Abstract
Tidlig påvisning av svulster kan forbedre utfallet av svulst behandling. En av de vanligste spørsmålene i kreftdiagnostikk er hvor mange celler kan oppdages ikke-invasiv i et levende dyr. Selv om mange faktorer begrense slik deteksjon, å øke lysemisjonen fra celler som er en av de mest effektive måter å overvinne disse begrensningene. Her beskriver vi utvikling og utnyttelse av en lentiviral vektor som inneholder forbedret ildflue luciferase (
luc2
) genet. De resulterende enkeltcellekloner fra mus brystkjerteltumor (4T1-luc2) viste stabil lysemisjon i området fra 10 000 fotoner /sekund /celle. I noen tilfeller kan individuelle 4T1-celler luc2 inn under huden til en
nu /nu mus
kunne påvises ikke-invasiv måte ved hjelp av et avkjølt CCD-kamera i noen tilfeller. I tillegg viste vi at bare få celler er nødvendig for å utvikle tumorer i disse musene og tumorprogresjon kan overvåkes rett etter at cellene blir implantert. Betydelig høyere luciferase aktivitet i disse cellene tillatt oss å påvise mikrometastaser i begge, syngene Balb /c og
nu /nu
mus
Citation. Kim JB, Urban K, Cochran E, Lee S Ang A, Rice B, et al. (2010) ikke-invasiv Påvisning av et lite antall Bioluminescent kreftceller
In Vivo
. PLoS ONE 5 (2): e9364. doi: 10,1371 /journal.pone.0009364
Redaktør: Alexander Swarbrick, Garvan Institute of Medical Research, Australia
mottatt: 12. mai 2009; Godkjent: 02.01.2010; Publisert: 23 februar 2010
Copyright: © 2010 Kim et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble finansiert internt i Caliper Life Sciences og Momenta Pharmaceuticals. De bevilgende myndighet gitt reagenser, forskning plass og ressurser for denne studien. Men forfatterne utelukkende involvert i studiedesign, datainnsamling og analyser, eller utarbeidelse av manuskriptet. Caliper Biovitenskap og Momenta Biopharma ble enige om å publisere disse dataene i et vitenskapelig tidsskrift. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Jae-Beom Kim, Konnie Urban, Steve Lee, Bradley Rice, Adam Bata, Kenneth Campbell, Richard Kaffe, Alex Gorodinsky, Zhan Lu og Peter Lassota er ansatte i Caliper Life Sciences. Han Zhou, Edward Cochran og Takashi Kei Kishimoto er ansatte i Momenta Pharmaceuticals Inc. Forfatterne er enige om å PLoS ONE Regler på datadeling politikk. Det er ingen patentsøknad innlevert ved hjelp av data fra denne studien.
Innledning
Påvisning av svulster på tidlige stadier er avgjørende for effektiv svulst behandling og for å studere tumorigenesis [1], [2] , [3]. Tradisjonelt ble tumorvekst vurdert ved hjelp av mekaniske eller elektroniske calipers å ta fysiske målinger av subkutane humane tumorer som vokser i immunsupprimerte mus [4]. Denne metoden egner seg imidlertid bare for palpable tumorer som vokser under huden på dyrene. Dypere tumormasser, slik som osteosarkomer innkapslet av benet, er ikke mottagelig for å dirigere fysiske målinger. Selv i subkutane modeller, tumorbelastninger kan ikke bli nøyaktig kvantifisert ved hjelp av fysiske målinger, fordi ødem og nekrotiske sentre vil bidra til økningen i tumorstørrelse [5]. Ortotopiske faste tumormodeller omgå disse hindringene og tillater forholdsvis nøyaktig vurdering av tumorbelastninger ved veiing av skåret ut, «renset» svulster etter ble dyrene avlivet. Klassiske ortotopiske modeller er upraktisk for evaluering av forbindelsens virkning siden de krever et stort antall dyr som skal avlives ved hvert tidspunkt. Tilsvarende, identifisering av svulster og kvantifisering av tumorbyrden i modeller av metastase etterspørsel uttømmende og kjedelige histologiske analyser [6], [7], [8].
Ikke-invasiv hele kroppen bioluminesens imaging (BLI) tillater gjentatt sanntid
in vivo
overvåking av tumorvekst i forsøksdyr, uavhengig av tumor steder. I motsetning til fluorescens, oppviser BLI minimal bakgrunnssignalene fra dyrevev [9]. Derfor kan BLI oppdage relativt svake signaler med høy signal til bakgrunn ratio. På grunn av sin allsidighet har BLI blitt tatt i bruk for å studere preklinisk effekt av legemiddelkandidater [10], [11], [12], [13], så vel som ulike aspekter ved mammalske biologi via rapportør assays [14], [15].
Nylig, firefly (
Photinus pyralis
) luciferase ble re-konstruert for å ytterligere optimalisere ekspresjon i pattedyrceller. Sammenlignet med tidligere generasjoner av luciferase, den nye versjonen (
luc2
) leverer mer enn en firedobling i lys utslipp som ble oppnådd ved kodon optimalisering og fjerning av potensielle transkripsjonsfaktor bindingssteder [16]. Vi postulerte at enkelte kreftceller kunne påvises
in vivo
ved å utnytte den økte bioluminescence av
luc2
. For å nå dette målet, utviklet vi en lentiviral vektor der
luc2
uttrykk drives via den menneskelige ubiquitin C promoter [17]. Konstruksjonen ble deretter stabilt transfektert inn i 4T1 musebrysttumorcellelinje [18], [19]. Flere stabile, enkelt-cellekloner (4T1-luc2) ble deretter isolert med lysemisjon i området fra 10 000 fotoner /sekund /celle. Her rapporterer vi at, i det minste i noen tilfeller, deteksjon av en enkelt kreftcelle
in vivo
ved hjelp av én av disse luc-2 merkede kloner ble oppnådd. Vi viser også utvikling av tumorer fra bare noen få celler implantert i
nu /nu-mus
og deteksjon av metastaser i syngene Balb /c-mus. Til vår beste kunnskap, er dette den første rapporten om påvisning av en enkelt bioluminescent celle
in vivo
ved hjelp av en ikke-invasiv avbildningsmetode. Slike lyse celler kan effektivt brukes til å overvåke effektiviteten av legemiddelkandidater i modeller for metastasering og ortotopiske tumormodeller, for å spore metastatisk migrering av kreftceller, og kan også utnyttes for nøyaktig å fastslå hvorvidt en hvilken som helst restsykdom forblir etter behandlingen.
Resultater
Generering av et lentiviral vektorsystem og Stabile 4T1-luc2 cellelinjer
en lentiviral vektor som inneholder firefly
luc2
genet konjugert til et menneske ubiquitin C promoter ble konstruert for å generere stabile bioluminescerende kreftcellelinjer [16], [17], [18]. Musebrystsvulst 4T1 celler ble deretter transfektert med lentiviral vektor og stabile kloner ble valgt ved hjelp puromycin (4T1-luc2). Åtte kloner ble valgt for videre analyser og deres luciferasepreparater aktiviteter ble overvåket i fire uker uten seleksjonsmarkør. Selv om det var variasjon blant de klonene, de fleste av dem kloner slippes ut mer enn 3000 fotoner /sek /celle av lys. Tatt i betraktning at de fleste cellelinjer merket med tidligere generasjoner av luciferase slipper ut mindre enn 250 fotoner /sek /celle, våre luc2 kloner utstilt betydelig høyere nivå av lys-utslipp [20]. Overraskende, en klon (C26) til å begynne utsendes så mye som 52 000 fotoner /sekund /celle men dens lysemisjonen ble redusert til 6400 fotoner /sek /celle etter fire uker (figur S1A). For å bekrefte at ingen endring av cellulær fysiologi skjedde under merking /kloning prosessen, sammenlignet vi kloner til de opprinnelige foreldre 4T1 celler på flere ulike nivåer. Først undersøkte vi vekst mønstre. Fra de åtte første omgang valgte kloner, vi valgte to linjer (C27 og C38) og sammenlignet deres vekstmønster til de foreldre 4T1 celler. Begge linjene hadde lignende doblingstidene til foreldre celler (12,6 time dobling tid for begge kloner, mot 12,0 timer for de opprinnelige 4T1 celler).
Vi har også undersøkt andre kritiske parametere av cellulær fysiologi, inkludert effektene av ATP forbruk . Siden luciferase anvender et molekyl av ATP for å fremstille hver enkelt foton av lys, kan høye nivåer av lysemisjon være skadelig for cellens metabolisme på grunn av utarming av sin ATP bassenget. For å teste hvorvidt den høye lys produksjon påvirker cellefysiologi, observerte vi cellevekst i fire dager i nærvær av høye konsentrasjoner av luciferase substrat, D-luciferin (150 og 300 pg /ml /dag). Resultatene viste at i nærvær av D-luciferin, 4T1-luc2 kloner viste lignende vekstmønstre til de av celler dyrket uten D-luciferin og til foreldre 4T1-celler (figur S1B, C, D). Dette tyder på at 4T1-luc2 celler kan tåle forbruk av ATP som kreves for høy lys utslipp uten en betydelig effekt på cellens ATP basseng.
Siden klone C26 viste avtagende luciferase aktivitet over tid, vi prøvde den andre runden av begrenset fortynning enkelt celle kloning fra den opprinnelige blandet populasjon. Fire lyse kloner ble utvalgt og deres luciferase-aktivitet (lys utslipps) ble overvåket i seks uker uten seleksjonstrykk (figur 1 A, B). Alle kloner opprinnelig produsert mer enn 40 000 fotoner /sekund /celle; da lysemisjonen ble redusert til 10 000 fotoner /sekund /celle, og stabilisert seg på dette nivået. Den holdt seg stabil i fire uker i fravær av puromycin (figur 1B). Fra disse kloner ble 1A4 klone (4T1-luc2-1A4) valgt for videre studier. Den vekstmønster av 4T1-luc2-1A4 var sammenlignbar med den til foreldre 4T1-celler i nærvær eller fravær av D-luciferin (figur 1C, D, E). For å løse årsaken til den opprinnelige reduksjonen av lysemisjon i 4T1-klon luc2-1A4, utførte vi begrenset fortynning kultur i 96-brønners plater. Når celler vokste til omtrent 25% konfluens, undersøkte vi luciferase-ekspresjon ved selvlysende avbildning. Hver godt som inneholder celler viste luciferase aktivitet. Disse resultatene indikerer at den innledende reduksjon av luciferase-aktivitet var ikke på grunn av tap av luciferase-ekspresjon i enkelte celler av klon (fig S2).
(A) Dannelse av 4T1-celler luc2-1A4. Mouse mammary tumor-4T1-celler ble transfektert med en vektor som inneholder lentiviral forbedret luciferase-2 under kontroll av den humane ubiquitin C-promotoren [16], [18]. Puromycin-resistente kloner isolert og deres luciferase uttrykkene ble screenet ved bioluminescens. To runder med kloning generert 4 enkelt celle kloner av 4T1-luc2. Luciferasepreparater aktiviteter ble målt ved hjelp av en IVIS Spectrum (Binning: med, f stopp: 1, eksponeringstid: 1 sek). En typisk Bioluminescens bilde for testing av stabiliteten av luciferase-ekspresjon er vist. Total fluks (fotoner /sek) ble kvantifisert ved hjelp av levende bilde programvare 3.0. Clone 4T1-luc2-1A4 ble valgt og brukt for videre studier. (B) Stabilitet av luciferase-aktivitet av fire 4T1-luc2 kloner. Cellene ble dyrket i 6 uker i vanlig media uten puromycin og deres lys utslipp ble overvåket ukentlig. Alle kloner viste mer enn 7000 fotoner /sek /celle av lysemisjon gjennom hele testperioden. (C) Vekst kurvene i 4T1-luc2-1A4 klone og foreldre 4T1 celler. Celler ble dyrket i 4 dager i vanlig dyrkningsmedium uten puromycin. Totalt antall celler over tid ble plottet på en logaritmisk skala. Begge cellelinjer viste lignende vekstmønstre og doblingstidene. (D, E) Veksten av 4T1-klon luc2-1A4 og paren 4T1-celler i nærvær av D-luciferin. Celler ble foret med D-luciferin en gang om dagen (150 ug /ml /dag, D) eller to ganger om dagen (300 pg /ml /dag, E), respektivt, høstet ved hvert tidspunkt og telles. Tilstedeværelse av det overskytende av D-luciferin ikke påvirke den samlede veksten mønstre av 4T1-luc2 celler.
Ikke-invasiv påvisning av et lite antall celler i
nu /nu
mus
Fordi 4T1-luc2 celler viste ekstremt høye lys utslipp, siden vi forsøkte å oppdage små antall av disse cellene
in vivo
. Til å begynne med ble de 4T1-celler luc2-1A4 fremstilt ved anvendelse av en seriefortynning metode og ble implantert i begge flanker av den kvinnelige nu /nu-mus (figur 2). Forskjellig antall celler ble implantert på hver implantasjoner. Seks implantasjoner ble utført for hver rekke av celler (3, 5, 10, og 50 celler). Bioluminesens bildene ble tatt umiddelbart etter implantasjoner. Ved hjelp av en svært følsom avkjølt CCD-kamera, var vi i stand til å oppdage så få som tre celler i dette forsøket (Figur 2A-D, røde stiplede sirkler). I noen tilfeller, men vi har ikke funnet noen meningsfulle signaler fra nettstedene til implantasjon (Fig 2A-D, gule stiplede sirkler). Dette kan tilbakeføres til celledød umiddelbart etter implantering eller til iboende variabilitet av seriefortynning metode når det tilsiktede antall celler er meget liten (figur 2A-D, gule sirkler). Separat, vi tok PC3M-luc-C6 som var en av de skarpeste cellelinjer (~250 fotoner /sek /celle) som genereres av oss så langt (ved hjelp av flere runder med transfections av pGL3) og sammenlignet den med 4T1-luc2-1A4 celler , ved å implantere begge inn i SCID-bg mus (Figur S3). Resultatene illustrerer at bioluminescent signalene fra 10
2 4T1-celler i luc2-1A4 hårete mus var lett synlig, mens ikke noe signal ble detektert fra det samme antall PC3M-luc-C6-celler.
( AD) Definert antall celler ble implantert subkutant i rygg flanke regioner av kvinnelige nu /nu mus [1]. Hver mus mottok to implantasjoner. Innfellinger angir antall celler implantert. D-luciferin ble injisert i mus umiddelbart etter implantering og bioluminescerende bildene ble tatt (t = 0) ved anvendelse av en IVIS spektrum (FOV, A, binning; liten, f Stopp; 1, eksponeringstid, 5 min). (E-H) Etter 6 timer etter implantasjon, alle musene ble gjen avbildes med samme innstillinger av IVIS spektrum (t = 6t). Røde sirkler representerer implantasjoner som hadde bioluminescent signaler høyere enn autoluminescence. Gule sirkler indikerer implantasjoner som ikke genererer noen meningsfulle signaler muligens på grunn av umiddelbar celledød. (I) Korrelasjon mellom antall implanterte cellene og den totale fluks fra de implantasjonssteder. Bioluminescent signalene ble kvantifisert ved hjelp av levende bilde programvare 3.0 og plottet mot antall celler. Den målte intensitet av biolumine var direkte proporsjonal med antallet av implanterte celler. Stjerne (*) indikerer vev autoluminescence.
Seks timer etter implantasjoner, vi re-avbildes samme sett av dyr (Fig 2E-H). Som forventet, basert på det fiendtlige etter implantasjon miljø, 4 områder av 10- og 50-celle implantasjonssteder mistet deres opprinnelige bioluminescerende signaler (Fig 2G, H). Overraskende, men vi var i stand til å oppdage signaler fra 3- og 5 celle implantasjoner (figur 2E, F). Våre analyser av bilder som er tatt umiddelbart etter implantering (t = 0) indikerer at den totale fluks fra implantasjonssteder var direkte proporsjonal med antall celler implantert (Fig 2I). Dette er konsistent med de andre data (ikke vist) som viser lineær sammenheng mellom lysemisjonen og antall celler platet
in vitro
. Basert på disse resultatene, viste vi at bioluminescence måling er en plausibel metode for å oppnå ikke-invasiv monitorering av tidlig tumorvekst
in vivo
.
Påvisning av en enkelt Bioluminescent 4T1-luc2 Cell
in vivo
etter å ha bekreftet non-invasiv påvisning av tre celler
in vivo
, utfordret vi oss selv til å oppdage en eneste 4T1-luc2-1A4 celle etter subkutan implantasjon. For å eliminere den eksperimentelle feil og for å legge til nøyaktighet i bestemmelsen av antallet av implanterte celler, anvendte vi en mikropipette for å implantere en enkelt 4T1-luc-2-1A4 celle. Først ble de 4T1-luc2-1A4 celler trypsinert og belagt på en cellekultur parabolen. Deretter ble individuelle celler plukket opp og implanteres ved hjelp av en mikropipette inn i subkutane spalter som er dannet i flankeområdene hos mus. Mus ble delt i to grupper: fire mus ble implantert med enkeltceller, og fire andre mus ble implantert med 10 celler hver (fig S4C, D). Dyrene ble deretter underkastet bioluminescens avbildning umiddelbart etter implantasjon. I noen tilfeller var vi i stand til å oppdage en eneste 4T1-luc2-1A4 celle (figur 3A-C og figur S4A, B). På hver av de tre uavhengige, sekvensielle bilder av den samme enkelt celle registrert vi en total fluks i området fra 460 til 528 fotoner /sekund. Linje profilering Analyser av det registrerte fluks fra en enkelt celle avslørte et signal til bakgrunnsforhold på 6 til 1, med det signal klart stammer fra implantasjonsstedet, (figur 3D, E). Derfor konkluderte vi med at bioluminescent signal faktisk stammer fra en enkelt 4T1-luc2-1A4 celle. Mangelen på signal fra de andre tre steder i hver gruppe kan være knyttet til hurtig celledød.
(A-C) Bioluminescent signal fra et enkelt 4T1-luc2-1A4 celle
in vivo
. En enkelt celle ble implantert i baksiden av en
nu /nu
mus. D-luciferin ble injisert i mus intraperitonealt og bioluminescerende bildene ble tatt ved bruk av en IVIS spektrum (FOV: C binning; liten, f Stopp; 1, eksponeringstid, 5 min). Bilder for pre- og post luciferin injeksjon ble vist i paneler (A) og (B), henholdsvis. Forstørret bilde av den stiplede området fra panel (B) er vist på panel (C). Den stiplede sirkelen representerer enkelt celle signal. Stjernen (*) indikerer bakgrunnssignalet fra tarmen. (D, E) Linje profilering analyse av enkelt celle signal. Lysemisjon ble plottet langs linjen vist i panel (D). Topp signal i panelet (E) representerer den lysemisjonen fra en enkelt 4T1-luc2-1A4 celle. (F) Tumor utvikling fra fem 4T1-luc2-1A4 celler. Celler ble implantert subkutant (ved hjelp av en mikropipette) inn i den dorsale flanke regionen til en
nu /nu mus
. Bioluminescent bildene ble først tatt før D-luciferin injeksjon (Pre-luciferin). Dyret ble deretter fotografert på dag 0 og dag 42. (G) Overvåking av tumorvekst fra 5 celler av 4T1-luc2-1A4. Bioluminescent signalene ble kvantifisert ved hjelp av levende bilde programvare og plottet mot fysiske målinger tumor volum av en caliper. Tumor var ikke opplagt til dag 27 etter implantasjon mens bioluminescent signaler ble oppdaget fra dag 0. Merk at total fluks ble plottet i en logaritmisk skala. (H) Tumor utvikling fra 10 celler av 4T1-luc2-1A4. Cellene ble implantert subkutant (ved hjelp av en mikropipette) på baksiden av en
nu /nu
mus. Bakgrunnssignalet er vist i pre-D-luciferin injeksjon bilde (Pre-luciferin). Den tumorvekst ble overvåket i 40 dager med en IVIS Spectrum og en caliper. (I) Overvåking av tumorvekst fra 10 celler av 4T1-luc2-1A4. Tumor volum ble målt ved hjelp av en caliper og plottet mot bioluminescent signaler som ble kvantifisert ved hjelp av levende bilde programvare. Tumor var ikke opplagt til dag 29 etter implantasjon. Tvert imot, bioluminescent signalene var forskjellig fra dag 0 implantasjon.
Tumor Utvikling fra små bestander av 4T1-luc2 Cells
Etter å påvise en enkelt celle
in vivo
ble musene implantert med 1-50 celler overvåkes i lengre tidsrom for å påvise mulig tumorvekst. Vi antok at implantering av et større antall celler ville omgå problemet at fiendtlige etter implantasjon miljøer stede til mindre antall celler. Gitt at rutinen kreft implantasjon prosedyrer utnytte 0,5 til 10 millioner av celler i subkutane tumormodeller, kan vi ikke forvente svulstene oppstår fra slike små antall celler. Til vår overraskelse, to mus som var implantert med 5 og 10 celler utviklet solide tumorer. Vi fortsatte å avbilde disse musene, og når svulstene ble håndgripelig, vi også fysisk målt sine dimensjoner ved hjelp av standard målepunktene. Svulstene oppstår fra fem-celle og 10-celle implantasjoner kunne ikke påvises med calipers før dag 27 og dag 29, henholdsvis (figur 3G, I). Imidlertid, ikke-invasiv avbildning synlig lys, tillot oss å påvise og kvantifisere tumorbelastninger kontinuerlig fra tidspunktet for implantasjon (figur 3F, H). Disse data viser klart at tumorvekst kan overvåkes ved hjelp av ikke-invasiv avbildning bioluminescens så snart cellene blir implantert i et dyr, selv når så lite som fem celler er implantert.
metastaser av 4T1-celler luc2-1A4 i syngene Balb /c mus fra ortotopiske Implantasjon inn i melkefettpute
for å teste metastatiske egenskaper til 4T1-luc2-1A4 celler, vi orthotopically implantert disse cellene i brystfettputer av kvinnelige nu /nu mus ( 5 × 10
5 celler per mus, n = 9). De primære tumorer vokste raskt og utviklet metastatiske lesjoner som kan bli detektert ved å bruke bioluminescens bildedannelse ved dag 27 (figur 4). For å bekrefte metastase av kreftceller i lungene, isolert vi lunge vev på dag 27 etter implantasjon og tok
ex vivo
bilder (figur 4B). I tillegg, utførte vi histologiske analyser av formalin-konservert, parafinkåret vev. Resultatene viste at pleura og subpleural områder av lungene ble infiltrert med ark med dårlig differensierte neoplastiske celler som viser at selvlysende avbildning effektivt kan påvise mikrometastaser i mus (figur 4C, D). Det er imidlertid vanskelig å spekulere nøyaktig hvor mange celler som bodde i metastasized tumormasser basert på lysemisjonen registrert
in vivo
ettersom det utsendte lys blir dempet og spredt avhengig av bane som skal gjennom vev, og den nøyaktige plasseringen av disse svulstene er ikke klarlagt.
(A) Female nu /nu mus ble inokulert med 5 × 10
5 4T1-luc2-1A4 celler orthotopically i magemelkefettputer [1] . Bioluminescent bildene ble tatt i lengderetningen. På post-implantasjon dag 27, mikrometastaser påvist i lungene (piler) (B) Lungene ble isolert på post-implantasjon dag 27 og
ex vivo
bildet ble tatt. (C, D) lunge vev ble fiksert i formalin og innstøpt i parafin. H E farging ble utført og analysert. Panel D representerer den stiplede området i panel C.
Deretter fikk vi bekreftet deteksjon av metastaser ved bioluminesens via fysisk disseksjon. Vi skapte en annen gruppe av Balb /c mus, inn som melkefettputer vi implantert 5,0 × 10
4 4T1-luc2-1A4 celler (n = 16). Primære tumorer ble deretter resekterte ved etter implantasjon dag 10 for å stoppe veksten av tumorene i de fettputer, og bioluminescerende bilder ble tatt på forskjellige post-reseksjon (PR) tidspunkter (PR-dagers-5, 8, 12, 15, 19, 22). Våre data viste at svulster metastasert til de sekundære steder i kroppen, og fortsatte å vokse der (figur 5A). Tumorveksten ble overvåket i lengderetningen ved å kvantifisere Bioluminescens signalene fra hele kroppen (figur 5B). Resultatene viste kontinuerlig økning av lyset utslipp før og etter reseksjon av de primære svulster, som bekrefter at overvåking Bioluminescens signaler er en ideell måte å spore tumormetastaser.
(A) metastaser av 4T1-luc2-1A4 svulster i Balb /c-mus. 5,0 x 10
4 celler ble orthotopically implantert i melkefettputer av mus (n = 16) [1]. Ventral Bilder ble tatt på tre tidspunkter etter implantasjon (PI-dager: 4, 7, 8). Primære tumorer ble resektert ved PI-dag 10 og bilder ble tatt igjen ved forskjellige stolpe-reseksjon tidspunkter (PR-dager: 5, 8, 12, 15, 19, 22). To representative mus (C1M2 og C4M4) er vist. Den tilsynelatende nedgang på bioluminescence signaler på PR-dag 12 var knyttet til endring av fargeskalaen (se panel B). Primær tumorreseksjon tidspunkt er angitt med den røde linjen som skiller de pre-og pot-reseksjon bilder. (B) Tomter bioluminesens signaler kontra tid for mus C1M2 og C4M4. Hele kroppen Bioluminescens signaler om mus C1M2 (blå linje) og C4M4 (oransje linje) ble kvantifisert og plottet i en logaritmisk skala. Quantitations bioluminesens signaler før og etter reseksjon av de primære svulster vises.
Diskusjoner
Xenografting av luciferase-merket kreftceller er allment akseptert i modeller av metastaser og i ortotopiske modeller. Som diskutert ovenfor, selvlysende avbildning av luciferase-merkede kreftceller har den ekstra fordel i forhold til tradisjonelle metoder for vurdering av tumorbyrden ved at den tillater ikke-invasiv påvisning og kvantifisering av tumorer i levende dyr som middel for å vurdere medikament-effektivitet [21], [22 ], [23]. Til tross for det faktum at normalt vev bidra lite bakgrunn i bioluminescens avbildning, noe som øker lysemisjonen fra cellene av interesse er alltid ønskelig siden det forbedrer følsomheten for påvisning av tumorceller. Økt følsomhet tillater mindre antall tumorceller som er til stede i tidlige stadier av tumorprogresjon som skal påvises. Dette har tenkes betydelig klinisk relevans gitt at tidlig oppdagelse, når kombinert med tidlig behandling, har blitt korrelert med bedre prognoser. Verktøyene som beskrives her tillater en å sammenligne effekten av en gitt farmakologisk intervensjon på tidlig stadium primære svulster, sent stadium primære svulster og metastaser.
Heri rapporterer vi utviklingen av en lys 4T1-luc2 cellelinje ved hjelp av forbedret luciferase (
luc2
) og lentiviral teknologi. I våre forsøk på å detektere små antall av celler, vi først brukte en seriefortynning fremgangsmåte og kunne påvise ned til 3-celler
in vivo
. Oppmuntret av disse resultatene, utfordret vi oss selv til å oppdage en eneste 4T1-luc2-1A4 celle etter subkutan implantasjon via mikroinjeksjon. På grunn av at signalet fra en celle som var plassert i nærhet til tarmen, som oppviser et indre, om enn med variabel auto-bioluminescens, våre bilder av enkle celler inneholder både signaler fra cellen, samt bakgrunn fra tarmen (figur 3B). Imidlertid, som vist på bildene av 5- og 10-celler, når antall celler økes, signalene fra cellene gikk raskt bakgrunnssignaler fra tarmen. I løpet av utarbeidelsen av dette manuskriptet, Rabinovich
et al
. viste påvisning av tre konstruerte murine T-lymfocytter
in vivo
i en subkutan transplantasjon [24]. Mens anvendelsen av den elegante systemet beskrevet av Rabinovich
et al
. ble utviklet for å oppnå effektiv transduksjon for en bestemt celle-undertypen, har vi utviklet en enkel og universell vektor for å omsette alle typer prolifererende og ikke-prolifererende celler. Videre til vår beste overbevisning, er vår rapport den første som viser deteksjon av en enkelt bioluminescent kreftcelle
in vivo
.
På grunn av høy grad av luciferaseekspresjon øker følsomheten av cellen deteksjon i levende dyr, kan denne teknologien brukes direkte til primærcelle og stamcelle deteksjon
in vivo
, inkludert kreft stamceller [25], [26], [27]. Lentivirus-teknologi kan tenkes å være nyttige for merking av stamceller, siden det kan betydelig redusere håndtering og dyrking av disse cellene. Våre resultater viser at så få som 5 og 10 celler kan vokse og danne svulster i dyr. Disse svulstene kan overvåkes ved hjelp av bioluminesens bilde fra den dagen implantasjon. Tidligere ble 4T1-celler transformert med luciferase og deres tumormetastaser ble visualisert ved hjelp av optisk avbildning [28]. Selv om denne studien viste ikke-invasiv overvåking av tumormetastaser, denne studien muliggjør tidligere påvisning av tumormetastaser, og gjør det mulig å følge tumordannelsesprosessen rett fra celle implantasjonen (dag 0 sammenlignet med 6 uker). Videre våre resultater tyder på at merking og sporing av kreft som vokser fra en enkelt kreft stamcelle er gjennomførbart. I tillegg kan denne teknologien også anvendes mer generelt for å følge skjebnen til en enkelt stamcelle implantert i et dyr. Videre kan prosessen med narkotika screening for enten små molekyler eller biologiske som er rettet mot kreftstamceller bli vesentlig fremskyndet siden bioluminescence tillater følgende vekst av svulster
in vivo
uker før de blir følbar.
Lyst lysende celler gir også en bedre metode for påvisning av mikrometastaser i et dyr, og dermed gjør modeller av metastase mer nøyaktig og tillater prediktive modeller som skal brukes til evaluering av legemiddelkandidater som tar sikte på å bekjempe metastaser. Når 4T1-luc2-1A4 celler ble implantert i syngene Balb /c mus, var vi i stand til å oppdage flere mikrometastaser i sekundære områder. Når primære tumorer ble kirurgisk fjernet ved 27 dager etter implantasjon, kan vi følge veksten av små, metastatiske svulster i fravær av den dominerende signal fra den primære tumor. Lysere celler kan redusere tiden og innsatsen som kreves for å identifisere tumormasser i et dyr, og kan også være verdifulle i å studere kreft microenvironments, særlig i kombinasjon med andre ikke-invasive fluorescens-basert leselig.
Til dags dato har vi merket mer enn et dusin humane og murine tumorcellelinjer ved hjelp av det beskrevne system lentiviral (data ikke vist). Alle merkede cellelinjer viste signifikant høyere luciferase-ekspresjon sammenlignet med cellelinjer som er merket med tidligere generasjon av luciferase og konvensjonelle transfeksjonsmetoder (data ikke vist). En annen fordel med disse nylig konstruerte cellelinjer er det ikke noe antibiotika utvalg er nødvendig for å opprettholde stabil luciferase ekspresjon. I motsetning til den populære virale promotere så som SV40 eller CMV, er human ubikvitin promoter C mer motstandsdyktig mot genet Slå i pattedyrceller [29]. Vi har brukt vår teknologi for å kunne merke tilhenger, samt suspensjon cellelinjer, og vi tror at det utgjør et universelt verktøy for effektiv innføring av luciferase inn i nesten hvilken som helst celle. Siden lentivirale vektorer kan introdusere gener som er av interesse inn i delende så vel som ikke-delende celler, kan vår teknologi kan lett brukes til å merke ikke bare stamceller, men praktisk talt alle celler avledet fra pasienter, som deretter kan brukes til forskning, eller for diagnostisk formål.
Materialer og metoder
Generering av Lentivirus Vector
Forbedret luciferase 2 (
luc2
) cDNA var fra pGL4.20 vektor (Promega, WI ) [16]. Luciferase 2 cDNA ble spaltet med Hind III Xba I og ligert inn i pUB6-V5-HisB vektor (Invitrogen, CA). Et fragment generert av Bgl II og BstB-fordøyelse av pUB6-luc2 ble ligert inn i en modifisert pLPCX vektor (Clontech, CA). En lentiviral vektor som bærer human ubikvitin promoter C og luc2 cDNA ble dannet ved å sette inn Bgl II EcoRI-fragmentet fra ovenfor konstruere til Bel I-amp; EcoR av den modifiserte pLKO.1 vektor (Sigma-Aldrich, MO) [18], [19].
Cell Culture
Mouse mammary gland tumorcellelinje 4T1 ble oppnådd fra ATCC (Manassas, Virginia). Celler ble dyrket i høy glukose RPMI 1640 medium (ATCC). PC-3M-luc-C6-celler ble dyrket i minimalt essensielt medium (ATCC) (For supplerende data) [30]. Alt medium ble supplementert med 10% føtalt bovint serum (Hyclone, Utah) uten antibiotika. Vekstkurver ble generert ved såing 50.000 celler i T25 kolber. På hvert tidspunkt ble cellene trypsinert og telt ved bruk av en automatisk celleteller (Nexcelom, MA).
