Abstract
kreft metastase står for de fleste kreftrelaterte dødsfall på grunn av dårlig respons på kreftterapi. Molekylær forståelse av metastaseassosierte legemiddelresistens fortsatt ukjent på grunn av knapphet på tilgjengelig svulstvev. Isolering av sirkulerende tumorceller (CTCs) fra det perifere blod hos pasienter har dukket opp som et gyldig alternativ kilde til tumorvev som kan underkastes molekylær karakterisering. Men har problemer med lav renhet og følsomhet hindret adopsjon til klinisk praksis. Her rapporterer vi en ny metode for å fange og molekylært karakter CTCs isolert fra kastrat-resistent prostatakreft pasienter (CRPC) som fikk taxan kjemoterapi. Vi har utviklet en geometrisk forbedret differensial immunocapture (GEDI) microfluidic enhet som kombinerer en anti-prostata spesifikt membranantigen (PSMA) antistoff med en 3D-geometri som fanger CTCs mens uspesifikke leukocyttadhesjon minimeres. Opplisting av GEDI-fanget CTCs (definert som intakt, kjernedannelse PSMA + /CD45- celler) viste en median på 54 celler per ml identifisert i CRPC pasienter versus 3 hos friske donorer. Direkte sammenligning med kommersielt tilgjengelige CellSearch® avslørte en 2-400 ganger høyere følsomhet oppnås med GEDI enheten. Konfokalmikroskopi av pasient-avledet Gedi-fanget CTCs identifisert TMPRSS2: ERG fusjonsprotein, mens sekvense identifisert bestemt androgen reseptor punktmutasjon (T868A) i blodprøver tilsatt kun 50 PC c4-2 celler. On-chip behandling av pasient avledet CTCs med docetaxel og paklitaxel lov overvåking av narkotika-target engasjement ved hjelp av microtubule bunting. CTCs isolert fra docetaxel-resistente CRPC pasienter viste ingen tegn til narkotika aktivitet. Disse målingene utgjør de første funksjonelle analyser av narkotika-target engasjement i stue sirkulerende tumorceller og derfor har potensial til å muliggjøre langsgående overvåking av target respons og informere utvikling av nye kreftlegemidler
Citation. Kirby BJ, Jodari M, Loftus MS, Gakhar G, Pratt ED, Chanel-Vos C, et al. (2012) Funksjonell Karakterisering av sirkulerende tumorceller med en prostata-kreft-spesifikke microfluidic enhet. PLoS ONE 7 (4): e35976. doi: 10,1371 /journal.pone.0035976
Redaktør: Natasha Kyprianou, University of Kentucky College of Medicine, USA
mottatt: 20 desember 2011; Akseptert: 23. mars 2012; Publisert: 27 april 2012
Copyright: © 2012 Kirby et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra det amerikanske National Institutes of Health (R01 CA137020-01 og U54 CA143876) (PG), NIH naturvitenskap Oncology Center på Cornell (BK, PG DN), New York Office of Science, Technology, og forskning ( BK), den Weill Cornell klinisk og translasjonell Science Center (DN, PG BK) en Kreativitet Award fra Prostate Cancer Foundation (PG og DN) og støtte fra Genitourinary Oncology forskningsfond (DN). CCV er en mottaker av en NRSA postdoktorstipend. EP og SS ble støttet av National Science Foundation Graduate Stipend. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. BK, PG, ST og DN avsløre rådgivning inntekter fra Sanofi USA. Dette endrer ikke vår tilslutning til alle de Plos One politikk om deling av data og materialer.
Innledning
Utviklingen av metastaser hos pasienter med solide svulster maligniteter antas å skyldes kreftceller inn i sirkulasjonssystemet og migrere til fjerne organer, hvor de ekstravasere og formere [1] – [3]. Selv sirkulerende tumorceller (CTCs) er sjeldne så få som én celle per 100 millioner blodceller [3], [4], molekylære og funksjonelle analyser av CTCs kan gi en større forståelse av biologien til kreftmetastaser, bidra til å identifisere nye terapeutiske mål, og gjør det mulig kliniske sammenhenger for å overvåke pasienter som gjennomgår behandling [5]. En rekke teknologier har blitt utviklet for å forbedre gjenkjenning og fangst av CTCs fra perifert blod. Disse inkluderer tetthetsgradient-sentrifugering, immunomagnetisk vulst separering ved hjelp av monoklonale antistoffer rettet mot epitel-celle-overflateantigener, cellesortering ved hjelp av flow cytometri, filtrering basert størrelse separering [6] og microfluidic enheter. Selv om fremskritt i CTC-fangst er gjort, den lave hyppigheten av CTCs i kreftpasienter, deres heterogenitet, mangel på organspesifikk fangst tilnærminger, og plastisitet av CTC befolkningen begrenset evne til å fange og spore alle CTCs [2] , [6]. Foreløpig er den epiteliale celle adhesjonsmolekyl (EpCAM), representerer antigen av valget for de fleste av microfluidic enheter som har blitt utviklet for å fange opp sirkulerende tumorceller [7] -. [10]
Men, samler bevis tyder på at ekspresjon av EpCAM under progresjon av kreft, og spesielt i løpet av epitelial-til-mesenchymale overgang ikke er blitt godt karakterisert, heve bekymringer om det universelle dette antigenet for immunocapture systemer [11], [12]. EpCAM har blitt rapportert å ha potensiell onkogene [13] og korrelerer med proliferasjon i cellelinjer [14]; men det er imidlertid nedregulert i løpet av EMT [1], og EMT markører har vist seg å være viktigere enn epiteliale markører f.eks cytokeratin å forutsi progresjon av kreft [15]. Således, mens EpCAM er helt klart nyttig for å identifisere CTC populasjoner i mange kreftformer, de skjevheter knyttet til EpCAM berikelse er foreløpig ukjent.
I tillegg til usikkerhet om overflateantigener, spesifisiteten immunocapture fra blodet blir forvirret av de ikke-spesifikke adhesive egenskaper av leukocytter på de fleste antistoff flater. På grunn av tilstedeværelsen av mange leukocytter i blod ved en tilnærmet 10
4-10
05:01 forholdet med hensyn til den CTCs, immunospesifikke flater berike CTCs men kan ikke isolere dem fra forurensende leukocytter helt. Identifisering CTCs krever ytterligere trinn og ofte innebærer farging med DAPI for å sikre nærværet av en intakt kjerne og farging for å identifisere tilstedeværelsen av epitel-markører (dvs. cytokeratin) og mangel på det leukocyttisk markør CD45. En slik farging har identifisert en familie av kriterier som korrelerer CTC antall med pasientprognose [16], men det krever at fiksering og farging være sentralt for CTC identifikasjon, som i den kommersielle CellSearch® system [17], [18]. Selv om bestemmelse av CTCs fra pasienter med fremskreden prostatakreft som får kjemoterapi, ved å bruke det kommersielt tilgjengelige CTC capture system av CellSearch® har vist anvendbarhet som en prognostisk indikator på pasientens overlevelse [17], [18] og telling blir nå undersøkt i en rekke klinisk prøvelser, tilstedeværelsen av forurensende leukocytter hindre nedstrøms nytten av CTC digitaliseringsenheter, ved at analyser basert på RNA eller protein kvantifisering er uklar av behovet for fiksering og materiale av leukocyttisk opprinnelse.
for å lette høy effektivitet fangst av prostata CTCs, har vi utviklet en prototype microfluidic enhet som benytter en tilnærming som vi kaller geometrisk forbedret differensial immunocapture (GEDI). Denne anordning kombinerer en geometri som reduserer oppfanging av forurensende leukocytter ved å generere størrelse-avhengig celle-vegg kollisjoner. Vi kombinerer denne geometriske tilnærming med en prostataspesifikt immunocapture overflate ved hjelp av J591 monoklonalt antistoff som gjenkjenner det ekstracellulære domene av prostata-spesifikt membran antigen (PSMA) [10]. PSMA er et celleoverflate-peptidase høyt uttrykt ved maligne prostata epitelceller. PSMA er et attraktivt mål for prostatakreft CTC fangst, slik det er uttrykt på nesten alle prostatakreftceller og ekspresjonssystemer øker etter kastrering. Vi rapporterer her en detaljert demonstrasjon av de flere verktøy i den GEDI anordningen, inkludert en sammenligning av CTC opplisting med CellSearch®, påvisning av en spesifikk mutasjon AR fra blodprøver tilsatt bare 50 celler; identifisering av TMPRSS2-ERG fusjon med farging, og
ex-vivo
vurdering av CTC følsomhet for taxan-behandling ved hjelp av mikrotubuli bundling som en markør for narkotika-target engasjement.
Materialer og metoder
enhets~~POS=TRUNC Fabrication
Alle enheter fabrikasjon ble utført ved Cornell nanoskala Science and Technology Facility (Ithaca, New York). Standard fotolitografisk teknikk ble brukt for å definere rekkegeometrier på silisiumskiver. Skivene ble etset med et oksygenplasma dypreaktiv etcher (Uniaxis SLR770) til en dybde på 100 um, og renset ved anvendelse av svovelsyre og hydrogenperoksyd før antistoffoverflatefunksjonalisering. Den J591 monoklonalt antistoff (produsert av Lonza plc (Slough, England) for Bzl Biologics, inc.) Ble immobilisert på enheten overflater ved hjelp MPTMS-GMBS-NeutrAvidin-biotin kjemi [10]. Polydimethylsiloxane (PDMS) ark (05:01 base:curing agent), ca 3 mm tykke, ble polymerisert i 18 timer ved 60 ° C og trimmet for å danne dekker for GEDI enheten. En PDMS ark ble festet til toppen av enheten med en tilpasset pilk å skape lukkede kanaler befolket med legg arrays. Innløps- og utløps hull ble laget med en biopsi punch, og 23-måle metall rør ble satt inn i PDMS å koble innløp og utløp til ekstern slange. Enhetene ble primet med en 50/50 isopropanol /vann-blanding, og deretter spylt med DI vann og PBS før eksperimenter.
Prøvetaking og mikrofluid Capture
Perifere blodprøver ble innsamlet i rør som inneholder natrium citrate antikoagulerende (Becton Dickinson) fra friske frivillige og pasienter med metastatisk kastrering resistent prostatakreft under en klinisk protokoll med tittelen «Analyse av sirkulerende tumorceller i prostata kreft. Forutsi respons på taxaner. En pilotstudie «som ble godkjent av Institutional Review Board (IRB) av Weill Cornell Medical College of Cornell University Blod ble innhentet fra pasienter eller friske donorer etter skriftlig informert samtykke, som også ble godkjent av IRB komiteen av Weill Cornell Medical College of Cornell University. Som tidligere beskrevet [10], 1 ml blod fra hver prøve ble bearbeidet gjennom GEDI brikken i 24 timer for blodprøvetaking ved å presse blodet gjennom innretningen ved en volumetrisk strømningshastighet på 1 ml /hr (Chemyx sprøytepumpe)
Cell farging og analyse
de cellelinjer som brukes i disse eksperimentene som kontroller for flekker eller i piggete eksperimenter er. den menneskelige leukemi cellelinje U937, og .. humane prostatacancercellelinjer PC-3, LNCaP og c4-2 Alle cellelinjer ble kjøpt fra ATCC Post-fangst ble cellene fiksert på-brikke med PHEMO fikseringsmiddel ved 37 ° C (PHEMO buffer: PIPES syre, HEPES syre, dinatriumsalt EGTA, Mg-Cl2-6H
20, 10% DMSO), glutaraldehyd, og 3,7% formaldehyd. Cellene ble deretter blokkert (10% Normal Goat Serum – Jackson Immuno Research) og immunostained med FITC-konjugert humanisert mAb J591 å oppdage PSMA uttrykk. Monoklonale mus anti-CD-45 (BD Biosciences) etterfulgt av AlexaFluor568 merket geit anti-muse-sekundært (Invitrogen) og muse anti-EpCAM direkte konjugert til AlexaFluor647 (Biolegend). For påvisning av intracellulære antigener, ble cellene permeabilisert med 0,1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich) i PBS og farget ved anvendelse av rotte-anti-a-tubulin (YL1 /2, Millipore) og kanin-anti-ERG monoklonalt antistoff (klon EPR 3864; Epitomics, Burlingame, CA). Den anti-ERG antistoff var en generøs gave fra Dr. Mark Rubin (Weill Cornell Medical College, New York, New York). Alle primære antistoffer ble inkubert i 1 time ved romtemperatur; sekundære antistoffer ble farget ved romtemperatur i 30 minutter. DAPI ble brukt for DNA kontra. Gedi enhetene ble montert på dekk med Mowiol og lagret ved -20 ° C før analyse.
CTC oppregning
Blindet CTC oppregning følgende antistoff merking ble utført ved bruk av en Zeiss LSM-700 punkt skanning konfokalmikroskop, utstyrt med 405-, 488, 555-, og 632-nm laserlinjer. Alle PSMA + /CD45- kjerneholdige celler ble identifisert som CTCs. Initial validering av CTC telling ble utført av to uavhengige, blindet testere. Positive og negative kontroller for antistoff ytelse og farging ble inkludert i hvert forsøk: U937 human leukemi celler (CD45 + /PSMA- /EpCAM-), og de menneskelige prostata kreft cellelinjer (c4-2 og LNCaP: PSMA + /CD45- /EpCAM + og PC-3 (PSMA- /Cd45- /EpCAM dim). Individuell
z
-stacks ble anskaffet ved hjelp 100X /NA 1,46 og 63x /NA 1.3 Plan-Apo Zeiss mål kontrolleres av Zen programvare (Zeiss) og presentert som maksimal intensitet projeksjoner.
RNA ekstraksjon
etter celle fangst ble GEDI enheten skylles med rennende PBS i 30 minutter ved en hastighet på 1 ml /t. Cellene ble lysert med 700 ul RLT Lysis-buffer supplert med 1% β-mercaptoethanol ved en strømningshastighet på 15 ml /time. lysatet ble oppsamlet, og RNA ble ekstrahert ved bruk av QiagenRNEasy Micro Plus Kit (Qiagen Inc., Valencia, CA) ifølge produsentens instruksjoner.
ex-vivo narkotika behandlinger og analyse
for
ex vivo
behandlingsforsøk, blodprøven fra hver pasient ble delt og 1 ml ble fløyet til hver av tre Gedi enheter samtidig. Etter CTC fangst og påfølgende PBS vask ble hver GEDI microdevice forsiktig plassert i en dyrkningsskål med RPMI-1640 medium inneholdende 2% serum og supplert med enten 0,1% DMSO kontroll eller paclitaxel i konsentrasjoner på 100 nM eller 1 uM og inkubert ved 37 ° C i 24 timer. Ved slutten av behandlingen ble Gedi-fanget cellene fiksert med PHEMO buffer og behandlet for multipleks konfokal mikroskopi etter farging med forskjellig celleoverflaten og cytoplasmatiske antistoffer som angitt. Alle CTCs (PSMA + /CD45- /DAPI +) ble vurdert for tilstedeværelse av mikrotubulidynamikk bunter som bevis på effektiv narkotika-target engasjement. Prosentandelen av CTCs med bevis på microtubule bundling ble beregnet. I alle prøvene analysert, bunting var tydelig fram av den distinkte form, bredde, orientering og økt fluorescens intensitet mikrotubulidynamikk bunter sammenlignet med mikrotubuli fra ubehandlede celler. I tillegg brukte vi DAPI counterstain for å vurdere tilstedeværelse av mitotiske eller apoptotiske kjerner etter medikamentbehandling.
Statistical Analysis
Statistisk analyse ble utført for å sammenligne de midlere CTC tellinger oppnådd fra CRPC pasienter og friske donorer. Vi brukte en ikke-parametrisk (Wilcoxon signed-rank) analyse, som CTC teller ikke utvise normal fordeling. Statistisk signifikans ble definert med α = 0,05.
Resultater
For å karakterisere ytelsen til enheten (figur 1A), vi bestemt cellefangstrater med PSMA-positive kreftceller. Vi har fastslått celle fange som en funksjon av varierende mAb J591 konsentrasjoner (1,5 til 20 ug /ml) ved hjelp av skjærspenning størrelsene er representative for de som oppleves av de funksjonaliserte overflater på anordningen (0,08 til 0,24 Pa). Disse eksperimentene viste en doseavhengig økning i celle fange opp til mAb konsentrasjon på 10 ug /ml, som ble anvendt for alle etterfølgende eksperimenter (figur 1B).
oversikt (A) GEDI enhet. Med klokken fra øverst til venstre: skjematisk av blodstrømmen gjennom enheten, bildet av silisium enhet med silikonpakning, overflatefunksjon ordningen. (B) Celle fange ytelse som en funksjon av skjærspenning og antistoffkonsentrasjon. Titreringskurver for den anti-PSMA J591 antistoff i en standardisert geometri indikere optimal antistoffkonsentrasjon for celleopptak.
Selv om J591 antistoff som er spesifikt for PSMA-uttrykkende celler, ikke-spesifikk leukocyttadhesjon har vært stort problem for alle blodbaserte immunocapture teknikker. For å minimere leukocyttadhesjon, gjennomførte vi en parametrisk studie for å karakterisere kollisjonsfrekvensen (HLR, kollisjon per rad) som en funksjon av cellestørrelse og hindring utlignet. Kollisjoner fra et delsett av disse forskyvninger oppviser en skarp cutoff ifølge cellestørrelse, som vist i figur 2A; derav vi valgt en hindring forskyvning (7 pm) som genererer en skarp cutoff på cellediameter på 14 um. Fysikken som beskriver denne cutoff er best illustrert av størrelsesavhengige celle pathlines (figur 2A), som viser hvor stor celler opplever gjentatt kollisjon mens små celler som er atskilt fra hindringer og unnslippe fangst. Vi testet denne hypotesen ved å måle fangst av LNCaP prostatakreftceller (figur 2B). I dette forsøket tilsatt LNCaP-celler ble fløyet inn J591-funksjonaliserte enheter som hadde en 7 mikrometer forskyvning (GEDI)
versus
de som ikke hadde noen forskyvning (rett). Selv om disse to enheter har den samme overflate-areal-til-volum-forhold, den GEDI geometrien sterkt øket celle fangsteffektivitet, som målt ved fanget og oppregnet celler normalisert ved inngangscelleantall
(A) Venstre:. Top visning av microfluidic hinder matrise med tabell geometriske parametre. Δ = hindring utlignet. Λ = hindring mellomrom i retning av massestrømmen. Γ = hindring mellomrom i retning vinkelrett på hovedstrømmen. 2
r
= hindring diameter. Strømlinje (grå) betegner væskestrømmen. Pathlines (ulike farger) betegne baner av celler av ulik diameter. Hinder rekke mellomrom og orientering parametere er også definert. Høyre: Graden av celle-vegg kollisjoner for celler som reiser gjennom matrisen er en sterk funksjon av forskyvningen parameter i matrisen; den GEDI designmetodikk innebærer bruk av en utlignet parameter som fører til størrelse avhengige kollisjon priser. Resultatene forutsagt for strømningen gjennom geometrien til venstre er vist til høyre ved den heltrukne linjen; de fire spesifikke cellestørrelser føre til resultater merket med de fire fargede prikker på denne grafen. Andre geometriske ordninger føre til ulike resultater, vist til høyre i de prikkete og stiplede linjer. (B) Rette matriser eller matriser med små forskyvninger (gull bokser) fører til lavere fangsteffektivitet (til venstre) og størrelse uavhengighet (til høyre). Nøye utvalgte forskyvninger (magenta boksene) føre til høye fangstrater (til venstre) og størrelse avhengighet (til høyre). Capture priser på venstre sammenligne GEDI (7-mikrometer offset) og rett (ingen offset) geometri ytelse målt ved LNCaP fangsteffektivitet på J591-funksjon enheter. Priser på riktig beskrive simulerte kollisjoner i disse geometrier. Både eksperimentelle resultater har den samme overflate-areal-til-volum-forhold. (C) Enheter med samme areal i forhold til volum gir svært ulike resultater: rette arrays føre til kollisjoner som reduserer som blodet reiser gjennom enheten; Gedi arrays føre til kollisjoner som øker med reise gjennom enheten.
På grunn av avhengigheten av cellen bane på celle diameter, kollisjons priser er en komplisert funksjon av celle diameter og rekke parametere både som forskyvninger rad . Kollisjonen per rad (HLR) er en sterk funksjon av raden offset, stiller diskontinuitet, størrelse avhengighet, og oppstart effekter knyttet til den endelige rekke størrelse (Figur 2C). Den dramatiske forskjellen mellom resultatene for ulike design er forårsaket av nedbøyning av partikler-i dårlig valgt geometrier, fører til avbøyning cellene til å bøye på strømlinjene som ikke kommer inn nærhet med senere hindringer, mens i velvalgte geometrier, de nedbøyning årsaker cellene til å bøye på strømlinjene som kommer i nærhet med senere hindringer. Dermed kollisjon renteøkninger som cellene går gjennom enheten for GEDI design, og reduserer for dårlig valgt design som rett arrays (Figur 2C). Dette cutoff tillater brukeren å identifisere en cutoff mellom hematocytes ( 14 mikrometer) og cellepopulasjon som vil oppleve maksimal kollisjoner ( 15 mikrometer).
Cell fangst, bildebehandling, og telling av CTCs fra metastatisk prostatakreftpasienter
Neste, vi brukte GEDI enheten for å fange og karakter sirkulerende tumorceller (CTCs) fra blodet hos pasienter med metastatisk CRPC. En ml perifert blod ble fløyet gjennom enheten, ble fanget cellene fiksert og immunostained for PSMA, CD45, EpCAM og DAPI, og de fangede cellene ble analysert ved konfokal mikroskopi. CTCs ble definert som intakt, kjernedannelse, PSMA + /CD45- celler. Representative eksempler på CTCs og leukocytter er vist i figur 3A. Interessant, PSMA + celler hadde variabel EpCAM flekker, alt fra svært positive til svakt negativ i form av EpCAM fluorescerende intensitet. I en undergruppe av pasienter, kvantitert vi prosenten av PSMA-fangede CTCs som var EpCAM positiv. Vi observerte at 40-70% av GEDI-fanget CTCs var positivt for begge merkene, med median er 60% (data ikke vist). Kontroller for antistoff ytelse ble inkludert med hvert eksperiment med to prostata kreft cellelinjer som uttrykker ulike nivåer av PSMA og EpCAM (c4-2: PSMA + /EpCAM + /CD45- og PC3: PSMA- /EpCAM- /CD45-) og CD45 + leukemi celle linjen U937 (figur S1 A).
(A) Representative bilder av sirkulerende tumorceller tatt med GEDI enheten fra 1 ml blod fra pasienter med prostatakreft. CTCs er avbildet på enheten, og blir identifisert følgende farging med DAPI, PSMA, CD45, og EpCAM. Intakte, kjerneholdige celler som er PSMA + /CD45- er identifisert som CTCs. Leukocytter er identifisert som DAPI + /PSMA- /CD45 + (nederste rad, pil). Legg merke til heterogeniteten til EpCAM-ekspresjon i PSMA + cellepopulasjonen (øverste og nederste radene, EpCAM- midtre rad, EpCAM +). Skala: 10 mikrometer. (B) Sykdomsspesifikke GEDI fangst av CTCs. CTC oppregning (CTCs /ml) ble utført ved anvendelse av blod fra friske donorer (median = 3) og CRPC pasienter (median = 54). (P 0,001, Wilcoxon) (C) Sammenligning av CTC telling mellom GEDI-based- og CellSearch® basert fangst. Denne sammenligningen ble utført med samme dag blodet trekker fra 25 individuelle CRPC pasienter. * Viser at CellSearch basert telling ble utført en uke før GEDI basert telling; ∉ indikerer samme pasient hvis blod ble trukket på to separate tidspunkter tre måneder fra hverandre (blod ikke trekke 14 skjedde 3 måneder etter blod tegne ingen 19); # Indikerer samme pasient hvis blod ble trukket på to separate tidspunkter ett år fra hverandre (blod tegne no 22 skjedde 1 år før blod ikke trekke 23).
Vi behandlede blod innhentet fra 10 friske givere (kontroller ) og 30 pasienter med metastatisk CRPC bruker GEDI enheten. Median antall CTCs /ml oppdaget var 3 (0 til 22) og 54 (0 til 1200), henholdsvis (p 0,001; figur 3B). Deretter utførte vi en direkte sammenligning av CTC-fangst og telling ved å sammenligne GEDI microdevice med FDA-godkjente EpCAM baserte CellSearch® CTC Test på samme dag blodet trekker fra 25 CRPC pasienter (Figur 3C). Vi oppdaget en 2-400-dobling i antall CTCs /ml rapportert ved GEDI microdevice forhold til CellSearch ® CTC Test (Figur 3C;
p
0,0001, beregnet med Wilcoxon test), og en svak korrelasjon (
r
= 0,44, uteliggere fjernet med Cook avstand begrensning) mellom GEDI CTC teller og CellSearch® (figur S2)
molekylær karakterisering av fangede celler: Påvisning av en singel. punktmutasjon i androgen reseptoren og uttrykk for TMPRSS2-ERG fusjon i piggete celler og CTCs
for å vurdere om vi kunne molekylært karakterisere GEDI-fanget CTCs, utførte vi proof-of-prinsippet eksperimenter der prostatakreft -celler ble tilsatt i 1 ml blod fra en frisk donor, fanges opp av anordningen og analysert for tilstedeværelse av androgenreseptoren (AR) punkt mutasjoner eller ekspresjon av TMPRSS2: ERG-gen-fusjonsprotein. For å detektere den T868A (ACT-GCT) enkeltpunktmutasjon i AR ligand-bindende domene [19], 50 c4-2-celler ble tilsatt til 1 ml av frisk donor blod strømmet gjennom GEDI anordningen, og RNA ble ekstrahert ved direkte lysis på enheten, etterfulgt av cDNA-sekvensering (figur 4A). Parallelt ble sekvensering utført på RNA ekstrahert fra 1 ml av den samme donorblod behandlet på samme måte (negativ kontroll) og på RNA ekstrahert fra 50 c4-2-celler (positiv kontroll). Som forventet ble det T868A mutasjon klart påvist i c4-2 celler (figur 4A, topp og midtre panelet), men fraværende fra negativ kontroll. Punktmutasjonen ble også påvist i den piggete blodprøven, med det mutante topp (A) står for 70% av nukleotid til stede i denne posisjon, og villtype (T) for 30%. Dette resultatet er i overensstemmelse med det som tidligere er rapportert cellen fangst renhetsgrad på 68% oppnådd med fluorescensmerkede prostatakreftceller tilsatt i 1 ml perifert blod fra en frisk donor og strømmet gjennom GEDI microdevice [10].
(A ) Captured celler utviser høy renhet, slik at identifisering av enkeltpunktmutasjoner. Den T868A (ACT-GCT, Thr-Ala) AR enkeltpunktmutasjon oppdages fra RNA ekstrahert fra 50 c4-2 celler tilsatt i en ml av sunn-donor blod og tatt til fange av GEDI enhet (tredje rad, pil). Sekvense resultater fra 1 ml blod fra samme frisk donor (øverste rad) eller fra 50 c4-2 celler i kultur (midterste rad) er også avbildet. (B) Den TMPRSS2: ERG fusjonsprotein er oppdaget i Gedi-fanget CTCs fra en CRPC pasient. PSMA-fangede CTCs var farget på enheten med en anti-ERG antistoff. Representative eksempler på tre PSMA + /CD45- CTCs vises, hvorav to er positivt for ERG. Skala barer: 10 um
I tillegg er tilstedeværelsen av TMPRSS2:. ERG-fusjonsprotein kan bli detektert ved farging med kanin monoklonale anti-ERG-antistoff [20] i fusjons-positive VCap prostatakreft celler tatt til fange av enheten og analysert ved multiplex konfokalmikroskopi (figur S3). Tilsvarende analyse på Gedi-fanget CTCs fra en CRPC pasient avslørte tilstedeværelsen av både ERG positive og ERG negative celler, mens CD45 + leukocytter var negative for ERG protein (Figur S3, panel C), noe som indikerer spesifisiteten av ERG farging for prostatakreft-avledet celler
Funksjonelle analyser. tubulin bundling ved eksponering for taxaner
Gitt den høye renhet og levedyktighet av Gedi-fanget CTCs, vi neste testet hypotesen om at CTC kjemosensitivitet til taxaner følgende
ex vivo
behandling på GEDI microdevice kunne forutsi pasientens kliniske respons på behandling. Taxaner (paclitaxel, docetaxel og cabazitaxel), som vanligvis brukes for å behandle pasienter CRPC [21] – [23] handling ved å stabilisere mikrotubul-polymerer og indusere dannelsen av mikrotubul bunter. Mikrotubul bunting er lett påvisbar ved immunofluorescens farging, på grunn av deres høyere fluorescens-intensitet, distinkt form og cytoplasmiske organisasjon, sett i maksimal signal projeksjon [24]. Microtubule bundling er det første arrangementet indusert av taxan behandling, noe som resulterer i nedstrøms mitotisk arrest og apoptotisk celledød, og er derfor en passende markør for effektiv taxan narkotika-target engasjement.
For å først finne den optimale konsentrasjonen og varigheten av
ex vivo
on-chip behandling av pasient avledet CTCs, piggete vi 200 c4-2 celler til 1 ml blod fra en frisk donor, behandlet prøven i GEDI enheten, og deretter inkuberes de fangede celler på anordningen i 24 timer i medium inneholdende 100 nM eller 1 uM av docetaxel (DTX) ved 37 ° C. Docetaxel behandling med 100 nM resulterte i forskjellige mikrotubul bunter i fangede c4-2 celler (figur 5A, midtre panel piler), i motsetning til de fine og intrikate mikrotubulus nettverk av de ubehandlede Gedi-fanget-celler (figur 5A, øvre panel). Behandling med en mikrometer DTX resulterte i robust microtubule bunting og induksjon av apoptotiske hendelser (Figur 5A, lavere panel pilspisser). Apoptotiske bivirkninger ble bestemt ved tilstedeværelse av lyse og fragmenterte kjerner ledsaget av tap av tubulin farging. Lignende resultater ble oppnådd med 48 timers, on-chip,
ex vivo
behandling (data ikke vist). Disse resultatene, sammen med det faktum at AUC av serum docetaxel konsentrasjon for pasienter som 55-100 mg /m
2 av docetaxel er omtrent lik 1,5-5 timer mg /l [25], førte oss til å velge en 24 hr behandling med 100 nM av et taxan (1,92 timer mg /l) for å evaluere
ex vivo
respons fra pasient avledet CTCs.
Tubulin respons på taxan behandling kan vurderes i GEDI-fanget celler. (A) c4-2 prostatakreftceller ble tilsatt til 200 celler /ml i frisk donor-fullblod. En ml pigg blod ble deretter strømme i hver av de tre Gedi enheter. Fangede celler ble inkubert i hver enhet ved 37 ° C i 24 timer med enten DMSO kontroll (øvre panel) eller DTX 100 nM (midtre panel) eller 1 uM (lavere panel). Etter behandling ble cellene fiksert og prosessert for immunofluorescens farging ved hjelp av antistoffer mot tubulin og CD45. DAPI ble anvendt som en DNA-counterstain å evaluere atom integritet. Legg merke til den fine og intrikate microtubule nettverk i DMSO kontroll (øverste panel) og den distinkte mikrotubulidynamikk bunter i DTX behandlet enheter (piler, midtre og nedre paneler). Apoptotiske kjerner ble observert ved høyere DTX konsentrasjoner (pilspiss, bunn panel). (B) Gedi-fanget CTCs fra blodet til en CRPC pasient ble behandlet
ex vivo
på GEDI enhet med 100 nM DTX (øverst panel) eller tilsetning av 100 nM PTX (nedre panel) 37 ° C i 24 timer. Etter behandling av PSMA-fangede celler ble fiksert og behandlet for immunofluorescens farging som i (A) under tilsetning av cytokeratin-18 som et alternativ epithelial markør. I denne pasient, er tilstedeværelsen av en uaffisert mikrotubuli-nettverkssystem DTX behandling (øvre panel) indikerer mangel på effektiv medikament-target inngrep. I motsetning til dette vil tilsetning av PTX resulterte i mikrotubulus bunting (nedre panel).
En rekke forsøk har blitt utført for å vise potensialet for funksjonell analyse i den beskrevne anordning. I disse tilfellene celler fanget i enheten ble behandlet
ex vivo
med DTX og /eller PTX for 24 timer (figur 5B og S3). Disse fremheve evnen til å utføre funksjonelle analyser på chip og analyse narkotika-target engasjement hos pasienter i sammenheng med deres klinisk respons. Frafall, som indikert av mangel på bevis for microtubule bundling eller apoptotiske kjerner følgende
ex vivo
DTX behandling, kunne observeres hos enkelte pasienter. Figur S4C viser en pasient som var ikke-responsive ved microtubule analysen, i samsvar med denne pasientens manglende klinisk respons ved hjelp av etablerte RECIST og PSAWG2 kriterier. Dette svaret var ofte heterogen i fanget cellepopulasjonen;
