskningen ble støttet av midler fra Association for International Cancer Research (www.aicr.org.uk), NHS Grampian og The University of Aberdeen Development Trust (www.abdn.ac.uk/giving). Utviklingen av kolorektal kreft vev microarray ble støttet av den skotske Academic Health Sciences Collaboration finansiert av Chief Scientist Office of skotske myndigheter (www.cso.scot.nhs.uk/SuppScience/SAHSC.11.html). DO’D var i mottak av en lavere forskningsstipend fra The Patologisk Society (www.pathsoc.org) til å foreta en Pilgrim BSc Med Sci grad. Aberdeen Proteome Facility (www.abdn.ac.uk/ims/proteomics/) finansieres i fellesskap av bioteknologi og Biological Sciences Research Council, skotske Funding Council og University of Aberdeen. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
i den vestlige verden tykktarmskreft (CRC) er den tredje vanligste typen kreft og den nest vanligste årsaken til kreftdød [1]. Worldwide en million mennesker hvert år vil utvikle CRC og forekomsten av denne svulsten er økende [1]. De fleste tilfeller av CRC er sporadisk som følge av opphopning av somatiske genetiske avvik, og er forbundet med en rekke miljømessige risikofaktorer [1], [2]. Den resterende del av tilfellene innebære en familiær genetisk komponent. Tallrike genetiske avvik akkumuleres herunder inaktivering av adenomatøs polyposis coli tumorsuppressorgen og aktivering av onkogener slik som K-ras, delesjon av kromosom 18q og forsterkning av 20Q [1], [3]. Kumulativt disse genetiske endringene råd til tumor anti-apoptotiske, pro-angiogene og proliferativ egenskaper. Nylig er det blitt akseptert at CRC er en genetisk heterogen sykdom og to forskjellige veier for karsinogenese er identifisert. Sporadisk CRC, 85% resultater fra kromosom ustabilitet og de resterende 15% fra mikro ustabilitet [3]. I stedet for å forekommer som en lineær flertrinns prosess, er mer sannsynlig å være et resultat av det komplekse samspill mellom flere mutasjons veier kolorektal kreftutvikling. Dette kan delvis forklare den kliniske heterogenitet av denne sykdommen, og den store forskjellen sett i resultatet mellom individuelle pasienter [2]. Dette understreker den klare kravet om å ha videreutviklet metoder for å klassifisere og kategorisere tykktarmskreft ved å identifisere og validere passende biomarkører.
Molecular biomarkører kan kategoriseres ved sin evne til å hjelpe forebygging, fremme tidlig oppdagelse, etablere prognose og forutsi responsen pasient til spesifikke terapier [4], [5]. Oppdagelsen av biomarkører vil også hjelpe til med forståelsen av de biologiske mekanismer som ligger til grunn for utvikling av sykdom og progresjon. Mens genomikk inkludert Epigenomics og transcriptomics har vært innflytelsesrike i biomarkører, ikke studere gener og genuttrykk ikke nøyaktig gjenspeiler mengden protein uttrykt i cellen. I tillegg proteiner gjennomgå mange posttranslasjonelle modifikasjoner som kan påvirke deres aktivisering, interaksjoner og funksjon i en celle. Proteomikk som er den globale studie av proteiner har en nøkkelrolle i den potensielle identifisering av tumorassosierte biomarkører [6], [7]. Forholdet mellom de enkelte kreft biomarkører og tykktarmskreft har blitt grundig undersøkt og studier har inkludert biomarkører som representerer gener og proteiner som er involvert i mange aspekter av svulst utvikling og progresjon inkludert tumorinvasjon og metastasering, cellesyklusregulering, vekstfaktorer og apoptose forbundet proteiner [5] [8] -. [26]
i denne studien har vi brukt komparativ proteomikk analyse (todimensjonal gelelektroforese, bildeanalyse av gels og massespektrometri) for å identifisere proteiner som er over-uttrykt i tykktarmskreft, sammenlignet med morfologisk normal kolorektal slimhinne. Overexpressed proteiner har blitt validert av immunhistokjemi hjelp av en stor godt karakterisert sett kolorektal kreft og et protein signatur i forbindelse med prognosen identifisert.
Metoder
To dimensjonale (2D) gel elektroforese
2D gel elektroforese ble utført ved hjelp matchet par av Dypfryst Dukes «B tykktarmskreft og morfologisk normale tykktarmslimhinnen (blindtarm og stigende tykktarm, n = 15 og sigmoid colon n = 13) som tidligere beskrevet [20] – [22], [ ,,,0],27]. Alle saker ble valgt fra Aberdeen kolorektal svulst banken og clinicopathological detaljer om prøvene brukes for proteomikk, er oppført i tabell 1. Ingen av pasientene hadde fått kjemoterapi eller strålebehandling før operasjonen. Ved innsamling ble både tumor og normal tykktarmsslimhinne dissekert fra kolorektal kreft eksisjons- prøvene i løpet av 30 minutter etter kirurgisk fjerning, og umiddelbart frosset i flytende nitrogen og lagret ved -80 ° C før analyse.
Frozen seksjoner (20 um tykkelse, n = 30) av hver prøve ble skåret ut og oppløst i lyseringsbuffer [27]. En del (10 pm tykkelse) av hver prøve ble farget med hematoksylin og eosin og den morfologiske diagnose bekreftet av lys mikroskopisk undersøkelse. Etter solubulisation ble prøvene sentrifugert for å fjerne uløselige cellerester og behandlet med DNAse. 2D gel elektroforese ble utført i duplikat for hver prøve å bruke 13 cm pI3-10 ikke-lineære Immobilon strimler (GE Health Care, Little Chalfont, UK) med proteiner blir separert i henhold til ladning (300 V, 6 minutter, 3500 V, 90 min , 3500 V, 300 min), og deretter molekylvekt (100 V, 25 mA pr gel i 60 min). Etter gjennomføring av elektroforese ble gelene farget med Coomassieblå å visualisere proteiner flekker.
Gel bildebehandling og analyse
De geler ble deretter skannet for å produsere 256 grå skala 24 bits bilder som ble lagret som TIFF-filer. De fotograferte geler ble analysert ved hjelp Progenesis SameSpots programvare (ikke-lineær dynamikk, Newcastle-upon-Tyne, UK). Alle gel bildene ble importert til Progenesis SameSpots for analyse. Bilde kvalitetsvurdering ble også gjort ved hjelp av SameSpots programvare for å sikre at alle bildene var i riktig format for analyse og hadde ingen andre problemer som kan forstyrre med påfølgende bildeanalyse. Alle geler ble innledningsvis automatisk justert til en referanse under anvendelse av analyseprogramvare, deretter manuelt justert for å sikre riktig innretting av alle geler, slik at alle stedene som skal påvises, normalisert og avstemt på alle geler. Gjenstander (f.eks støvpartikler eller streker oppdaget som protein flekker) ble fjernet ved manuell redigering. Referansebilde gels ble opprettet etter gel innretting med analyse programvare. Straks de er innrettet, geler ble automatisk analysert ved anvendelse av Progenesis SameSpots programvare. Geler ble delt opp i 2 grupper som enten tumor eller normale geler. Statistisk analyse av protein-ekspresjonsnivåer ble deretter bestemt for hver flekk basert på midlere sted volum, og forskjeller i proteinekspresjon mellom tumor og normal geler ble vurdert ved ANOVA. Flekker med en p≤0.05 ble valgt for inkludering i resultatene. Multivariat analyse ble også gjort ved hjelp Progenesis SameSpots og både korrelasjonsanalyse og prinsipielle komponentanalyse ble utført på avbildes geler. Korrelasjonsanalyse ble utført på logg normalisert stikk uttrykk nivåer til gruppen ble sammen etter likheter i sine uttrykk profiler. Hovedkomponentanalyse anvendt stikk ekspresjonsnivåer på tvers av alle geler for å skille gelene i henhold til uttrykk variasjon, slik at en grafisk representasjon av multidimensjonale data gruppert i de to grupper; tumor og normal. En endelig rapport som viser alle analysert flekker på gelen sammen med ANOVA verdier, rekkene og uttrykk profiler for hver spot basert på gjennomsnittlig normalisert volum for gruppene ble deretter produsert.
væskekromatografitandem massespektrometri
ved å følge 2D-elektroforese og bildeanalyse av gelene protein flekker av interesse (de flekker som var signifikant økt i tumorprøver) ble skåret ut fra gelene og proteiner identifisert ved væskekromatografi tandem-massespektrometri.
Proteiner i gelen stykker ble fordøyd med trypsin (sekvense klasse, modifisert, Promega Storbritannia, Southampton, UK) ved hjelp av en etterforsker ProGest robot arbeidsstasjon (Genomisk Solutions Ltd., Huntingdon, UK). I korthet proteiner ble redusert med DTT (60 ° C, 20 min), S-alkylert med jodacetamid (25 ° C, 10 min) og deretter spaltet med trypsin (37 ° C, 8 timer). Den resulterende tryptisk peptid ekstrakt ble tørket ved rotasjonsfordampning (SC110 speedvac; Savant Instruments, Holbrook, New York, USA) og oppløst i 0,1% maursyre for LC-MS /MS-analyse
Peptide oppløsninger ble analysert ved hjelp av en. HCTultra PTM Discovery System (Bruker Daltonics Ltd., Coventry, UK) koblet til en endelig 3000 LC System (Dionex (UK) Ltd., Camberley, Surrey, UK). Peptider ble separert på en monolittisk kapillærkolonne (200 um innvendig diameter x 5 cm i lengde, Dionex). Elueringsmiddel A var 3% acetonitril i vann inneholdende 0,05% maursyre, elueringsmiddel B -80% acetonitril i vann inneholdende 0,04% maursyre med en gradient av 3% -45% B i løpet av 12 minutter ved en strømningshastighet på 2,5 mL /min. Peptide fragmentmassespektra ble kjøpt i dataavhengig AutoMS (2) modus med en skanning rekke 300-1500 m /z, 3 gjennomsnitt, og opptil 3 forløperionene valgt fra MS skanne 100-2200 m /z). Forløpere var aktivt ekskludert innen 1,0 min vindu, og alle enkeltvis ladde ioner ble ekskludert.
Peptide topper ble oppdaget og deconvoluted automatisk ved hjelp av dataanalyse programvare (Bruker). Masse lister i form av Mascot generiske filene ble automatisk opprettet og brukt som input for Mascot MS /MS ioner søk i NCBInr databasen ved hjelp av Matrix Science webserveren (www.matrixscience.com). Standard søkeparametere som ble brukt var: enzym = trypsin, maksimum savnet splittelser = 1; faste modifikasjoner = carbamidomethyl (C); variable modifikasjoner = oksydasjon (m); peptid toleranse ± 1,5 Da; MS /MS toleranse ± 0,5 Da; peptid kostnad = 2+ og 3+ og instrument = ESI-TRAP.
Begge to dimensjonal elektroforese og massespektrometri ble utført av University of Aberdeen Proteome anlegget (www.abdn.ac.uk/ims/proteomikk /).
Utvikling av kolorektal kreft vev microarray
En kolorektal kreft vev microarray ble konstruert med normal tykktarmsslimhinnen (n = 50), primær (n = 515) og metastatisk kolorektalcancer ( n = 224) som tidligere beskrevet [28], [29].
Alle saker ble valgt fra Aberdeen kolorektal svulst bank. Totalt ble tumorprøver fra 515 pasienter involvert i denne studien, i hvert tilfelle, hadde diagnosen primær kolorektal kreft er gjort, og pasientene hadde gjennomgått elektiv kirurgi for primær kolorektal kreft, i Aberdeen, mellom 1994 og 2007. 99 svulster var fra perioden 1994-1998, 199 svulster var 1999-2003 og 217 svulster var fra perioden 2004-2007. Ingen av pasientene hadde fått noen preoperativ kjemoterapi eller strålebehandling. Dataene for pasientene og deres svulster som inngår i denne studien er beskrevet i tilleggsinformasjon Tabell S1. Den midlere lymfeknute utbytte for alle tumorer i denne studien var 13,4 lymfeknuter pr tumor og for node negative tumorer det bety lymfeknute Utbyttet var 14,4 (lymfeknute utbytte refererer til det totale antall lymfeknuter hentet fra hver kolorektal kreft reseksjon prøven). Survival informasjon var tilgjengelig for alle pasienter og ved å sensurere pasientdata på utfallet det hadde vært 237 (46%) dødsfall (totaldødelighet). Gjennomsnittlig pasient overlevelse var 114 måneder (95% KI 105-122 måneder). Med kolorektal kreft eksisjons- prøver ble mottatt frisk, åpnet ovenfor, og når det er hensiktsmessig under svulsten, vasket i kaldt vann og deretter fiksert i 10% nøytral bufret formalin i minst 48 timer ved romtemperatur og representative blokker ble innleiret i voks. Seksjonene ble farget med hematoksylin og eosin for histopatologisk diagnose og svulstene ble rapportert i henhold til The Royal College of patologer retningslinjer som innlemme veiledning fra TNM5 av TNM staging system.
En kolorektal kreft vev microarray ble konstruert med normal tykktarm slimhinnen (n = 50), primær (n = 515) og metastatisk kolorektalcancer (n = 224). Metastasene var alt fra kreft involvert lymfeknuter i Dukes C tilfeller. Hver normal slimhinne prøve ble kjøpt fra minst 10 cm fjernt fra tumor som tidligere beskrevet [28], [29]. Alle sakene ble gjennomgått og områder av vev skal tas prøver ble først identifisert og merket på riktig haematoxylin og eosin farget lysbilde av en sakkyndig konsulent mage- og tarm patologen (GIM). To 1 mm kjerner ble tatt fra disse områdene av den tilsvarende voks innebygde blokken ved hjelp av en vev microarrayer Beecher Instruments (Sun Prairie, WI, USA) og plassert i en mottaker parafin blokk. Etter overføringen ble mottakeren rekke blokk oppvarmet til 37 ° C, og en glassplate ble brukt til å trykke forsiktig ned kjernene for å sikre at de var alle på samme nivå i mottaker voks blokken.
Immunohistochemistry
Immunhistokjemi for hvert antistoff (tabell 2) ble utført med biotin frie Dako Envision ™ -system (Dako, Ely, UK) ved anvendelse av en Dako Autostainer (Dako) som tidligere beskrevet [28], [30], [31] . Deler av vevet microarray ble avvokset i xylen, rehydrert i alkohol og et antigen gjenfinning trinn utført. Dette trinnet besto av mikrobølgeovnen seksjonene fullt nedsenket i 10 mM citratbuffer ved pH 6,0 i 20 minutter i en 800 W mikrobølgeovnen operert med full kraft. Seksjonene ble så tillatt å avkjøles til romtemperatur. Det primære antistoff passende fortynnet (tabell 2) i antistoff-fortynningsmiddel (Dako) ble påført i 60 minutter ved romtemperatur, vasket med buffer (Dako) med påfølgende blokkering av peroksidase i 5 minutter (Dako). Dette ble etterfulgt av en enkel 2-minutters-buffer wash hvoretter forhånds fortynnet peroksidase-polymer-merket geit anti-mus /kanin-sekundært antistoff (Envision ™, Dako) ble påført i 30 minutter ved romtemperatur, etterfulgt av ytterligere vasking med buffer for å fjerne ubundet antistoff. Nettsteder av peroxydaseaktivitet ble deretter vist med diaminobenzidine som kromogen søkt om tre påfølgende 5 minutters perioder. Endelig snitt ble vasket i vann, lett motfarget med hematoxylin, dehydratisert og montert. Å utelate det primære antistoff fra immunhistokjemisk fremgangsmåte og erstatte den enten med antistoffet fortynningsmiddel eller ikke-immun kaninserum som hensiktsmessig fungerte som negativ kontroll. Positive kontroller ble vev kjent for å uttrykke den enkelte protein.
Seksjonene ble evaluert av lys mikroskopisk undersøkelse og intensiteten av farging i hver kjerne vurderes uavhengig av to etterforsker (DO’D og GIM) ved hjelp av en scoring system tidligere beskrevet for vurdering av protein uttrykk i tumor mikromatriser [28] – [31]. Intensiteten i farging i hver kjerne ble scoret som negativ, svak, moderat eller sterk. Den subcellulære lokalisering (enten kjernekraft eller cytoplasma) av farging ble også vurdert. Variasjon i farging mellom kjerner i hver sak ble ikke identifisert. Eventuelle avvik i vurderingen av vev kjerner mellom de to observatører ble løst ved samtidig mikroskopisk revurdering.
Vurdering av mikro ustabilitet status
mikro ustabilitet status (MSI) ble vurdert ved immunhistokjemi hjelp antistoffer mot MLH1 og MSH2 (tabell 2) som beskrevet tidligere [30].
statistikker
Statistisk analyse av immunhistokjemisk data inkludert Mann-Whitney U test, signert Wilcoxon rank test, kine- squared test, hierarkisk klyngeanalyse, Kaplan-Meier overlevelsesanalyse, log-rank test og Cox multi-varians analyse (variabler inn som kategoriske variabler) inkludert beregning av hazard ratio og 95% konfigurasjons ble utført med PASW v18.0.2 for Windows XP ™ (SPSS UK Ltd, Woking, UK). Den log rank test ble benyttet for å bestemme overlevelses forskjeller mellom de enkelte grupper. En sannsynlighetsverdi av p≤0.05 ble ansett som signifikant. For å utforske påvirkning av ulike loddepunkter i forhold til overlevelse de immunhistokjemiske skår for hver markør ble dikotomisert. Gruppene som ble analysert var negativ versus noen positiv farging, negative og svake flekker versus moderat og sterk farging og negative, svak og moderat farging versus sterk farging. Hierarkisk klyngeanalyse ble utført med lengst nabo metoden med kvadratet Euklidsk avstand som klyngen tiltaket og klyngeanalyse ble utført uten noen transformasjon av dataene eller imputering av manglende verdier [18], [19].
etikk
prosjektet hadde godkjenning av The North of Scotland forskningsetiske komité (ref. nr. 08 /S0801 /81). Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra deltakere som har gitt ferske prøver av vev for proteomikk del av studiet. Den forskningsetisk komité frafalt kravet om skriftlig samtykke til den retrospektive vevsprøver inkludert i kolorektal kreft vev microarray.
Resultater
Proteomics
Totalt mer enn 1200 individuelle protein flekker ble løst etter separasjon av 2D-gelelektroforese og bildeanalyse i normale tarmslimhinnen og colontumorer (figur 1). Hierarkisk klyngeanalyse og prinsipp komponenter analyse viste separering av proteinene i to distinkte grupper-normal og tumor (figur 2). Studien inkluderte både nære og fjerne colontumorer og verken klynge eller prinsipielle komponentanalyse viste at det ikke var noen forskjell i protein uttrykk profiler mellom tumor og normal slimhinne i disse anatomiske steder. Proteiner som viser større enn og lik 1,5 ganger økt uttrykk i tumorprøver er oppsummert i saksdokumenter Tabell S2. Identiteten av disse proteinene ble for det meste bekreftet ved væskekromatografi-tandem massespektrometri. For hvert protein flere peptider med en høy statistisk sannsynlighet (p 0,05) av kampene til det aktuelle proteinet ble analysert for å bekrefte identitet. Detaljer om massespektrometrisk identifisering av proteiner er vist i saksdokumenter tabell S3.
Representative henvisning 2D gels av normal kolon (A) og tykktarms tumor (C). Dette er de kommenterte referanse gels opprettet av Progenesis samme stedene gel bildeanalyse programvare for analyse av individuelle gels. Antallet hver spot er tildelt av bildeanalyse programvare. For lettere visualisering av enkeltsteder representative for ikke-kommenterte 2D geler av normal kolon og kolon svulsten er vist i henholdsvis paneler B og D. Proteinene som ble validert ved immunhistokjemi har blitt identifisert i D.
Representant hierarkisk klyngeanalyse (A) og rektor komponenter analyse (B) av normale og kreft gels. Begge statistiske metoder viser at protein uttrykk profiler bestemmes av 2D gel elektroforese og gel bildeanalyse er tydelig i tumorprøver sammenlignet med normale prøver. Det nedre panel i hver figur viser de standardiserte ekspresjonsprofiler. Tallene som presenteres i figur 2 er «skjermbilder» av produksjonen av analyse av Progenesis SameSpots programvare. Både figur 2A og figur 2B viser resultatene av det samme eksperiment med ett tilfelle (det vil si ett par av normale geler N1 og N2 og ett par av tumor geler T1 og T2). Det nedre panel i hver del av figuren viser den standardiserte ekspresjonsprofilen og representerer proteiner av forskjellig uttrykk plottet vertikalt med linjer «kobler til» de tilsvarende proteiner i hver gel. De fargede flekker representerer interaktive flekker er lagt inn av programvaren for brukeren å få tilgang Hvert datasett og er plassert vilkårlig av programvaren på skjermen.
Immunohistochemistry
Femten proteiner ble valgt for immunhistokjemisk validering. Kriteriene for utvelgelse av proteinene følger graden av overekspresjon i kolorektal cancer, utelukkelse av kjente strukturelt f.eks aktin og serumproteiner e.g.haemoglobin og tilgjengeligheten av egnede validerte antistoffer som var effektiv på formalinfiksert voks innleiret vev.
Alle proteinene viste tumorcellefarging og bortsett nucleophosmin (NPM1) viste cytoplasmatisk farging (figur 3). NPM1 viste utelukkende nukleær farging mens glyseraldehyd 3-fosfat dehydrogenase (GAPDH) viste både kjernekraft og cytoplasma farging og disse to sub-cellulære lokaliseringer er vurdert særskilt for dette proteinet. S100A9 viste både variable tumor cellefarging (S100A9t) og variabel stromal cellefarging (S100A9s) og disse to cellulære lokaliseringer av dette proteinet er vurdert separat. Proteinene som oftest viste sterk tumorcelle immunoreaktivitets i primære kolorektal kreft var NPM1 (99,6%), store hvelv protein (MVP, 81,1%) og prohibitin (PHB, 75,6%), mens i lymfeknutemetastase de proteiner som viste den hyppigste sterk tumorcelle-immunoreaktivitet ble NPM1 (95,8%), MVP (74,5%) og varmesjokkprotein 60 (hsp60, 63,9%) (figur 4). I normal tykktarm proteiner som viste den høyeste frekvensen av sterk epitelceller immunoreaktivitet ble NPM1 (99,6%), isocitrat dehydrogenase 1 (IDH1, 93%) og laktat-dehydrogenase B (LDHB, 82,1%) (figur 4).
Mikrofotografier av immunhistokjemiske lokalisering av enkelte proteiner i normal tykktarm, primære kolorektal kreft og lymfeknutemetastase.
Hvor ofte uttrykk som evalueres immunohistochemically enkelte proteiner i A. normal tykktarm, B, primære kolorektal kreft og C. lymfeknutemetastase
proteinene som viste størst grad av overekspresjon i primær kolorektal kreft sammenlignet med normal tarmslimhinnen var hsp60 (p 0,001)., S100A9 (p 0,001) og translatinally kontrollert svulst protein (TCTP, p 0,001, Tabell 3), mens for Dukes C kreft ingen proteiner viste økt immunoreaktivitets i lymfeknutemetastaser sammenlignet med tilsvarende primære kolorektal kreft og proteiner som viste størst nedgang i uttrykk i lymfeknute metastase ble PHB (p = 0,002), peroxiredoxin (PRDX1, p = 0,003) og hsp60 (p = 0,005, tabell 3). Forholdet mellom protein uttrykk med individuelle Dukes etapper er vist i Tabell 4 og Figur 5.
Frekvens av uttrykk for individuelle proteiner som vurderes immunohistochemically i A. Dukes A tykktarmskreft, B. Dukes B tykktarmskreft og C. Dukes C kolorektal kreft.
Sammenligninger av uttrykket av enkelte proteiner og klinisk-patologisk parametere er beskrevet i Tabell 5. Flere av proteiner viste en svært signifikant sammenheng med mikro ustabilitet status inkludert 14-3-3β (χ
2 = 22,441, p 0,001), hsp60 (χ
2 = 27,663, p 0,001) og IDH1 (χ
2 = 47,733, p 0,001) .
Survival analyse
analyse av enkeltmarkører.
forholdet mellom uttrykket av enkelte proteiner og overlevelse ble undersøkt ved hjelp av ulike cut-off punkter (negativ v positiv, negativ /svak positiv v moderat /sterk og negativ /svak /moderat v sterk), og er oppsummert i tabell 6 og figur 6. 14-3-3β ble identifisert som viser prognostisk betydning (χ
2 = 6,218, p = 0,013, hazard ratio (HR) = 0,639, 95% konfidensintervall (KI) 0,448 til 0,913) når negative tumorer ble sammenlignet med svulster som viser noen grad av 14-3-3β immunoreaktivitets (Figur 6A). Svulster som viser et fravær av 14-3-3β immunoreaktivitets var assosiert med en bedre prognose. For pasienter med 14-3-3β negative tumorer (n = 104, antall dødsfall = 36) var gjennomsnittlig overlevelse var 129 måneder (95% KI 113-145 måneder) og for pasienter med positive tumorer (n = 398, antall dødsfall = 194) var gjennomsnittlig overlevelse var 107 måneder (95% KI 98-117 måneder). Dette var prognostisk signifikant (p = 0,03, HR = 0,588, 95% KI 0,361 til 0,958) i en multivariat modell som inneholder alle variablene (Dukes stadium, EMVI, tumorlokalisering, pasientens alder, pasientens kjønn, uttrykk for individuelle proteiner). Den andre viktige variabler var Dukes stadium (p 0,001, HR = 0,491, 95% KI 0,357 til 0,714), alder (p 0,001, HR = 0,470, 95% KI 0,343 til 0,645) og ekstramural vaskulær invasjon (EMVI, p 0.001, HR = 0,467, 95% KI 0,338 til 0,644). Selv PHB uttrykk (positiv v negativ PHB immunoreaktivitets) ble også kjent for å ha en svært signifikant sammenheng med overlevelse (χ
2 = 7,883, p = 0,005, HR = 3,311, 95% KI 1,359 til 8,064) bare seks pasienter var i PHB negative gruppen (Figur 6B). Andre protein som viste en signifikant sammenheng med overlevelse ved hjelp av ulike cut off poeng var IDH1, LDHB, TCTP og MVP (tabell 6 og figur 6C-6G).
Forholdet mellom individuelle proteiner evaluert av immunhistokjemi med overlevelse med forskjellig cut-off poeng. A. 14-3-3β (positiv v negativ immunoreaktivitets), B. PHB (positiv v negativ immunoreaktivitets), C. IDH1 (negativ /svak immunoreaktivitets v moderat /strong immunoreaktivitets), D. LDHB (negativ /svak immunoreaktivitets v moderat /sterk immunoreaktivitets), E. TCTP (negativ /svak immunoreaktivitets v moderat /strong immunoreaktivitets), F. IDH1 (negativ /svak /moderat immunoreaktivitets v sterk immunoreaktivitets), G. MVP (negativ /svak /moderat immunoreaktivitets v sterk immunoreaktivitets), H . overlevelse i hver av 10 klynger identifisert ved hierarkisk klyngeanalyse (hver klynge er numerisk identifisert og tilsvarer de klyngene som er identifisert i klyngen analyse panel av figur 7), I. overlevelse i to clusters- klynge 1 og klynger 2-10 kombinert og J. to protein underskrift av 14-3-3β og ALDH1 viser at doble negative svulster har et betydelig bedre resultat.
hierarkisk klyngeanalyse og identifisering av prognostisk protein signatur.
Hierarkisk cluster-analyse ble også anvendt som en utforskende statistisk verktøy for å undersøke den generelle forholdet av markør uttrykk med resultatet, og på grunnlag av denne identifiserer et protein signatur i forbindelse med prognosen. Et utvalg av klase løsninger (antall klynger) ble undersøkt for å bestemme det optimale antall klynger som produseres grupper med forskjellige utfall. Clustering data inn ti klynger ble identifisert som den optimale antall klynger for analyse i forhold til de mest prognostisk betydning grupper (saksdokumenter Tabell S4, figur 6H og Figur 7). Disse 10 grupper ble deretter kombinert i to prognostiske grupper; en god prognose gruppe (klynge 1) og en dårlig prognose gruppe (cluster-grupper 2-10) (fig 6I). Den gode prognose gruppen (gjennomsnittlig overlevelse = 157 måneder 95% CI 135-177 måneder, n = 39, antall dødsfall = 8) hadde en signifikant bedre overlevelse (χ
2 = 8,144, p = 0,004, HR = 0,373, 95% KI 0,179 til 0,757) enn dårlig prognose gruppen (gjennomsnittlig overlevelse = 106 måneder, 95% CI 1-2-119 måneder, n = 392, antall dødsfall = 183).
Grafisk fremstilling av immunhistokjemi markør data vises i det midtre panelet. panelet til høyre viser resultatene av den hierarkiske klyngeanalyse presentert som en dendrogram med 10 individuelle klynger identifisert. panelet til venstre viser en utvidet segment av grafisk representasjon.
