Abstract
Bakgrunn
Påvisning av kritiske kreft genmutasjoner i kliniske kreftprøver kan forutsi pasientens utfall og informere behandlingstilbud; imidlertid fortsatt høy gjennomstrømming mutasjon profilering underutviklet som et diagnostisk tilnærming. Vi rapporterer gjennomføringen av en genotyping og validering algoritme som gjør det mulig robust svulst mutasjon profilering i klinisk setting.
Metodikk
Vi har utviklet og implementert en optimalisert mutasjon profileringsplattform ( «OncoMap») for å forhøre ~400 mutasjoner i 33 kjente onkogener og tumor dempere, hvorav mange er kjent for å forutsi respons eller motstand mot målrettet terapi. Ytelsen til OncoMap ble analysert ved hjelp av DNA som stammer fra både frossen og FFPE klinisk materiale i et mangfoldig sett av krefttyper. En påfølgende grundig analyse ble gjennomført på histologisk og klinisk kommenterte pediatriske hjernesvulst. Sensitiviteten og spesifisiteten av OncoMap var 93,8% og 100% i friskt frosset vev; og 89,3% og 99,4% i FFPE-avledet DNA. Vi oppdaget kjente mutasjoner i de forventede frekvensene i vanlige krefttyper, samt nye mutasjoner hos voksne og barn kreft som er egnet til å forutsi økt respons eller resistens mot eksisterende eller utviklings kreftbehandling. OncoMap profiler støtter også en ny molekylær lagdeling av pediatriske lavgradige gliomer basert på
BRAF
mutasjoner som kan ha umiddelbar klinisk effekt.
Konklusjoner
Våre resultater viser den kliniske gjennomførbarhet av høy gjennomstrømming mutasjon profilering til å spørre et stort panel av «handlings» kreft genmutasjoner. I fremtiden kan denne typen tilnærming bli innarbeidet i både kreft epidemiologiske studier og kliniske beslutningsprosesser for å spesifisere bruken av mange målrettede cytostatika
Citation. MacConaill LE, Campbell CD, Kehoe SM, Bass AJ, Hatton C, Niu L, et al. (2009) Profilering Kritiske Kreft genmutasjoner i kliniske tumorprøver. PLoS ONE 4 (11): e7887. doi: 10,1371 /journal.pone.0007887
Redaktør: Chris Jones, Institutt for kreftforskning, Storbritannia
mottatt: 25 august 2009; Godkjent: 20 oktober 2009; Publisert: 18.11.2009
Copyright: © 2009 MacConaill et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Cancer Institute (R21CA126674) til LAG, (K08CA134931) til AJB, og Dana-Farber Cancer Institute. A.J.B. ble støttet av Harvard klinisk utprøver Training Program. Midler til analyse av gastrointestinale svulster ble levert American Society of Clinical Oncology, Venner av Dana-Farber Cancer Institute og H.T. Berry Foundation. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Når det gjelder økonomiske avsløringer, er Levi Garraway konsulent for og /eller mottar sponset forskning fra Novartis, Inc. Ingen av disse forholdene utgjør en interessekonflikt for dette arbeidet. Dette endrer ikke sin tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Mange svulster inneholde kjennetegn mutasjoner i onkogener eller tumor suppressor (TS) gener som kan gi en økt mottakelighet til målrettede anticancer behandling. Veletablerte eksempler er
KIT
mutasjoner i gastrointestinal stromal tumor (GIST) som predikerer respons på imatinib eller nilotinib, og ikke-småcellet lungekreft med
EGFR
mutasjoner som er følsomme overfor erlotinib [ ,,,0],1], [2], [3]. Tilstedeværelsen av andre mutasjoner forutsier en mangel på respons på målrettet terapi. For eksempel, lunge og kolorektal kreft som havn mutasjoner i
KRAS
onkogen responderer ikke på behandling med anti
EGFR
agenter [4], og inaktivere
PTEN
mutasjoner ( eller proteintap) i glioblastom forutsi motstand mot erlotinib [5]. Dermed vil kliniske beslutninger basert på tumor genetisk informasjon i økende grad bli informert av mutasjonsstatus av flere kreftgener. Men, genererer en omfattende profil target-stand eller på annen måte «praktisk» svulst DNA mutasjoner i den kliniske arena fortsatt utfordrende.
Nyere teknologiske fremskritt gjør det mulig i prinsippet å skjerme en svulst biopsi for mange typer genomiske endringer . Men innarbeiding av slik informasjon i klinisk beslutninger krever pålitelig genomisk profilering av frossen, parafin-avledet, og arkivering svulst DNA. I denne sammenheng nukleinsyrene er ofte gjenstand for nedbrytning og /eller kjemisk modifikasjon, og tilgjengeligheten av tumorvevet kan være begrensende.
Vi har tidligere rapportert tilpasning av en high-throughput genotyping tilnærming for å forhøre nøkkel mutasjoner i et panel av 17 kjente onkogener. Vi viser nå den kliniske heten av masse-spektrometrisk cancer genmutasjon profilering for et stort panel av onkogen og TS genmutasjoner. For å oppnå dette, genererte vi en metode kalt OncoMap, som anvender et utvidet samling av 460 assays utspørrende kjente mutasjoner i 33 kreftgener. Ved hjelp av denne genomisk profilering tilnærming koblet til en analytisk mutasjon-ringer algoritme og ortogonale valideringstrinnet, identifiserte vi flere mutasjoner stede i genomisk DNA fra både frossen og FFPE svulstvev. Videre til anvendelsen av systematisk mutasjon profilering 120 pediatrisk lavgradig astrocytom avslører en klinisk informativ molekylær lagdel ikke tidligere er ført i denne svulsttypen. Slik informasjon, dersom det ble allment tilgjengelig, kunne informere både klinisk beslutningstaking og optimal klinisk studie design for målrettet terapi.
Metoder
Pasienter og svulstvev Collection
anonymisert svulst prøver ble innhentet fra Cooperative menneskelig vev Network (CHTN), Kirurgisk onkologi Universitetet i Siena, Italia, og Dana-Farber Cancer Institute; humane glioma prøver ble innhentet fra de kliniske arkiver avdelingene i patologi ved Barnesykehuset i Boston og Brigham and Women Hospital. (Nødvendig svulst innholdet var 70%, nekrose. 10%) Institutional Review Board (IRB) Dispensasjon er oppnådd for alle prøver fra Dana-Farber /Partners Cancer Care Kontor for beskyttelse av forsøkspersoner. DNA-ekstraksjon ble utført som beskrevet i Metoder S1.
OncoMap Assay Design og genotyping
Valg av kreft genmutasjoner for analysedesign og massespektrometrisk genotyping ble utført som tidligere beskrevet [6] med modifikasjoner indikert i Methods S1. Analysen, primer og probe sekvenser er angitt i tabell S1.
Prøve Barcoding og sekvense
Grunning flankerer
KRAS
kodon 12 ble brukt til PCR-forsterke genomisk DNA fra 91 friske frossen og 93 FFPE- prøver (primer sekvenser angitt i tabell S2). PCR-amplikoner ble analysert ved hjelp av Sanger-sekvensering. Alternativt
KRAS
kodon 12 ble PCR-forsterket med strekkode primere som beskrevet i metodene S1. PCR amplikonene ble samlet og analysert (Illumina Genome Analyzer II, ett kjørefelt). Sekvens data ble analysert som beskrevet i Methods S1.
Resultater
Kjennetegn på kliniske tumorprøver
Totalt 903 kliniske vevsprøver hentet fra 12 forskjellige vev steder ble vurdert for denne studien (tabell 1). De fleste av prøvene var adenokarsinomer (n = 625) fra tumorer i bryst, lunge, prostata, og mage-tarmkanalen. En samling av GIST (n = 34) og gliomer (n = 155) ble også inkludert. Av disse ble 643 prøver hentet fra Dypfryst vev og 260 avledet fra FFPE- blokker. Estimert svulst innhold oversteg 70% i alle prøvene målt ved patologisk vurdering (se Methods).
Utførelse av Tumor Mutation Profilering Algoritme
For å lette kreft genmutasjon profilering i klinisk svulst prøver, vi utviklet OncoMap, et panel av genotyping analyser som vurderte 396 unike mutasjoner i 33 kreftgener. Den komplette mutasjon profilering algoritme (figur 1A) involvert massespektrometrisk genotyping fulgt av både automatisert kall og manuell gjennomgang for å generere en liste med kandidat mutasjoner. Disse kandidatene ble utsatt for sekundære genotyping validering (se Metoder S1). Forutsatt at alle primære profilering og analyse validerings reagenser er på plass, er 7-10 dager nødvendig for å fullføre hele OncoMap sekvensen.
A. En oversikt over OncoMap prosessen fra tumor til mutasjon profil. Se teksten for detaljer. B. Receiver operatør karakteristiske kurver (rocs) viser sensitivitet og spesifisitet for ulike cutoff verdiene på prøve score på valideringsprøvene. ROCer er plottet for Dypfryst (til venstre) og FFPE-avledet (høyre) DNA, ved hjelp av toveis
KRAS
analyser og Illumina data som en sannhet-set (se Metoder S1).
OncoMap ytelse ble vurdert etter bestemme «bakken sannhet» mutasjonsstatus på
KRAS
kodon 12 ved hjelp av en DNA-strekkoding og massivt parallell sekvensering-by-syntese strategi (se Metoder S1) brukes til 91 frosne og 93 FFPE avledede svulst DNA. Når disse dype sekvense resultatene ble sammenlignet genotyping analyser avhøre den samme
KRAS
kodon, fant vi OncoMap sensitivitet og spesifisitet til å være 93,8% og 100%, henholdsvis i DNA fra fersk /frossen vev; og 89,3% og 99,4% i FFPE-avledet DNA (figur 1B). I motsetning til følsomheten av konvensjonell Sanger-sekvensering var 83,3% for friskt frosset vev og 76,0% for FFPE-avledet DNA som bekrefter økt ytelse genotyping basert mutasjon profilering [7].
OncoMap resultatene ble evaluert mer omfattende ved å teste 215 Dypfryst tumorprøver som strekker seg over flere krefttyper hvor mutasjonsstatus for nukleotider avhørt av 52 OncoMap analysene hadde blitt etablert tidligere. Ved denne analysen oppnådd mutasjon profilering en tilsvarende høy spesifisitet på 99,8%. Assayfølsomhet var optimalt i tumorvev, hvor tumoren innholdet overskred 50% (data ikke vist). Selv om enkelte følsomhetsverdier ikke kunne fastslås for alle mutasjoner analysert, beregninger ved hjelp av enveis
KRAS
analyser (reflekterende av flertallet av OncoMap analyser) ga nesten identiske sensitivitet og spesifisitet verdier (Figur S1). Disse resultatene antydet at genotyping basert mutasjon profileringsplattform var egnet for mange kliniske applikasjoner.
«Handlings» Kreft genmutasjoner på tvers av ulike krefttyper
Av de 903 kliniske vevsprøver profilerte, 37% (n = 335) inneholdt en eller flere mutasjoner. I alt ble 417 mutasjoner identifisert, med 63 prøver stiller samtidig forekommende mutasjoner. Mens 286 mutasjoner ble funnet ved analyser avhør kjente eller kandidat onkogener, ble 131 mutasjoner observert i TS gener. Dermed OncoMap plattformen mer omfattende mutasjon informasjon enn tidligere mutasjon profilering innsats som fokuserte utelukkende på onkogene mutasjoner. Som forventet, fordelingen av mutasjoner som reflekteres mønstre tidligere observert i humane tumorer, selv om frekvensen av TS mutasjoner var lavere (reflekterende av redusert dekning av slike mutasjoner ved OncoMap). Eksempler er
PIK3CA product: (26%) og
TP53 product: (13%) mutasjoner i brystkreft;
APC product: (11%),
BRAF product: (10%),
KRAS product: (38%),
PIK3CA product: (11%) og
TP53 product: (9%) mutasjoner i tykktarmskreft, og
EGFR product: (12%),
KRAS product: (23%) og
STK11 plakater (8%) mutasjoner i lungekreft. De forventede mutasjon fordelinger ble observert i både fersk frosne og FFPE- prøver, understreker den potensielle nytten av OncoMap i klinisk setting.
Mutasjoner Prognostisering Response til målrettet terapi
Tabell 2 viser et sett med » handlekraftige «kreft genmutasjoner identifisert her. Den OncoMap plattform robust oppdaget mutasjoner som utgjør etablerte markører for respons på målrettet terapi. For eksempel
EGFR
mutasjoner som predikerer respons til erlotinib og gefitinib ble identifisert på den forventede frekvensen (12%) i ikke-småcellet lungekreft, og
KIT
mutasjoner knyttet til følsomhet for imatinib og nilotinib ble påvist i 76% av GIST. Interessant,
ErbB2
mutasjoner ble påvist i fire mage adenokarsinomer, øke muligheten for å teste et HER-2-hemmer som trastuzumab i mage kreftpasienter valgt basert på denne genetiske kriteriet [8].
Flere svulster næret mutasjoner som kan forutsi respons på investigational agenter. For eksempel ble
BRAF
V600E
mutasjoner identifisert i kolorektal (n = 16), eggstokk (n = 1), thyroid (n = 4) og endometrial (n = 1) kreft, så vel som pediatriske gangliogliomas (n = 22, se nedenfor). Svulster som bærer disse mutasjoner kan svare på en selektiv
BRAF
hemmer [6], [9]. Vi identifiserte også 96 prøver over sju forskjellige typer kreft (bryst n = 14, kolorektal n = 24, endometrial n = 15, esophageal n = 4, mage n = 34, prostata n = 3, og pediatrisk astrocytom n = 2) mutasjoner enten
PIK3CA
eller
PTEN.
Disse mutasjonene kan forventes å berike for svulster som reagerer på de PI3 kinase hemmere for tiden i utvikling.
mutasjoner Prognostisering Motstand mot målrettede terapier
Sammen med mutasjoner som økt følsomhet for målrettet terapi, OncoMap robust oppdaget mutasjoner assosiert med resistens mot flere agenter. Etablerte eksempler er
KRAS
mutasjoner i ikke-småcellet lungekreft (23%) og tykktarmskreft (38%) som gir resistens overfor erlotinib, gefitinib (lunge) eller cetuximab (colorectal) [4], [10 ], [11]. Mens 94% av
KRAS
identifiserte mutasjoner lokalisert til kodoner 12 eller 13, 6% forekom et annet sted i genet (som regel i kodon 61). Siden de fleste studier av
KRAS
-associated motstand har fokusert utelukkende på kodon 12 og 13 [3], [12], [13], OncoMap identifisert ytterligere
KRAS
mutasjoner som kan påvirke sensitiviteten til anti-EGFR behandling. OncoMap også identifisert en
HRAS
mutasjon i en lunge adenokarsinom og en
NRAS
mutasjon i et kolorektal adenokarsinom. Mutasjoner som involverer alternative RAS isoformene er sjelden i disse kreftformene; tenkes, disse kan også gi resistens mot anti-EGFR terapi.
Mutation profilering også identifisert mutasjoner som «sekundær» motstand mot målrettet terapi (f.eks motstand alleler som oppstår i løpet av målrettet terapi). I GIST svulster, hvor 31
KIT
mutasjoner ble identifisert i 25 prøver; både primær (imatinib-responsive) og sekundære (imatinib-resistente)
ble observert KIT
mutasjoner, i tråd med tidligere mutasjon profilering studier [7]. Spesielt flere
KIT
mutasjoner som involverer ekson 9 (
KIT
Y503_or F504insAY; 5 tilfeller) ble påvist hos ubehandlede GIST svulster. Disse mutasjoner er assosiert med en økt medikament krav om å frembringe en klinisk respons [14], [15]. En
PDGFRA
mutasjon (D842V) prediktiv av motstand mot imatinib [15] ble også identifisert i en GIST prøven.
akt1
E17K
mutasjon har tidligere vært rapportert i bryst, colorectal og eggstokkreft. Den OncoMap plattformen identifisert sjeldne
akt1
mutasjoner i disse tumortyper, samt enkelt
akt1
E17K
forekomster i livmor, esophageal plateepitel, mage og prostatakreft. Denne mutasjonen kan forutsi motstand mot PI3 kinase hemming (og tenkes reseptortyrosinkinasehemming hemming) i noen sammenhenger [16].
Kreft med co-forekommende «Handlings» Mutasjoner
Tilstedeværelsen av co- forekommende mutasjoner som involverer kritiske kreftgener kan endre klinisk respons på mono målrettet terapi. Her, 20 adenokarsinomer (10 kolorektal, to endometrial og 8 mage) utstilt co-forekommende
PIK3CA Hotell og
KRAS
mutasjoner. Mens sammenfallende mutasjoner i disse genene har tidligere blitt rapportert i kreft i tykktarmen [17],
PIK3CA Hotell og
KRAS
mutasjoner er vanligvis utstilt en gjensidig utelukkende mønster av forekomst i livmorkreft [18 ], [19]. En endometrial adenokarsinom med co-forekommende
FGFR2 Hotell og
PTEN
mutasjoner ble også identifisert. To svulster næret sammenfallende
BRAF Hotell og
PTEN
mutasjoner (en endometrial, en kolorektal), og en ekstra tykktarms prøven inneholdt både en
PIK3CA Hotell og en
BRAF
mutasjon. Disse svulstene kan forventes å vise motstand mot reseptor tyrosin kinase hemming.
Molecular Classification of Pediatric hjernesvulster ved Cancer Gene Mutation Profilering
Evnen til å utføre robust mutasjon profilering av kliniske og arkiv svulstvev kan fremme systematisk molekylær karakterisering av «orphan» kreftformer, inkludert noen pediatriske svulster der tilstrekkelig vev er ofte mangler. For å utforske denne hypotesen, ble OncoMap brukes til å spørre en rekke barn lavgradige gliomer (LGGs) som mutasjon spekteret er ikke fullstendig definert. Denne analysen inkluderte genomisk DNA fra 127 pediatriske og 28 voksne hjernesvulst (for sammenligning) som strekker seg over fem histologiske subtyper av Pilocytisk Astrocytom, ganglioglioma, og diffuse astrocytom.
Kandidat Prognostic eller terapeutiske mål i Pediatric hjernesvulster
Flere potensielt «handlings» kreftgener ble funnet mutert hos pediatriske LGAs. Eksempler er
PDGFRA product: (n = 1) og
PIK3CA product: (n = 2), som kan forutsi respons på eksisterende legemidler (f.eks imatinib eller nilotinibs) eller agenter i utvikling (f.eks PI3 kinase hemmere). To barn LGAs næret mutasjoner i
MYC
, et veletablert onkogen homolog av
NMYC
, som forsterkes og et tegn på dårlig prognose i pediatrisk neuroblastom [20], [21]. Dermed kan svulst mutasjon profilering avgrense pasientutvelgelse og /eller sykdom prognose hos enkelte barn hjernen kreft.
BRAF
V600E Mutasjoner er vanlig i Pediatric Gangliogliomas
Duplisering av
BRAF
locus har blitt rapportert som den vanligste avvik hos barn LGAs (66% [18]), mens aktivering av punktmutasjoner i
BRAF
oppstår sjeldnere (4-6%) [22], [23 ]. Vi identifiserte aktivere
BRAF
V600E
mutasjoner i 11% (10/88) av de pediatriske LGAs-en høyere andel enn tidligere rapportert [22], [23]. Interessant,
BRAF
V600E
mutasjon var mest utbredt innenfor ganglioglioma subtype av pediatriske LGAs (klassisk og ikke-klassiske, 8/14 svulster, p = 0,00005), som vist i fig. 2.
BRAF
V600E
mutasjoner ble ikke identifisert i noen av de voksne svulster undersøkt, selv om
TP53
mutasjoner ofte skjedde i denne innstillingen (10/28 tilfeller). Omvendt, bare 2 barn hjernesvulst næret en
TP53
mutasjon; i begge tilfeller, dette var sammenfallende med en annen mutasjon (
EGFR
og
FLNB
, henholdsvis). Disse resultatene tyder på at OncoMap kan forenkle klassifisering av lavgradige astrocytomas og andre sjeldne tumortyper basert på genetiske kriterier
Forkortelser:. PA – Pilocytisk Astrocytom, WHO grad jeg; LGG, nos – lavgradig gliom, ikke annet er spesifisert, WHO grad I eller II; GG – ganglioglioma; A2 – astrocytom, WHO grad II; HG – høyverdig glioma, WHO grad III eller IV. Parentes indikerer totalt antall prøver (i figuren) eller antall prøver med angitte mutasjon (utenfor tabellen).
Diskusjoner
Clinical Oncology er midt i overgangen fra en behandling paradigme diktert primært av anatomiske området av svulst opprinnelse til en der genetiske og /eller molekylære egenskaper spiller en avgjørende rolle i å veilede valg av terapi. Videre spredning av målrettede midler i utvikling og klinisk praksis krever samtidig gjennomføring av følges diagnostiske metoder som beriker for subpopulasjoner mest sannsynlig til å svare på et stoff. Nye diagnostiske tilnærminger er derfor nødvendig for å profilere noen svulst for sentrale genetiske mutasjoner i flere kreftgener samtidig, i motsetning til de fleste eksisterende tester som fokuserer på enkeltgener (eller proteiner).
I denne studien har vi tilpasset genotyping- basert mutasjon profilering for karakterisering av både frossen og FFPE-avledet vevsprøver som spenner over 12 krefttyper. Vi robust oppdaget kreft genmutasjoner som direkte klinisk bruk og forutsi resistens mot eksisterende midler som tyrosin kinase hemmere (f.eks
EGFR
og
KRAS
mutasjoner). Vi identifiserte også flere mutasjoner som kan lede bruken av nye midler. Til slutt, i en bestemt undersøkelse av barn lavgradig astrocytom, demonstrerte vi spesiell verdi denne plattformen kan ha for sjeldne «orphan» kreft ved å identifisere mutasjoner som kan informere molekylær klassifisering samt nye terapeutiske muligheter for barn med disse kreftformer.
Diagnostiske intervensjoner som vellykket innføre svulst mutasjon profilering til klinisk praksis må omgå flere tekniske og logistiske hindringer. Chief blant disse er å oppnå robust ytelse i prøver fra FFPE og /eller arkiv svulst materiale. Vi fant ut at OncoMap plattformen oppnådde nesten 100% spesifisitet i både fersk /frossen og FFPE-avledet tumor-DNA, noe som indikerer at falske positive mutasjons samtaler er sannsynlig å være relativt sjelden med denne tilnærmingen. Det bør imidlertid bemerkes at det å oppnå denne grad av spesifisitet er nødvendig å gjennomføre en analysesekvens hvori rå genotyping data blir underkastet automatisert basen ringer, etterfulgt av manuell vurdering av kandidat mutasjoner og validering av alle kandidater ved bruk av alternative genotyping kjemi. Dermed må klinisk implementering av OncoMap innlemme både genomisk datagenerering og bioinformatiske analytisk kompetanse i en molekylær patologi eller klinisk diagnose setting.
følsomhet OncoMap påvirkes av iboende teknologiske parametere, individuelle mutasjon analyse ytelse egenskaper, og kvalitet og renhet av tumorvev. Den 89-94% assayfølsomhet observert i denne studien er tilstrekkelig for mange translatoriske og kliniske applikasjoner; Men det er selvfølgelig tilfeller der enda høyere analyse følsomhet vil være ønskelig. Anriking av tumorceller ved hjelp av kjerne nål disseksjon eller laser-fangst mikrodisseksjon før mutasjon profilering kan tilby en avenue for å forbedre følsomheten, spesielt i svulster der stromal eller krenkende innhold, er høy. På samme tid var sensitiviteten for OncoMap vesentlig overskrider den til Sanger-sekvensering, som fortsatt gullstandarden for mange genetiske diagnostiske metoder. Videre bredden av kreftgener og spesifikke mutasjoner avhørt av OncoMap-støttet av de nevnte strenge sensitivitet og spesifisitet bestemmelser-vesentlig høyere enn for eksisterende kommersielle massespektrometrisk baserte genomisk profilering tilnærminger [24].
genomisk guidede terapi kan spille en spesielt fremtredende rolle i sjeldne svulster der store randomiserte studier er ofte upraktisk. For å teste evnen til OncoMap å identifisere uvanlige og /eller prøvebegrenset svulster som kan ha nytte av spesifikke klasser av terapeutiske midler, profilert vi et panel av pediatriske lavgradige gliomer for vanlige kreft genmutasjoner. Kunnskap om genetiske avvik stede i pediatriske LGAs er begrenset, men nyere studier har identifisert
BRAF
trans, kromosom duplikasjoner, og sporadiske grunn mutasjoner i lavgradig astrocytom [18], [25], samt diverse mekanismer for aktivering av ERK /MAPK veien i Pilocytisk astrocytom [23]. Disse funnene tyder på at lite molekyl hemmere av
BRAF
allerede i voksenutprøvingene kan også representere lovende terapi for undergrupper av disse svulstene. Våre resultater tyder på at hyppigheten av
BRAF
punktmutasjoner i pediatriske LGAs som helhet kan bli høyere enn tidligere rapportert, og spesielt at gangliogliomas har
BRAF
V600E mutasjoner ved svært høy frekvens . Denne observasjonen kan også hjelpe til diagnostisk identifikasjon av disse tumorer. Gangliogliomas, som pleier å være lat svulster kan derfor dele noen egenskaper med kutant nevi, hvis melanocyte forløpere også stammer fra nervesystemet (neural crest), stille lat vekst, og hvor
BRAF
V600E mutasjon er også svært utbredt. Vi har også identifisert flere mutasjoner som ikke tidligere er rapportert i pediatrisk astrocytom, hvorav noen (
EGFR
,
PIK3CA
,
PDGFRA
) representerer potensielt handlekraftige mål. I samsvar med tidligere rapporter [22], [26], [27] ser vi at mutasjoner i genene ofte observert hos voksne anaplastiske astrocytomas og /eller glioblastomas, for eksempel
TP53
eller
PTEN
er det bare sjelden hos barn pilocytic og lav grad av diffuse astrocytomas.
Selv om våre funn støtter den kliniske muligheten for høy gjennomstrømming svulst mutasjon profilering, innser vi at massespektrometrisk genotyping tilnærmingen har visse begrensninger som kan utelukke gjennomføringen som en definitiv kreftdiagnostikk plattform. Disse inkluderer den endelig antall spesifikke punktmutasjoner som kan analyseres (betegnet
a priori
innenfor et delsett av kreftgener), vanskeligheter med å utforme genotyping analyser som identifiserer små innskudd eller delesjoner ( «in-dels») større enn ~50bp i størrelse, til en manglende evne til å oppdage de fleste TS genmutasjoner (som kan oppstå hvor som helst i genet, ikke bare «hotspot» regioner) eller ekstra genomiske forandringer som høyt nivå genet presiseringer eller slettinger som også kan påvirke viktige kreftgener og noe arbeidskrevende natur manuell vurdering og ortogonale analyse validering. På lang sikt kan tilpasning av nye genomikk teknologier som andre generasjons sekvense tilbyr en samlende tilnærming til omfattende tumor mutasjon profilering. Imidlertid kan OncoMap plattformen tilbyr en umiddelbar vei som systematisk mutasjon profilering kan settes i gang for å lede klinisk studie design, samt bruk av eksisterende målrettede midler på tvers av mange krefttyper.
I sammendraget, denne studien representerer den første stor-skala anvendelse av OncoMap plattform for tumor mutasjon profilering i den kliniske og arkiv setting. Disse resultatene derfor live opp et rammeverk hvor systematisk svulst profilering kan fremstå som et allment mulig middel for å veilede pasienten stratifisering for rasjonell legemiddel. Til tross for den iboende kompleksitet av kreft, som omfatter den økende kunnskap om den molekylære basis for kreft i både store molekylære epidemiologiske studier og til slutt må den kliniske beslutningstaking til slutt fortankomsten av mer effektive anticancer terapi.
Støtte informasjon
Metoder S1.
Profilering kritiske kreft genmutasjoner i kliniske kreftprøver
doi:. 10,1371 /journal.pone.0007887.s001 plakater (0,07 MB DOC)
Tabell S1.
OncoMap tre kjerne PCR primer og utvidelse probe sekvenser
doi:. 10,1371 /journal.pone.0007887.s002 plakater (0,13 MB XLS)
Tabell S2.
KRAS
G12 PCR primer sekvenser som brukes til å generere amplikonene for Sanger og Illumina sekvense
doi:. 10,1371 /journal.pone.0007887.s003 plakater (0,03 MB XLS)
Figur S1.
Utførelse av OncoMap i Dypfryst og FFPE-avledet DNA. Mottaker operatør karakteristiske kurver (rocs) er plottet for Dypfryst (venstre panel) og FFPE-avledet (høyre panel) DNA, mot ensrettede OncoMap KRAS analyser ved hjelp av Illumina data som en sannhet-sett (se Metoder S1).
Doi : 10,1371 /journal.pone.0007887.s004 plakater (0,06 MB PPT)
takk
Vi takker Nicholas Wyhs, Benjamin Ebert og Sewit Tekki for teknisk kompetanse; Suely Marie for å gi karsinom prøver. Sanger-sekvensering ble gjennomført ved Agencourt Bioscience Corporation, Illumina sekvensering ved kofaktor Genomics.
