Abstract
ovarialcancer (EOC) er den dødeligste av gynekologiske kreftformer, delvis på grunn av sin klinisk okkulte metastasering. Derfor forstå mekanismene som styrer EOC formidling og invasjon kan gi nye mål for antimetastatic terapier eller nye metoder for påvisning av metastatisk sykdom. CAMP-avhengig protein kinase (PKA) blir ofte dysregulerte i EOC. Videre PKA aktivitet og subcellulære lokalisering av A-kinase forankring proteiner (AKAPs) er viktige regulatorer av cytoskeletal dynamikk og cellemigrasjon. Således, søkte vi å studere rollen til PKA og AKAP funksjon i begge EOC celle migrering og invasjon. Ved hjelp av plasmamembran-rettede PKA biosensor, pmAKAR3, og en forbedret migrasjon /invasjon analyse, viser vi at PKA aktiveres ved forkanten av migrere SKOV-3-EOC-celler, og at inhibering av PKA aktivitets blokker SKOV-3 cellemigrering. Videre viser vi at mens den PKA aktivitet innenfor forkanten av disse cellene er mediert ved forankring av type-II regulatoriske PKA subenhetene (RII), hemming av forankring av enten RI eller RII PKA underenheter blokkerer cellemigrering. Viktigere, vi viser også – for første gang – at PKA aktivitet er oppregulert i forkant av SKOV-3-celler i løpet av invasjon av en tre-dimensjonal ekstracellulær matriks og, sett for migrering, inhibering av enten PKA aktivitet eller AKAP -mediert PKA forankring blokker matrise invasjon. Disse dataene er de første til å vise at invasjonen av ekstracellulær matriks av kreftceller utløser aktivering av PKA innenfor invasiv forkanten og at både PKA aktivitet og forankring er nødvendig for matrise invasjon. Disse observasjonene tyder på en rolle for PKA og AKAP aktivitet i EOC metastaser
Citation. McKenzie AJ, Campbell SL, Howe AK (2011) Protein kinase A aktivitet og forankring er nødvendig for Ovarian Cancer Cell migrasjon og invasjon. PLoS ONE 6 (10): e26552. doi: 10,1371 /journal.pone.0026552
Redaktør: Neil A. Hotchin, University of Birmingham, Storbritannia
mottatt: 16 juni 2011; Godkjent: 28 september 2011; Publisert: 19 oktober 2011
Copyright: © 2011 McKenzie et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble finansiert av tilskuddet # R01GM074204 (til AKH) fra National Institutes of Health /National Institute of General Medical Sciences (https://www.nigms.nih.gov) og fra et postdoktorstipend (til SLC) fra Vermont Cancer Center og Lake Champlain Cancer Research Organization (https://www.vermontcancer.org). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
ovarialcancer (EOC) er den femte vanligste årsaken til kreftdødsfall hos kvinner i USA og har den høyeste dødeligheten av alle gynekologiske kreft [1]. Omtrent 80% av pasientene med foreliggende sent stadium sykdom og mindre enn 25% av disse kvinnene er kurert. EOC utgjør det overveldende flertall ( 90%) av eggstokkene maligniteter og er unik i sin klinisk okkult formidling og metastase [2]. I motsetning til de fleste andre typer kreft, er formidling av EOC gjennom blodkar og dannelse av virkelig distale metastaser en sjelden forekomst. EOC celler skur fra den primære svulsten på overflaten av eggstokk og exfoliate inn i bukhulen. Den anatomiske plassering av eggstokkene muliggjør lokal spredning av EOC, noe som kan forekomme ved direkte migrering og invasjon av tumorceller til og inn i nærliggende organer, samt ved transport av ekspandert tumorceller i hele bukhulen ved normal peritoneal fluidstrømning [2] , [3]. På grunn av dette unike og fordekt modusen for formidling, har arbeidet med å utvikle metoder for tidlig påvisning av EOC vært stort sett mislykket [4], [5], [6]. Til tross cytoreduserende kirurgi, kombinasjons chemotherapies og strategier for å bestemme serum biomarkører, lokal og spres kjemoresistent celler vedvare og til slutt blomstre, som fører til høye tilbakefall og 25% fem års overlevelse av pasienter med EOC [3], [5], [7], [8], [9]. Dermed vil en bedre forståelse av de cellulære og molekylære mekanismer som styrer EOC formidling og invasjonen har potensial til å ha betydelig innvirkning på sykdomsforløpet.
På grunn av avhengigheten av EOC formidling og metastasering på mobil migrasjon og invasjon , vårt laboratorium har søkt å forstå mekanismene bak disse prosessene i EOC. Cellemigrering er et høyt organisert prosess som krever koordinert innsats mellom tallrike proteiner i forskjellige subcellulære regioner [10], [11], [12]. Vi har tidligere vist at cAMP-avhengig proteinkinase (PKA) er viktig for cellemigrering og forkanten dynamikk i et antall celler [13], [14], [15]. PKA er en heterotetrameric kinase som kan eksistere i to isoformer, Type-I og type-II, avhengig av isoform av regulatoriske (RI og RII) subenhet forbundet med holoenzyme. PKA har mange mål knyttet til actomyosin basert celle bevegelse [16] og tidlige studier viste at hyper-aktivering eller hemming av PKA inhiberes kjemotaktisk celle-migrering [16], [17], [18]. Denne tilsynelatende motstridende rolle for PKA ble klaret ved demonstrasjonen at i tillegg til den totale aktivitet, lokalisering av PKA i subcellulære plass, mediert gjennom bindingen av PKA R-subenheter til A-kinase forankringsproteiner (AKAPs; [19], [20]) regulerer cellevandring [13], [21], [22]. Nærmere bestemt har det vist seg at PKA subenhetene og aktivitet er begge anriket på protrusive strukturer ved forkanten av migrerende celler [13], [21], [22]. Videre bred hemming av type-I og type-II-forankring (
ie
forankring gjennom RI eller RII subenheter) generelt [13], [21], eller spesifikk hemming av de enkelte forankringsproteiner (
f.eks
AKAP-Lbc [22]), hemmer migrasjon. Disse og andre rapporter (anmeldt i [23], [24]), etablere viktigheten av å lokalisere PKA aktivitet til forskjellige subcellulære steder under normale celle trekkende prosesser.
For å understreke hvor viktig PKA i eggstokkreft patogenesen er observasjoner som PKA aktivitet og subenhet uttrykk er ofte feilregulert i EOC. Ekspresjon av PKA katalytiske underenheten [25] og regulerings RI-underenheten [26], [27], [28] korrelerer med avansert stadium og /eller mer aggressiv EOC. Videre, de mRNA nivåer av AKAP3 (
aka
AKAP110 eller fiber kappe protein på 90 kDa (FSP90)) i ovarietumorer positivt korrelerer med sykdomsstadiet og dårlig prognose [29], [30], mens to andre AKAPs – AKAP1 (
aka
AKAP149) og AKAP13 (
aka
AKAP-LBC) – også synes å være oppregulert i mucinkjertler EOC (A. Howe, upubliserte observasjoner fra Oncomine). Til tross for disse observasjonene, den funksjonelle betydning PKA og AKAP signalisering i metastatiske EOC celler har ikke blitt godt undersøkt.
Gitt betydningen av PKA og AKAP funksjon for celle migrasjon og deres feilregulering i EOC, vi undersøkte den romlige regulering av PKA aktivitet i migrere EOC celler og bestemt om PKA aktivitet og forankring er nødvendig for EOC celle migrasjon. Her rapporterer vi at PKA aktivitet er oppregulert i den fremre kant av EOC-celler ikke bare under overføringen, men også i løpet av ekstracellulær matriks invasjon, så vel. Videre kan inhibering av PKA-aktivitet og AKAP funksjonsblokker EOC cellemigrering og invasjon. Disse observasjonene viser, for første gang, viktigheten av PKA forankring for matrise invasjon og etablere betydningen av romlig regulert PKA aktivitet i migrasjon og invasjon – og dermed kanskje metastasering – av EOC celler
Materialer og metoder.
Reagenser og Cell Culture
SKOV-3 og COS-7 celler ble oppnådd fra American Type Culture Collection og opprettholdt i antibiotika-fritt Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) supplementert med 10% (vol /vol) fetalt bovint serum (FBS). HiO-80 celler var en generøs gave fra Dr. Andrew Godwin (Institutt for molekylær onkologi, Fox Chase Cancer Center) og ble opprettholdt i en 01:01 blanding av antibiotika-free Medium 199: MCDB-105 supplert med 4% FBS og 0,2 U /ml svineinsulin. Alle celler ble dyrket ved 37 ° C i en fuktet inkubator inneholdende 5% CO
2. DMSO, cytokalasin D og trypanblått ble innkjøpt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). GM6001 ble hentet fra Millipore (Billercia, MA). Fenol rød-fri Matrigel og humanfibronektin ble kjøpt fra BD Biosciences (Bedford, MA). Farmakologisk inhibering av PKA-aktivitet ble oppnådd ved anvendelse av H89 eller mPKI (Biomol). H89 er en isokinolon som konkurrerer med ATP for binding til PKA; til tross for utbredt bruk og betydelig styrke, det viser bare beskjedne spesifisitet for PKA [31]. mPKI, en svært spesifikk PKA-inhibitor, er en Myristoylated, celle-gjennomtrengelig peptid omfattende de inhibitoriske pseudo-substrat region (aminosyrer 14-27) av det endogene protein kinase A Inhibitor-protein (PKI) [14]. Farmakologisk hemming av PKA forankring ble oppnådd ved hjelp StHt31 (Promega), en stearated peptid omfattende PKA R-subenheten bindende domene fra Ht31 (
aka
AKAP-Lbc); således, StHt31 virker som en celle-gjennomtrengelig konkurrerende inhibitor av interaksjonen mellom endogent AKAPs og både RII og, ved noe høyere konsentrasjoner, RI PKA subenhetene [32], [33]. Genetiske inhibitorer av PKA-aktivitet og på type-I og type-II-PKA forankrings er beskrevet nedenfor.
Plasmider og Transfeksjon
plasmid som koder for mCherry-sammensmeltet til PKA-inhibitor-proteinet PKI (se ovenfor ) er blitt beskrevet tidligere [14], mens plasmider som koder GFP kondensert til type-i og type-II-forankrings-inhibitorer (RI forankrings disrupter (RIADEN; [34]), og superAKAP
-in silico plakater (sAKAP
er
, [32], henholdsvis), så vel som deres tilsvarende omkastet (
scr
) negative kontroller, ble samlet ved hjelp av 5′-fosforylerte oligonukleotider (Invitrogen) som er oppført i tabell S1 Nærmere bestemt. komplementære oligonukleotider var glødet, genererer 5 «
Sal
jeg og 3′
BamH
i klebrige ender, så bundet direkte til
Sal
i /
BamH
i-fordøyd pEGFP-C1 (Clontech). mCherry versjoner av RIAD og sAKAP
er
ble generert ved å erstatte
Nhe
I-
BamH
jeg fragmentet som koder EGFP i respektive plasmider med
Nhe
I-
BamH
fragmentet fra pmCherry-C1. For transfeksjon og forbigående ekspresjon av proteiner, ble celler transfektert ved hjelp av Fugene6 (Roche) i henhold til produsentens protokoll. I korthet, ble 6 ul Fugene6 tilsatt til 100 pl serum og antibiotika fritt DMEM, kort vortex-blandet og inkubert ved romtemperatur i 5 min. En total på 1,5 ug DNA ble tilsatt til blandingen, kort vortex-blandet og inkubert ved romtemperatur i 15 min. Blandingen ble deretter tilsatt dråpevis til en 35 mm skål inneholdende celler ved mellom 80-90% konfluens, ble hensatt ved romtemperatur i 2-3 min, deretter returnert til inkubatoren. Alle forsøk ble gjort mellom 24-48 timer etter transfeksjon.
immunfluorescens
For visualisering av aktin, fibronektin, paxillin, og PKA RIα og RIIα subenheter ble cellene fiksert i 3,7% formaldehyd i PBS i 10 minutter, permeabilisert i 10 minutter i PBS inneholdende 0,25% triton x 100, blokkert med PBS inneholdende 3% BSA enten i 1 time ved RT eller over natten ved 4 ° C og deretter inkubert med anti-fibronektin (1:400, BD Transduksjon) , anti-paxillin (1:500, BD Transduksjon), anti-PKA RIα eller RIIα (Genetex 1:200 og BD Transduksjon 1:200 henholdsvis) primære antistoffer i 1 time ved RT. Etter vasking 3 x 5 min med PBS, ble cellene inkubert med Alexa-594 koplet esel anti-muse-sekundært antistoff (Invitrogen, 1:400) og Alexa 488-konjugert phalloidin (Invitrogen, 1:100) i 1 time ved RT. Dekkglass ble de montert på glassmikroskopobjektglass (Fisher) ved hjelp av et lite volum av PermaFluor mountant (Thermo Scientific). Epifluorescence bilder ble tatt om 10, 20, 40, og 60X Plan Apo mål på et Nikon Eclipse TE-2000E invertert mikroskop med riktig fluoroforen spesifikke filtre (Chroma Technology Corp, Rockingham, VT) og en CoolSnap HQ kamera (fotometriske, Tucson , AZ) kontrollert av Elements (Nikon) programvare.
sårhelende migrasjon analysen
dekkglass ble sterilisert med påfølgende soaking i 30 min intervaller i økende konsentrasjoner (70, 95, 100%) av EtOH. Objektglassene ble fjernet fra EtOH og lufttørket i vevskultur hette. Når tørket, sterile Dekkglass ble belagt i 20 pg /ml humant fibronektin fortynnet i steril PBS, enten over natten ved 4 ° C eller 2 timer ved 37 ° C. En konfluent monolag av celler ble sådd ut på ECM-konjugerte Dekkglass og tillates å følge natten over. Et sår ble laget i monolaget ved å skrape en steril P200 pipettespiss på tvers i cellene, og objektglassene ble vasket én gang med sterilt PBS for å fjerne eventuelt celleavfall. Bilder ble ervervet ved hjelp av en 10x Plan Apo objektiv på Nikon Eclipse TE-2000E invertert mikroskop som beskrevet ovenfor.
trypanblått Utelukkelse analysen
For å vurdere celleviabilitet, en 01:01 blanding av trypan blue (0,4%, Sigma) og serumfritt medium inneholdende 1% BSA ble tilsatt til cellene og inkubert ved romtemperatur i 10 minutter umiddelbart etter enten fjerning av bolle eller skape såret i monolaget. Bilder ble tatt fra periferien av bolle og langs hele kanten av såret ved bruk av et 10X objektiv plan Apo på Nikon Eclipse TE-2000E som beskrevet ovenfor.
Fabrikasjon av silikonpakninger
førti g Sylgard 184 silikon-elastomer (Ellsworth lim) og 4 g av Sylgard 184 elastomer herder ble omhyggelig blandet inntil uklar med bobler. Den uklare blandingen ble helt over i en steril 10 cm vevskulturskål til en dybde på 2-4 mm i høyde. Bobler ble fjernet ved å plassere formen i en 850 ml Desi-Vac beholder (Fisher) og evakuering av kammeret 60 ganger og tillater kammeret å stå i 10 min. Dette trinn ble gjentatt to ganger inntil blandingen var fri for bobler. Silikonblandingen ble tillatt å herde ved værelsestemperatur i 48 timer eller i en time på en 84 ° C varm plate inntil fullstendig polymerisert. Silikon malen ble forsiktig fjernet fra fatet og plassert på en ren og tørr overflate egnet til å klippe. For å fremstille smultring-formet pakning, ble en 6 mm biopsi slag som brukes til å generere en silikon sylinder, og en 2 mm biopsi dor ble brukt til å lage et mindre hull i midten av 6 mm sylinder. Silikon «smultringer» ble deretter vasket i Liquinox (fortynnet 1:10 i nanorent vann) i 15 minutter, renset 10 ganger med nanorent vann, vasket med 70% EtOH i 15 minutter og deretter lagret i frisk 70% EtOH inntil nødvendig.
smultring Migration /Invasion Assay
sterile dekkglass ble belagt med 20 pg /ml fibronektin, som beskrevet ovenfor. Rene, sterile silikon donuts fikk lov til å lufttørke før du legger på den belagte dekkglass. En endring i brytning på smultring-dekk grensesnitt kan ses som smultring følger av konforme kontakt. Subkonfluente celler ble serum-sultet natten før analysen. Cellene ble trypsinisert og resuspendert i den passende serumfritt medium inneholdende 1% BSA og telt ved bruk av et hemocytometer. Celler ble sådd ut ved konfluens (6000 celler /bolle for SKOV-3, COS-7, og HIO-80) i en 10 ul volum ved anvendelse av en steril gel-lasting spissen inn i sentrum av den smultringformet pakning, slik som å inneholde dem innenfor et begrenset område. Antall celler som kreves for å danne et konfluent monolag avhenger av ECM valgt, diameteren av den indre brønn bolle, og det sprer evnen av cellene, og derfor må bestemmes empirisk for hver cellelinje. Steril PBS ble lagt rundt pakningen for å forhindre fordamping av det lille volum av mediet. Etter at man følger over natten ble PBS aspirert, og smultringer ble forsiktig fjernet ved anvendelse av steril tang. Kjernene ble farget med Hoescht 33342 atom flekk (Invitrogen, 1:2000 i media) i 15 minutter ved 37 ° C. Fargingen media ble fjernet og erstattet med enten komplette medier eller medium inneholdende farmakologiske midler som er beskrevet i figuren sagn. For invasjons analyser, ble Hoescht-farget monolag overlagt med fenol-rød fri Matrigel og inkubert i 15 minutter ved 37 ° C for å tillate polymeriseringen. De innebygde celler ble deretter supplert med fullstendig eller behandlet media som i migrasjon analysen. Innledende bildene ble ervervet gjennom en 2X PlanApo objektiv på et Nikon Eclipse TE-2000E invertert mikroskop som beskrevet ovenfor. Celler ble enten behandlet med 10 ng /ml EGF eller høy serum (10%) for å stimulere migrasjon. Andre bilder ble ervervet etter de angitte tider og første og siste statlige bildeparene ble analysert ved hjelp av standardinnstillingene for en tilpasset skriftlig ImageJ makro (DonutQuant tilgjengelig som tekst S1). Kort, makrosentre og terskler både første og siste statlige bilder fjerner deretter vidtuteligger celler,
dvs.
celler utenfor sirkulære monolagene som er for langt til å kunne tilskrives migrasjon (
f.eks
celler som har løsnet og fløt inn fra et annet område av fatet). En maske av sentrert, første bildet er deretter opprettet og lagt på den endelige tilstand bilde og alle kjernene utenfor grensen av det opprinnelige bildet masken regnes som migrerte celler.
FRET Imaging
SKOV-3-celler som uttrykker den PKA aktivitet biosensor, pmAKAR3 [35], [36] ble skyllet og opprettholdt i Leibovitz L-15 medium for FRET avbildning. Celler ble fotografert på et Nikon Eclipse TE-2000E mikroskop med en 60 × /1,4 NA Plan Apo olje-nedsenking objektiv og avkjølt CCD kamera. CFP, YFP og FRET bildene ble anskaffet 10 timer etter starten av analysen. Oppkjøpet ble satt med 700 ms eksponering og 2 x 2 binning for alle tre oppkjøp. Bilder i hver kanal ble utsatt for bakgrunnen subtraksjon, og forholdstall på gul-til-cyan farge ble beregnet ved hjelp av FRET Analyzer ImageJ plugin. Pseudocolor bildene ble generert ved hjelp av ImageJ «Ratio» slå opp tabellen. Bilder var bakgrunnen-trekkes ved hjelp av «Trekk bakgrunn» -funksjonen i ImageJ, med en rullende ball radius på 500
Resultater
PKA aktivitet er økt i forkant av tilfeldig migrere Skov-3 celler
Tidligere arbeid hadde vist diskret aktivering av PKA i vandrende forkant av mange [13], [21], [22], men ikke alle [37] celletyper. For å avgjøre om PKA ble aktivert i forkant av trekkende EOC celler, ble Skov-3 menneskelige EOC celler transfektert med pmAKAR3, en plasmamembran-rettet FRET biosensor for PKA aktivitet [21], [36], og deretter belagt på FN-belagt dekkglass, stimulert med 10 ng /ml EGF i 4-6 timer (for å fremme tilfeldig, chemokinetic migrering), og overvåkes av levende celle bildebehandling. PKA aktivitet (som indikert av forhøyet FRET forholdstall) var faktisk diskret og dynamisk forhøyet innenfor forkanten av trekkende Skov-3 celler (figur 1 og Movie S1). Dette antydet at lokale økninger i PKA-aktivitet spiller en rolle i regulering av ledende dynamikk, og således migrering av aktivt trekkende EOC-celler. Denne hypotesen er understøttet av tidlig, utforskende eksperimenter hvor SKOV-3-celler ble utsatt for sårhelende eller ripe migrasjons assays i fravær eller nærvær av mye brukt inhibitorer av PKA aktivitet (H89 og mPKI, se Materialer og Metoder)) og forankring (StHt31, se Materialer og metoder). Undersøkelse av cellemorfologi kort tid etter start av disse analyser viste signifikante effekter av disse inhibitorene på forkanten morfologi og migrasjon (figur S1). Spesielt ubehandlede celler migrert inn sårede områder effektivt og med bred, rufser lamellipodia (figur S1 A og D). I kontrast, celler som PKA-aktiviteten ble hemmet med den ikke-selektive PKA inhibitor H89 eller den svært selektiv hemmer mPKI migrerte ikke effektivt og knapt angitt såret plass, som oppviser ledende kantstrukturer blottet for folder, men fylt av brenn adhesjon – fremkaller et klebemiddel, sprer fenotype mer enn en av migrasjon (fig S1B og D). Celler hvori PKA forankrings ble avbrutt ved StHt31 angitt såret plass til en større grad enn H89- eller mPKI-behandlede celler, men, i motsetning til kontrollceller, viste flere, ujevnt adskilte rusket kanter per celle (figur S1C og D). Sammen utgjør disse resultatene videre støttet hypotesen om at EOC cellemigrasjon kan kreve PKA aktivitet og forankring og garantert videre undersøkelser ved hjelp av mer sofistikerte tilnærminger og spesifikke reagenser.
Skov-3 celler ble transfektert med pmAKAR3, belagt på fibronektin-belagt retter over natten, stimulert med 10 ng /ml EGF i 4-6 timer, og deretter avbildes ved FRET mikroskopi. Bilder ble tatt hvert 30 sek, deretter pseudocolored ifølge FRET ratio (farge skala vist i ramme 0 «): dette montage viser rammer 2 min fra hverandre. For hele sekvensen, se video S1. Scale bar = 5 mikrometer.
EOC celle migrasjon er regulert av aktivitet og forankring av PKA
sårhelende migrasjon analyser, mens billig og enkelt å implementere, lider flere begrensninger, ikke minst som er dødelig skade på celler langs analysen fremre og fjernelse av den underliggende ekstracellulære matriks (ECM). Således kan en eksperimentell tilstand som resulterer i ineffektiv migrasjon i denne analysen reflektere, for eksempel, til økt følsomhet for bystander skade eller svikt produsere
de novo
matrise som å migrere. Derfor, for å fremme og bedre utforske kravet til PKA aktivitet og forankrings spesielt for EOC cellemigrering, har vi utviklet en forbedret versjon av en tidligere beskrevet migrering analyse [38] som lett og nøyaktig måler antall celler som migrerer i en radiell måte fra en definert sirkulær monolag (figur 2, se Materialer og metoder for detaljer). Vår analyse – innførte «smultring analysen», etter bolle-formet silikon pakninger som brukes til å etablere enkeltlaget – er pålitelig, rimelig, enkel å implementere, gjelder for nesten alle celletype, og skalerbar for å oppnå relativt høy gjennomstrømming og statistisk signifikans ved hjelp et lite antall celler (~6000), i forhold til andre sammenlignbare «release» assays (
f.eks
sårhelende analyser). I tillegg, i motsetning sårhelende analyser, vår tilnærming reduserer både denuding av ECM protein dekker migrasjon overflaten (figur S2) og den fatale skader celler på analysen periferien (figur S3) betydelig. For å øke nytten og enkel implementering av analysen, har vi utviklet en ImageJ makro ( «DonutQuant»; se tekst S1) for å raskt og automatisk kvantifisere migrasjon. Kort, makro trekker en innledende, «tid = 0» bilde (tatt umiddelbart etter smultring fjerning) fra en senere eller endelige bildet og teller kjerner utenfor «tid = 0 «område (figur 2C og D). Eksperimenter med bruk av cytokalasin D for å hemme aktin dynamikk (figur 2C og D) samt mitomycin C for å inhibere cellesyklusprogresjon (data ikke vist) har bekreftet at analysen måler migrasjon og ikke bare forskyvning av monolaget ved celledeling. Vi har brukt denne analyse for å måle migrasjon i en rekke forskjellige celletyper (herunder CHO-K1, COS7, HIO-80, HUVEC, MCF7, MCF10A, MDA-MB-231, MDCK, NIH3T3, REF52, og SKOV-3) med sammenlignbar letthet og effekt (A. McKenzie, S. Campbell, A. Howe, upubliserte observasjoner).
(A) en skjematisk fremstilling av den smultring migrasjon analyse hvori cellene blir sådd ut ved konfluens på en ekstracellulær matriks belagte dekkglass i en smultringformet silikonpakning. Etter at cellene er stabilt overholdt, blir pakningen fjernet, slik at cellene til å migrere radielt. Bilder av monolaget er tatt umiddelbart etter smultring fjerning og på ethvert tidspunkt deretter som er egnet til å tillate migrering av en gitt cellelinje. En tilpasset ImageJ makro benytter den første bildet som en subtraktiv maske for å bestemme antall migrerte celler i det endelige bildet tatt ved slutten av analysen. Detaljer er gitt i materialer og metoder. (B) Et bilde av fem bolle pakninger for en enkelt 25 mm dekkglass; dette gjør at lettvinte oppsett av replikere analyser for å øke gjennomstrømningen og generere statistisk signifikante data. (C) COS-7-celler ble utsatt for smultring migrasjon assay i nærvær av 2 uM cytokalasin D (cytoD) eller DMSO som en bærerkontroll. Representative bilder tatt ved begynnelsen (0 h) og enden (20 timer) av analysen, samt maskert (endelig minus start) bilder som viser migrerte celler er vist. (D) Antallet migrerte COS-7-celler ble beregnet ved bruk av ImageJ makro som beskrevet i Materialer og Metoder. Data representerer gjennomsnittet ± S.E. fem smultringer per dekkglass med tre separate Dekk per behandling. (* = P 0,001).
Ved hjelp av denne analysen undersøkte vi effekten av å hemme PKA eller AKAP funksjon på EOC celle migrasjon ved trans Skov-3 celler med plasmider som koder fluorescerende proteiner (EGFP, mCherry ) smeltet til peptid hemmere av PKA aktivitet eller forankring (se Materialer og metoder). Spesielt har vi brukt fluorescerende protein mCherry smeltet til PKA inhibitor protein PKI (mCherry-PKI) for å hemme PKA aktivitet [14], og EGFP smeltet til RI forankring disruptor (RIAD) [34] og superAKAP
er
(sAKAP
er
) [32] peptider til spesielt forstyrre type I og type II PKA forankring, henholdsvis. Plasmider som koder mCherry alene eller EGFP smeltet til egge RIAD eller sAKAP
er
sekvenser ble brukt som negative kontroller. Disse genetisk kodede reagenser tillate utsøkt spesifisitet ved inhibering av PKA-aktivitet [14] eller inhibering av forankrings gjennom både RI og RII subenheter [32], [34] samtidig som den muliggjør påvisning og overvåking av behandlede celler ved fluorescens mikroskopi. Å skille mellom type-I og type-II-forankring er hensiktsmessig og nødvendig, som type-I og type-II-PKA aktivitet kan regulere forskjellige signalveier [19], [20] og, mens begge typer PKA har vært implisert i migrering andre systemer [13], [21] – [23], [39], heller ikke har blitt vurdert i sammenheng med eggstokkreft migrasjon
etter transfeksjon ble cellene utsatt for smultring migrasjon analysen og etter. 24 timer, antallet transfekterte celler som migrerte, så vel som det totale antall transfekterte celler og totalt antall migrerte (transfektert og ikke-transfekterte) celler ble kvantifisert (figur 3). Kjøpet av disse tre tallene tillater ekspresjon av migrasjon som prosentandelen av migrerte, transfekterte celler i løpet av de totale migrerte celler ( «MX /TM «) eller, for å kontrollere for forskjeller i transfeksjonseffektivitet mellom plasmider, prosentandel av migrert, transfekterte celler enn det totale antall transfekterte celler ( «MX /TX»). Ved hjelp av denne metoden, ble Skov-3 migrasjon betydelig svekket når enten PKA aktivitet (figur 3A og B) eller forankring (figur 3C) ble hemmet ved hjelp av genetiske reagenser som er beskrevet ovenfor. Interessant, migrasjon ble hemmet nesten like ved avbrudd av forankring gjennom enten RI eller RII subenheter (Figur 3C), i samsvar med tidligere rapporter etablere viktigheten av både type-I og type II PKA forankring i migrasjon av andre celletyper [13] , [21], [22], [39]. Oppsummert disse dataene etablere nødvendigheten av PKA aktivitet og forankring for migrering av EOC celler.
(A) Skov-3 celler ble transfektert med enten tom mCherry plasmid eller mCherry-PKI, deretter underlagt donut migrasjon analyser. Representant terskel bilder av de migrerte celler (migrert, med kjerner pseudocolored grønn), den totale befolkningen i transfekterte celler (transfekterte), og et overlegg av disse to bildene er vist. Innfellinger skildre utvidelser av områdene som blir vist av rutene i toppfeltene. Således er den totale migrerte celler ( «TM») er vist i grønt, blir den totale transfekterte celler ( «TX») er vist i rødt, og den gule kjerner skildre transfekterte cellene som migrerte, dvs. migrerte og transfekterte celler ( «MX «) . (B) For celler transfektert med enten tom mCherry (MCH) eller mCherry-PKI (PKI), den gjennomsnittlige prosent (± S.E.) av migrerte transfekterte celler enn det totale antall migrerte celler ( «MX /TM «) ble beregnet. For å normalisere for transfeksjonseffektivitet, gjennomsnittlig prosent (± S.E.) av migrerte transfekterte celler enn det totale antall transfekterte celler ( «MX /TX») ble også beregnet. (* = P 0,05) (C), SKOV-3-celler ble transfektert med plasmider som koder for EGFP kondensert til inhibitorer av type I (RIADEN) eller type II (Saïs) PKA forankring, eller deres respektive egge kontroller (RIADEN scr, Saïs scr), og deretter underlagt smultring migrasjons analyser og analyser som er beskrevet i (A og B). (** = P 0,001)
Type-II PKA er ansvarlig for ledende PKA aktivitet under trekket
Gitt at PKA aktivitet ble beriket i forkant av trekkende SKOV- 3 celler og at hemming av PKA aktivitet og forankring gjennom både RI og RII forkrøplet migrasjon, vi søkt å finne ut om forkanten PKA aktivitet ble formidlet gjennom enten type-i eller type II forankring. For å vurdere virkningen av RI eller RII-AKAP forankring avbrudd på lokalisering av PKA aktivitet under EOC migrasjon, SKOV-3-celler ble ko-transfektert med plasmider som uttrykker pmAKAR3 og genetiske inhibitorer av typen-I og type-II R-subenheten forankrings (RIAD og sAKAP
er
, henholdsvis) smeltet til mCherry. Den mCherry fluorescensspektra ikke overlapper med de av enten YFP eller CFP, og således tillate at disse fluorescent-merkede forankringsforstyrrende som skal brukes i forbindelse med FRET mikroskopi. Når transfekterte cellene ble utsatt for smultring migrasjonsanalysen etter 10 timer hvoretter cellene ble fotografert via FRET mikroskopi som er beskrevet ovenfor. Celler som uttrykker både forankringen disruptor og PKA reporter transfektert plasmider ble fotografert og CFP, YFP, slite, og mCherry bildene ble anskaffet. For å kvantifisere prosentandelen av celler som oppviser ledende kant PKA aktivitet, den gjennomsnittlige FRET-forholdet ved den fremre kant (FRET
LE, målt 5-25 um fra forsiden av cellen) ble målt i forhold til FRET-forholdet i cytoplasma (FRET
cytomegalovirus, målt 25-50 um fra forsiden av cellen (figur 4E)). Ratio verdier ble binned til høy (FRET
LE /FRET
CYTO ≥1.5), moderat (FRET
LE /FRET
CYTO mellom 1,2 og 1,5), og ingen (FRET
LE /FRET
CYTO 1,2) ledende PKA aktivitet.
