Abstract
Bakgrunn
Diclofenac er en av de eldste anti-inflammatoriske legemidler i bruk. I tillegg til inhibering av cyklo-oksygenaser (COX), diklofenak en potent hemmer av fosfolipase A
2 (PLA
2), for således å gi et bredt anti-inflammatorisk effekt. Siden betennelse er en viktig faktor i utviklingen av pankreastumorer vi utforsket potensialet av diklofenak å hemme tumorvekst i mus inokulert med PANCO2 celler orthotopically.
metodikk /hovedfunnene
Vi fant at diklofenak behandling (30 mg /kg /kroppsvekt i 11 dager) hos mus inokulert med PANC02 celler, reduserte tumorvekten med 60% sammenfaller med økt apoptose av tumorceller. Siden denne effekten ikke ble observert
in vitro
på dyrkede PANCO2 celler, antar vi at diklofenak fordelaktig behandling involvert andre meklere som finnes i
vivo
. Faktisk, diklofenak drastisk redusert tumor vaskularisering av downregulating VEGF i tumoren og i bukhulen væske. Videre diklofenak direkte hemmet vaskulær spirende
ex vivo
. Overraskende, i motsetning til andre COX-2-hemmere, diklofenak øket arginase aktivitet /arginase en proteininnholdet i tumor stromaceller, peritoneale makrofager og hvite blodceller ved 2,4, 4,8 og 2 ganger i henholdsvis. Vi foreslår at den etterfølgende arginin uttømming og reduksjon i NO nivåer, både i serum og bukhulen, legger til tumorvekstinhibitering av underernæring og dårlig blodkar utvikling.
Konklusjon /Betydning
I konklusjonen, diklofenak viser uttalt antitumoregenskaper i kreft i bukspyttkjertelen modell som kan bidra til videre behandling utvikling. Muligheten av diklofenak å indusere arginase aktivitet i tumor stroma, bukhinnemakrofager og hvite blodlegemer gir et verktøy for å studere en kontroversiell sak av pro-og antitumor effekten av arginin uttømming
Citation. Mayorek N, Naftali-Shani N, Grunewald M (2010) Diclofenac hemmer tumorvekst i en murine modell av bukspyttkjertelkreft ved Modulation av VEGF Levels og Arginase aktivitet. PLoS ONE 5 (9): e12715. doi: 10,1371 /journal.pone.0012715
Redaktør: Irene Oi Lin Ng, The University of Hong Kong, Hong Kong
mottatt: 31 januar 2010; Godkjent: 06.08.2010; Publisert: 15.09.2010
Copyright: © 2010 Mayorek et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av det hebraiske universitetet-Hadassah Medical School (tilskuddet # 0463435). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Betennelse er svært knyttet til både kreftutvikling og progresjon av tumorvekst [1]. Epidemiologiske studier viser at kronisk betennelse predisponerer pasienter til kreftutvikling og langsiktig bruk av ikke-steroide antiinflammatoriske midler (NSAIDs) reduserer risikoen for flere kreftformer [2] Hotell
cyklo (COX-1 og. – 2) er hastighetsbegrensende enzymer i produksjonen av prostaglandiner (PG-er) fra arachidonsyre.
COX-1-ekspresjon er vanligvis konstitutivt, mens COX-2 er vanligvis indusert av stimuli som er involvert i inflammatoriske responser. Prostaglandin E2 (PGE2), en primær metabolitt av COX-2, er blitt vist å fremme celleoverlevelse, proliferasjon og angiogenese og hemme apoptose og antitumor immunrespons, alle prosesser som fremmer utviklingen av kreft [3].
Pankreas kreft er en dødelig sykdom med svært begrensede muligheter for behandling. Kronisk pankreatitt predisponerer personer for å utvikle pankreatisk duktus adenokarsinom [4] og pankreatisk tumor stroma er karakterisert ved forskjellige inflammatoriske celler [5] foreslå involvering av inflammatoriske prosesser i dette kreft. COX-2 er overuttrykt i ca 75% av menneske karsinomer inkludert de i bukspyttkjertelen. Nyere studier i transgene mus [6], [7], [8] har vist at COX-2 overekspresjon i eksokrine pankreas indusert pankreatitt-like-tilstand. Utbruddet av kreft i disse musene ble forhindret ved å opprettholde mus på selektive COX-2-hemmere, ytterligere demonstrere den viktige rollen betennelse på kreft i bukspyttkjertelen utvikling.
Forsøk på mennesker for å forebygge tykktarmskreft ble nylig utført ved bruk av COX 2-hemmere. Til tross for oppmuntrende resultater i tykktarm kreft forebygging og reduksjon i forekomsten av kolon adenomer, NSAIDs og selektive COX-2-hemmere kan forårsake alvorlige hjerte- og gastrointestinale bivirkninger, og derfor er ikke rutinemessig anbefalt for disse sykdommene [9], [10].
Diclofenac, en av de eldste NSAIDs har vært i bruk siden 1976. Diclofenac hemmer cyklo ikke-selektivt. Studier på mennesker viste at det reduserer 94% av COX-2 og 49% av COX-1-aktivitet [11]. In vitro det en potent hemmer av fosfolipase A2 (PLA2) [12], det enzym som frigjør arakidonsyre og lysophospholipid for å generere en familie av proinflammatoriske eicosanoider (inklusive PGE2) og blodplateaktiverende faktor. Ytterligere bevis tyder på at diklofenak også hemmer PLA2 i
vivo
. PLA2 antas å spille en nøkkelrolle i de første trinnene av den inflammatoriske kaskade som fører til akutt pankreatitt [12]. Den første studien [13], etterfulgt av flere andre grupper, har vist at diklofenak kan betydelig redusere frekvensen av akutt pankreatitt forårsaket av ercp.
I lys av diklofenak evne til å hemme potente både COX-2 og PLA2 vi har utforsket sin anticancer potensial i en musemodell av kreft i bukspyttkjertelen. Her rapporterer vi at diklofenak behandling fører til en 60% reduksjon i tumorstørrelse. Dette er på grunn av økt apoptose av tumorceller. Vi gir bevis for at denne effekten er indirekte og opererer gjennom minst to mekanismer. Først, diklofenak gir en signifikant anti-angiogen virkning, som vist ved en kraftig reduksjon i vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) tumor innhold, redusert mikrovaskulær tetthet og morfologiske endringer i tumorblodkarene. For det andre, diklofenak behandling øker bemerkelsesverdig arginase aktivitet i tumorceller, stromaceller peritoneale makrofager og hvite blodceller. Dette er et uventet funn siden COX-2-hemmere ble vist å redusere tumorvekst gjennom arginase hemming [14], [15] Resultatene er i tråd med tidligere undersøkelser som peker på antitumor [16] og antiangiogen effekt [17] arginin utarming og støtte ganske kontroversiell tilnærming av kreft behandling ved å styrke arginase aktivitet [18], [19].
Metoder
Etikk uttalelse
Eksperimentelle dyre prosedyrene ble godkjent av etisk komité det hebraiske universitetet, som fungerer under overvåkning av AAALAC International.
Dyr og PANCO2 cellelinje
Kvinne CB6F1 mus (9-10 uker gamle) og Sprague-Dawley rotter (200 g) var fra Harlan, Israel. Kvinnelige CX3CR1
GFP /+ mus [20] ble sjenerøst gitt av S. Jung (Rehovot, Israel). I disse musene en GFP rapportør drives av CX3CR1 promoter. Aktivitet av denne kjemokinreseptor promoter er begrenset til mononukleære myeloidceller, inkludert alle sirkulerende CD116
+ monocytter, og er i det vesentlige fraværende fra celler av lymfoid avstamning. Alle eksperimenter unntatt forsøket presentert i figur S3 ble utført ved anvendelse av CB6F1 mus.
PANC02 celler var en generøs gave fra M Dauer (Munchen, Tyskland). Celler ble holdt i RPMI med 10% føtalt bovint serum (FBS), 2 mM L-glutamin, 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin.
ortotopisk-syngenisk modell av kreft i bukspyttkjertelen
Mus ble anestetisert med en blanding av ketamin-xylazin. Bukspyttkjertelen ble injisert med 4 x 10
5 (CB6F1 mus) eller 6 x 10
5 (CX3CR1
GFP /+ mus) PANC02 celler i 30 ul fosfatbufret saltvann (PBS). Mus ble fjernet fra et eksperiment hvis en peritoneal lekkasje var mistenkt. Sham opererte mus gjennomgikk den samme prosedyre og ble injisert med 30 ul PBS. Mus ble oppdelt i grupper på 6 til 8 dyr per gruppe. Den behandlede gruppen fikk 30 mg /kg kroppsvekt diklofenak i drikkevann fra dag 3 etter vaksinasjon. Dosen ble beregnet basert på anslag som en mus drikker ca 3 dl vann per dag. Musene ble avlivet 14 dager etter inokulering med mindre annet er angitt.
Blod for hvite blodlegemer (WBC) preparat, VEGF og nitrogenoksid (NO) konsentrasjonen ble tatt fra hjertet. Bukhulen ble spylt med 2 ml PBS med 0,1% bovint serumalbumin (BSA) for makrofager forberedelse, for måling av VEGF og for NO konsentrasjoner.
Peritoneal celler og bukhinnemakrofager isolasjon
Peritoneal celler ble erholdt ved sentrifugering av bukhulen i flukt. Peritoneale makrofager ble isolert fra peritoneale celler ved differensiell adhesjon til plastikk. Makrofagene ble dyrket i RPMI med 10% FBS, 2 mM L-glutamin, 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin i 20 timer. For å måle arginase aktivitet, ble cellene vasket med PBS og oppløst i 0,1% TritonX100 i vann i 30 minutter ved romtemperatur.
Tumor homogenater
Tumor homogenater ble fremstilt fra tumorprøver som ble lagret ved -80 ° C, i vann inneholdende 0,1% Triton X-100, og protease-inhibitor cocktail (Sigma P8340). Homogenatene ble sentrifugert i 30 minutter ved 13400 g og supernatantene ble anvendt for å måle aktiviteten arginase, arginase 1, glatt muskel aktin og VEGF-innhold og kaspase-3 aktivering.
benmargceller isolert
tibias og lårben av tumorbærende mus ble tatt ut og spylt med PBS. Etter sentrifugering av cellene høstes på en Ficoll-gradient ved 4000 g i 20 minutter ved romtemperatur mononukleære celler ble isolert med PE-konjugert primære antistoff anti-CD-115 og anti-PE mikroperler (Biolegends). CD-115 positive og negative celler ble analysert for arginase aktivitet.
hvite blodceller isolasjon (WBC)
WBC ble isolert ved hjelp av Ficoll tettshetsgradient (Amersham). WBC-fraksjonen ble vasket, celler ble talt, lysert i vann som inneholder 0,1% Triton X 100 og analysert for arginase en proteininnhold.
aortic ring spirende analysen
Aortaringene ble fremstilt fra thorax Aorta av Sprague-Dawley-rotter, som beskrevet [21]. Ringene ble innebygd i kollagen gel og vedlikeholdes i Bio MPM medium (Biological Industries, Israel). Behandlingen med 10 uM diklofenak startet en dag etter utsåing og varte i 5 dager. Ringene ble deretter fiksert i 4% bufret formalin, farget med 0,02% krystallfiolett i absolutt etanol. Spirende område ble evaluert ved bruk av Image Pro-programmet.
Caspase-3 aktivering
Caspase-3 aktivering ble målt i tumor homogenater ved å skille de ikke-spaltet og spaltet caspase-3 på en 20% akrylamid SDS-PAGE elektroforese gel og blotting med monoklonalt anti-caspase-3 (Cell Signaling).
VEGF og NO-innholdet
VEGF innhold ble målt i serum, i supernatanten av bukhulen flush, i tumor homogenater, PANC02 og dyrkede makrofager ved hjelp av musen VEGF Quantikine immunoassay kit (R Sigma og DNase 0,33 mg /ml; Sigma) i 45 minutter ved 37 ° C. GFP positive befolkningen ble renset ved høy hastighet celle sortering ved hjelp FACS Aria (Becton, Dickinson). Cellene ble tellet og lysert i vann inneholdende 0,1% Triton X-100 og analysert med hensyn på arginase 1 proteininnhold.
PANCO2 celler vekst
PANC02 celler ble sådd i RPMI supplert med 10% FBS, 2 mM L-glutamin, 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin. Diclofenac (10 eller 50 uM) ble tilsatt den neste dag og etter 4 dagers behandling ble cellene innhold målt ved anvendelse av en celleformering kit (Biological Industries, Israel).
Immunhistokjemi, TUNEL-farging og morfometri
Parafin deler av svulster ble farget ved hjelp av følgende primære antistoffer: rotte anti-mus F4 /80 (Serotec), monoklonalt anti arginase-en (BD Transduction Laboratories), monoklonalt anti-α-glatt muskel aktin (Sigma), monoklonale anti-Ki 67 (Neomarkers), kanin anti- fosfor-histon H3 (Cell Signaling), kanin anti-VEGF (Calbiochem) og monoklonale anti-von Willebrandt faktor (DACO). Pepperrot (HRP) konjugerte sekundære antistoffer ble brukt for kromogen deteksjon.
TUNEL flekker [23] ble utført ved hjelp av in situ celledød deteksjon kit (Roche).
Kvantifisering av immunostaning data ble utført enten ved høy effekt felt analyse telling av minst 10 områder /slide 4 forskjellige svulster i hver gruppe eller ved hjelp av bildeanalyse system (ARIOL SL-50).
Statistisk analyse
alle data ble analysert med SigmaStat programvare (Aspire software International). A Mann-Whitney-testen ble anvendt for å beregne signifikante forskjeller mellom ubehandlede og diclofenac behandlede prøver. En verdi på p≤0.05 ble akseptert som signifikant.
Prøve størrelse og antall repetisjoner er angitt i legender.
Resultater
Diclofenac hemmer tumorvekst i en orthotopic modell av kreft i bukspyttkjertelen hos mus
PANC02-celler ble injisert inn i hale i bukspyttkjertelen. Etter 4 dager kreftceller dannet små svulster på ca. 4 mm lengde. Svulster utviklet seg raskt; ved dag 8 de hadde doblet i lengde og gående spredning til peritoneal område av abdominal innsnitt utført for tumorinokulering. På dag 14, svulster som vokste på stedet av vaksinen (primære svulster), veide 300-500 mg og var svært vascularized. De metastatiske svulster i mage kutt og i milten var også fremtredende (fig 1A).
Mus ble inokulert med 4 × 10
5 PANC02 celler i halen delen av bukspyttkjertelen. På dag 3 etter inokulering (inokuleringsdagen ble betegnet som dag 1) mus ble randomisert inn i ubehandlede og diclofenac behandlede grupper (7-8 mus i hver gruppe) og diklofenak 30 mg /kg b.w behandling ble startet. På dag 14 etter inokulasjon ble musene drept og primære og metastatiske tumorer ble fjernet og veid. A, en representant fotografier av
In situ
primære (
sirkler
) og metastatiske svulster (
piler
). Setter inn viser isolerte primære svulster. B, Mean ± SE av tumorvekter av 8 ubehandlet og 7 diklofenak behandlet mus * P≤0.01. Representanten eksperiment av fire er vist.
Tre til fire uker etter vaksinasjon, bukhulen var full av blodige ascites. Tallrike metastatiske tumorer ble funnet i de peritoneale hulrom, inkludert lymfeknuter av fordøyelses spor, og musene begynte å dø. Metastatiske svulster på lever og lunger ble ikke oppdaget.
Senere forsøk ble derfor avsluttet på dag 14 etter vaksinasjon. Musene viste normal på dette trinn, og det var ikke noe tap av kroppsvekt.
Diclofenac (30 mg /kg kroppsvekt) ble gitt daglig i drikkevannet starter på dag 3 etter inokulering. Effektene ble undersøkt etter 11 dagers behandling. Som vist i figur 1B, vekten av primærtumor (vokser i bukspyttkjertelen) var signifikant lavere (60%) i diklofenak-behandlede mus sammenlignet med ubehandlede dyr. Metastatiske svulster som vokste i mage kutt også veide mindre i Diclofenac behandlet mus, i alle forsøk, men denne effekten ikke oppnå statistisk signifikans.
Diclofenac øker apoptose av tumorceller
in vivo
, men ikke
in vitro
redusert tumorvekt observert i diklofenak behandlet mus førte oss til å undersøke spredning og apoptose av kreftceller.
Svulster farget for Ki 67 (til stede under alle aktive faser av cellesyklusen: G1, S, G2, og mitose) og av fosfo-histon H3 (den spesifikke markør av mitotiske celler) viste ingen forskjell mellom ubehandlede og diclofenac-behandlede mus, fig S1
. imidlertid, som vist i figur 2, diklofenak behandling økt apoptose av 6 fold, som angitt ved TUNEL-farging av tumorer og kvantifisering (figur 2A). Denne iakttakelse ble ytterligere understøttet av en forbedret nærvær av spaltet caspase 3 i homogenater fra tumorer skåret ut fra diklofenak-behandlede mus (figur 2B).
A og B, ble mus inokulert med PANC02-celler og behandlet med diklofenak som beskrevet i Figur 1. A,
LSF
t, TUNEL flekker superpositioned løpet DAPI farging av faste svulster,
høyre
, gjennomsnitt ± SE% av tunel positive kjerner ut av DAPI farget kjerner. Om 9000 kjerner fra svulster i fire ubehandlet og 4 diklofenak behandlet mus ble talt * P≤0.001. B, Caspase-3-aktivering i tumor homogenater av 4 ubehandlet og 3 diclofenac-behandlede mus ble målt som beskrevet i Materialer og Metoder, en av to eksperimenter. C, PANC02 (3000 celler /brønn) ble sådd ut i 96-NUNC brønner. Dagen etter utsåing 10 eller 50 uM diclofenac ble tilsatt, og cellene ble inkubert i ytterligere 4 dager. Antall celler ble målt ved bruk av en Cell Proliferation Kit. Gjennomsnitt ± SE av OD av 6 brønner i hver gruppe. Ett eksperiment representant for 3.
Den forbedrede apoptose forårsaket av diklofenak
in vivo
kunne ikke rekapitulert
in vitro
. PANC02 celler dyrket i 4 dager i nærvær av 10 og 50 uM av diklofenak vokste på samme hastighet som ubehandlede celler (figur 2C) som indikerer at
in vivo
effekter av diklofenak kreve noen mediatorer som er fraværende i
in vitro
system.
Antiangiogen effekten av diklofenak
in vivo Hotell og
ex vivo
Svulster fra diklofenak behandlede dyrene var veldig blek (fig 1 A), noe som tyder på at behandlingen forårsaket en antiangiogen effekt. Faktisk, som vist i figur 3A og B, farging for vaskulær endotelial markør von Willebrand faktor og telling av blodårer avslørte en fire gangers nedgang i antall store perifere kar og en to gangers fall i kapillær tetthet i tumorer av diklofenak-behandlede mus. Videre glatt muskel aktin-farging (figur 3C) avslørte tynne, rette fartøy i behandlede tumorer sammenlignet med mange, store, buktede blodkar fra svulster i ubehandlede mus. Analyse av glatt muskulatur aktin-ekspresjon i tumor homogenater ved Western blot viste en signifikant reduksjon (2,5 ganger) i diklofenak-behandlede mus (figur 3D og E).
A-F, mus ble inokulert med PANC02-celler og behandlet med diklofenak som beskrevet i figur 1. A-D, fører diklofenak behandling morfologiske endringer i tumorblodkarene. A, Von Willebrands farging av store perifere kar (
øverst) Hotell og kapillærer (
nederst
). B, Mean ± SE av stor perifer fartøy /slide. telte rundt periferien av hvert lysbilde (
toppen
) og gjennomsnitt ± SE av kapillærer /område telles i 10 forskjellige sentrale deler av svulster i henhold X40 forstørrelse (
nederst
). Fartøy telle ble evaluert i svulster 4 ubehandlet og 4 Diclofenac behandlet mus, * P≤0.01. C, glatt muskulatur aktin farging avdekket svært tynne blodkar vegger i diklofenak behandlet mus. D og E, glatt muskel aktin proteininnholdet i tumor homogenater (50 ug protein per lastet kjørefelt) av 4 ubehandlet og 3 diklofenak-behandlede mus, målt som beskrevet i materialer og metoder, gjennomsnitt ± SE av vilkårlig enheter /kjørefelt, * P≤0.01. F, reduserer Diclofenac VEGF innhold av tumoren og bukhulen, men ikke serumet. VEGF nivåene ble målt som beskrevet i materialer og metoder i svulst homogenates-pg /mg protein (
toppen
), i bukhulen-pg /mus (
senter
) og i serum -pg /ml (
nederst
). Resultatene er gjennomsnitt ± SE av fire til seks mus pr gruppe. *, ** Og # signifikant forskjellig fra ubehandlet, tumorbærende mus P≤0.02. Lignende resultater ble oppnådd i to uavhengige eksperimenter. G hemmer Diclofenac vaskulær spirende.
ex vivo
hemmende effekt av diklofenak på spirende ble målt i rotte Aortaringene dyrket i fravær eller tilstedeværelse av 10 mikrometer diklofenak i 5 dager som beskrevet i materialer og metoder. Resultatene er gjennomsnitt ± SE av spire område på 5 ringer i hver gruppe målt ved hjelp av Image Pro program. * Signifikant forskjellig fra ubehandlet gruppe P≤0.01 Fotografier av representative ringer fra ubehandlet (
venstre
) og diklofenak (
høyre
) behandlede grupper er inkludert. Lignende resultater ble oppnådd i 4 uavhengige eksperimenter.
VEGF har vist seg å være den viktigste faktor proangiogenic i tumorer [24]. Derfor har vi målt tumor VEGF nivåer av diklofenak behandlede og ubehandlede mus (figur 3F). Behandlede mus svulster inneholdt 3 ganger mindre VEGF sammenlignet med svulster fra ubehandlede mus, noe som tyder på at nedgangen i tumorvaskulatur resultater fra en nedregulering av VEGF (Fig 3F,
toppen
). Ettersom tumorceller raskt spre seg inn i bukhulen, vi neste målt VEGF-innholdet i peritoneal væske. Den nedspylbare Mengden av VEGF fra bukhulen til tumor- bærende mus var 13 ganger høyere enn skinn-opererte friske mus. Dette beløpet ble redusert med 2,8 ganger etter diklofenak behandling (Fig 3F,
senter
).
Disse utslagene på VEGF innhold, både i bukhulen og i svulstvev, ble ikke gjenspeiles i endringer i VEGF serumkonsentrasjon (fig 3F,
nederst
). Dermed serum VEGF konsentrasjonene var lik i serum av sunn-humbug opererte mus, i tumor- bærende mus og i tumorbærende mus behandlet med diklofenak.
For å avgjøre om diklofenak kan direkte hemme angiogenese, målte vi spirende angiogenese av rotte Aortaringene
ex vivo
respons på behandling. Som vist på figur 3G, ble spirende område inhibert ved 2,5 fold, når aortaringer ble inkubert med 10 pM av diklofenak (Cmax av diklofenak-behandlede pasienter), hvilket viser at diklofenak kan direkte inhibere blodkarutvikling.
Diclofenac øker arginase aktivitet i pankreatiske tumorer og i peritoneale makrofager, men ikke i benmarg-CD 115 CD-positive og negative celler 115
et av resultatene av COX-2 overekspresjon av tumorceller er en stor produksjon av PGE2 noe som fører til en svekket T-cellerespons [14] [25]. PGE2 induserer arginase en aktivitet og arginin opptak i myeloide avledet suppressor celler (MDSCs), og dermed forårsaker arginin uttømming i svulsten rundt. Den relative mangelen på arginin fører til en defekt i CD3ζ ekspresjon av tumor-infiltrerende T-celler. Siden COX-2-hemmere ble vist å delvis stanse tumorvekst gjennom arginase hemming i MDSC [14], [25] vi målt arginase aktivitet i bukspyttkjertelen tumor homogenates fra ikke-behandlede og diklofenak behandlet mus (fig 4A,
toppen
).
A-C, alle mus med unntak av de som er angitt ble inokulert med tumorer på dag 1 og drept på dag 14. En, arginase aktivitet ble målt som beskrevet i materialer og metoder i tumorhomogenat
( øverst)
, i makrofager isolert av bukhulen flush og dyrket i 20 timer (
senter)
, og i nylig isolerte peritoneal celler (
nederst)
. Mus ble behandlet med diklofenak 30 mg /kg i 11 dager (
topp og midt
) eller 2 dager før slutten av forsøket (
nederst
). Resultatene er gjennomsnitt ± SE av arginase aktivitet i tumor homogenater av 6-7 mus i hver gruppe (
øverst
) eller i Triton X-100 oppløste celler erholdt fra 3-7 mus ved peritoneal vasking og målt i quadruplicates (
senter og bunn
). Hvert eksperiment ble gjentatt minst 3 ganger, og resultatene fra representative forsøk er vist. * Signifikant forskjellig fra ubehandlet gruppe P≤0.01. # Signifikant forskjellig fra ubehandlet gruppe av tumor- fritt mus. B, arginase-en farging av tumorer. Fiksert svulster ble farget for arginase en som beskrevet i materialer og metoder. Fotografier av delene ble tatt under X 10
(øverst)
eller X 40 (
nederst
) forstørrelse. C, Identifiseringen av to separate populasjoner av celler i tumor (diclofenac-behandlet) stroma: F4-80 positive og arginase positive celler. De seriesnitt ble farget for F4 /80
(venstre
) og for arginase 1,
(høyre)
. De samme områder ble identifisert og sammenlignet med hensyn på tilstedeværelsen av begge markører. Fotografier av delene ble tatt under X 20 forstørrelse. Ett eksperiment, er representative for 2. D, betyr Diclofenac ikke induserer arginase aktivitet når de ble inkubert med makrofager i cellekultur. Peritoneale makrofager ble isolert fra tumor-frie mus som beskrevet i Materialer og Metoder, og inkubert i 48 timer med 10 eller 30 uM diklofenak, etterfulgt av arginase måling. Gjennomsnitt ± SE av arginase aktivitet av 3 brønner i hver gruppe. Ett eksperiment, representant for 3.
Til vår overraskelse arginase aktivitet ikke ble hemmet av diklofenak behandling, men heller ble betydelig aktivert 2,4 ganger.
Immuno-histologisk farging viste arginase 1 positive celler i periferien av svulster i både ubehandlet og diclofenac-behandlede mus (figur 4b). Antallet arginase en uttrykkende celler og deres fargeintensitet så ut til å øke i henhold til diklofenak behandling. En betydelig, 1,8 gangers økning i arginase en proteininnhold i tumorer av diklofenak-behandlede mus ble også målt ved hjelp av western blot-analyse av tumor homogenater (fig S2). Ved hjelp av et antistoff mot makrofag markør F4 /80 (Fig 4C) kunne vi ikke påvise noen overlapping med arginase en farging.
For ytterligere å karakterisere arginase en uttrykker celler i PANC02 svulster, vi inokulert PANC02 celler inn transgene mus der en GFP reporter blir drevet av CX3CR1 arrangøren. Aktivitet av denne kjemokinreseptor promoter er begrenset til mononukleære myeloidceller, inkludert alle sirkulerende CD116
+ monocytter, og er i det vesentlige fraværende fra celler av lymfoid avstamning. Vi isolerte GFP-positive celler fra svulster og funnet at disse cellene uttrykker høye nivåer av arginase 1 (fig S3).
Således er den økte aktiviteten av arginase funnet i tumorer fra behandlede mus diclofenac skyldes i det minste delvis aktivering av arginase 1 i monocytter utledet CX3CR1
+ celler. Arginase aktivitet var fraværende i kultivert PANC02 (resultater ikke vist) og arginase en protein ble aldri påvist i tumorceller
in vivo
av immunfarging.
Den slående effekt av diklofenak behandling på arginase aktivitet i bukspyttkjertelen svulster ledet oss til å undersøke arginase aktivitet i bukhinnemakrofager. Peritonealmakrofager kan være involvert i tumor overvåking [26] og viser en forbedret arginase ekspresjon i tumorbærende mus [27]. Makrofager fra peritoneal lavage ble isolert ved fortrinnsrett tilknytning til kultur retter og dyrket over natten. Immunfarging viste at de var i begge F4 /80 positive og arginase 1-positive (resultater ikke vist). Arginase aktivitet ble oppregulert (4,8 ganger) i makrofager som stammer fra tumor- bærende mus behandlet med diklofenak i 11 dager, sammenlignet med ubehandlede mus (figur 4A
sentrum
).
Siden makrofag arginase uttrykket kan endre seg i takt til kultur fatet vedheft [28] vi målte også arginase aktivitet i ikke-dyrkede nylig isolerte celler fra mus bukhulen, og dermed går på bekostning av makrofager renhet, (fig 4A
nederst)
.
Diclofenac effektivt stimulerte arginase aktivitet i ikke-dyrkede celler avledet fra både tumor-frie og tumorbærende mus behandlet med diklofenak i 2 dager bare ved 7 og tre ganger i henholdsvis. Tumor tilstede arginase aktivitet ved 4-fold økning av aktiviteten fra 0,03 (celler fra ikke-tumorbærende mus) til 0,12 mg urea /min /mg protein (celler fra tumor-bærende mus) som er på linje med tidligere rapporterte resultater [27] .
Vi har også telles antall peritoneal celler hentet fra hver mus og funnet ut at en 2 dagers diklofenak behandling ga en tre ganger økning i celler fra kreftfrie mus. Det gjennomsnittlige antall celler ± SE var 0,6 x 10
6 ± 0,06 x 10
6 ekstrahert fra ubehandlede mus og 1,5 x 10
6 ± 0,4 x 10
6 fra diklofenak-behandlede mus (p≤ 0,02, 7 mus i hver gruppe).
Denne observasjonen viser at etter en kort diklofenak behandling, er den totale arginase aktivitet i peritoneale celler (for det meste makrofager) er ekstremt høy, både på grunn av den store økningen i en spesifikk aktivitet av dette enzymet, og på grunn av økningen i antallet av aktiverte celler.
aktiveringen av arginase aktivitet av diklofenak kunne ikke påvises
in vitro
. Inkubasjon av peritoneale makrofager i 48 timer (figur 4D) økte ikke arginase aktivitet, men snarere ga en viss reduksjon i den spesifikke aktivitet av dette enzymet. De samme resultatene ble oppnådd når makrofager ble inkubert i 96 timer med diclofenac (resultater ikke vist). Således, på samme måte som virkningen av diklofenak på apoptose av tumorceller, mediatorer er tilstede
in vivo
og fraværende i dyrkede makrofager var nødvendig for å oppnå den induksjon av arginase aktivitet av dette stoffet.
Vi undersøkte også om arginase aktivering av diklofenak kan påvises i benmargsmakro forløpere. Vi isolerte mononukleære celler fra tibias og lårben fra tumor-bærende mus ubehandlet og behandlet i 11 dager med diklofenak. Vi fant svært lav arginase aktivitet både CD 115
+ og CD 115
– celler. Dermed arginase aktivering av diklofenak skjer enten i differensierte makrofager eller meglere som trengs for å fremme diclofenac- induced- aktivering av arginase ikke når benmargen rommet.
Diclofenac reduserer NO nivå i bukhulen og i serum
Vi neste undersøkt om den kraftige aktiveringen av arginase i både svulstvev og i bukhinnemakrofager påvirket NO produksjon.
