Abstract
KRAS
mutasjonsstatus er ansett som en negativ prediktiv markør for responsen på anti-EGFR terapi i kolorektal kreft (CRC) pasienter. Men motstridende data finnes om variabel respons til EGFR-målrettet terapi. Effektene av onkogene
KRAS
på nedstrøms mål ble studert i cellelinjer med forskjellige
KRAS
mutasjoner. Celler som inneholder et enkelt
KRAS
G13D
allel viste mest tumorigent profil, med konstitutiv aktivering av nedstrøms veien, gjør dem EGF-svarer. Omvendt,
KRAS
A146T
celler viste en full EGF-respons i form av signaloverføringsveier, celleproliferasjon, migrasjon eller heft. Videre den globale acetylome av CRC celler var også avhengig av
KRAS
mutasjonsstatus. Flere hnRNP familiemedlemmer ble identifisert i løpet av de 36 acetylerte-proteiner. Acetylering status er kjent for å være involvert i moduleringen av EGF-respons. Etter avtale med resultatene som presenteres her, ble hnRNPA1 og L acetylering indusert i respons til EGF i
KRAS
A146T
celler, mens acetyl-hnRNPA1 og L nivåer forble uendret etter vekstfaktor behandling i
KRAS
G13D
svarer celler. Våre resultater viste at hnRNPs indusert-acetylering er avhengig av KRAS-mutasjonsstatus. Likevel hnRNPs acetylering kanskje også et punkt der ulike onkogene veier møtes
Citation. Roda D, Castillo J, Telechea-Fernández M, Gil A, López-Rodas G, Franco L, et al. (2015) EGF-indusert acetylering av Heterogene Nuclear Ribonucleoproteins er avhengig av
KRAS
mutasjonsstatus i tykktarmskreftceller. PLoS ONE 10 (6): e0130543. doi: 10,1371 /journal.pone.0130543
Redaktør: Matias A. Avila, Universitetet i Navarra School of Medicine og Senter for anvendt medisinsk forskning (CIMA), SPANIA
mottatt: 1. april 2015; Godkjent: 22 mai 2015; Publisert: 25 juni 2015
Copyright: © 2015 Roda et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis med tilskudd fra spanske regjeringen, Ministerio de Economía y Competitividad og Feder tilskudd (FIS PI09 /02480 og PI12 /02 767 til AC; FIS PI12 /02 394 til ERGT og FIS PI12 /02 110 til GLR) og Generalitat Valenciana (PROMETEO 2013-005 til AC). DR holdt et fellesskap fra Ministerio de Ciencia e Innovación (Rio Hortega Program) og fra Sociedad Española Oncologia Médica (SEOM); MTM er en pre-stipendiat fra Generalitat Valenciana (Prometeo) og AG er en mottaker av postdoktorstipend fra spanske foreningen mot kreft (AECC, Provincial styret Baleares)
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer.
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP (CRC) er en av de mest utbredte svulster i verden [1] og til tross for mange fremskritt i behandlingen, langsiktig overlevelse for pasienter med metastatisk sykdom er fortsatt dårlig [2]. Antistoffer mot epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) har blitt brukt i CRC pasienter med langt fremskreden sykdom. Men mindre enn halvparten av dem reagerer på slik behandling [3].
KRAS
eller
NRAS
mutasjoner er de viktigste negative prediktive markører til EGFR-respons [4]. Derfor skal kun vurderes hos pasienter med en full behandling med anti-EGFR antistoffer
RAS
villtype fenotype [5, 6]. Ras-proteiner sørge for signaloverføring mellom membranreseptorer, som for eksempel EGFR, og intra-cytoplasmiske serin /treonin-kinaser; og dermed bidra til regulering av en rekke viktige cellulære funksjoner. Mutert RAS gjengir proteinet inn i en konstitutivt aktiv form, som i sin tur deregulates nedstrøms signalveier [7]. Men flere kliniske og eksperimentelle data tyder på at ikke alle
RAS
mutasjoner er like i sine biologiske egenskaper, og derfor kunne de gi variable effekter [8, 9]. De hyppigste KRAS-mutasjoner er funnet i CRC pasienter er i kodon 12 og 13. Men, aktivere
KRAS
mutasjoner i kodon 61 og 146 har nylig blitt assosiert med kortere progresjonsfri overlevelse sammenlignet med vill-type
KRAS
i CRC-behandlede pasienter [10]. I tillegg kreftceller under press til å hemme deres onkogene trasé utvikle spontane mutasjoner. Faktisk, metastatisk CRC pasienter pågående anti-tumorbehandling erfaring
KRAS
genotypiske endringer [11]. Vi observerte også denne effekten i dyrkede celler; sletting av en mutert
KRAS
G13D
allel i HCT116-celler (
KRAS
G13D /WT
) induserte en spontan
KRAS
A146T
mutasjon i den gjenværende villtype-allelet. For å avdekke de molekylære mekanismene bak differensial respons observert i tumorceller med forskjellige mutasjoner i
KRAS
synes et stort problem for utvikling av nye anti-tumorterapier og personlig medisin.
Nylig, en roman deacetylase-avhengig mekanisme har vært foreslått for å forklare resistens mot anti-EGFR-terapier i mutant
KRAS
lunge adenokarsinom-celler [12]. Acetylering er en post-translasjonell reversibel modifikasjon regulert av to typer enzymer: lysin deacetylases (KDACs) og lysin acetyltransferases (Kats). Faktisk har deacetylase-inhibitorer dukket opp som mulige antitumormidler ved å øke hyperacetylation av både histoner og nonhistone proteiner [13]. Videre noen rapporter beskriver samspillet mellom KDAC hemmere og RAS-ERK signalkaskade i cellelinjer som viser ulike mutasjonsstatus i
KRAS
,
BRAF eller PI3KCA product: [14-17].
de nedstrøms effekter av mindre hyppig, men ikke mindre viktig
KRAS
A146T
mutasjonen er foreløpig uklart. I denne artikkelen vurderer vi virkningen av
KRAS
A146T
mutasjon
versus KRAS
G13D
på cellulær proliferasjon, heft og migrering av HCT116-avledede CRC-cellelinjer. Gitt den nylig beskrevet samspillet mellom acetylations og RAS-ERK signalkaskader, vi studerte også effekten av KRAS mutasjonsstatus på protein acetylering mønster for å få innsikt i de potensielle molekylære mekanismene bak differensial effekten av
KRAS
mutasjoner .
Materiale og metode
2,1. Materialer
Antistoffer mot hnRNPA1 (ab5832, ab50492), hnRNPA3 (ab50949), hnRNPA
2 /B
1 (ab64800), hnRNPL (ab6106, ab65049) og GAPDH (ab8245) eller β- aktin (ab8227) som lasting kontroller, var fra Abcam. Antistoffer mot acetyl-Lys (9441), Pakt (40665) og AKT (9272) var fra Cell Signaling Technology. Andre antistoffer som ble brukt var: ERK (sc-93) og perk (sc-7383) fra Santa Cruz Biotechnology; KRAS (05-516) fra Millipore og Talin (T3287) fra Sigma-Aldrich.
Epidermal vekstfaktor (EGF 20 ng /ml), trichostatin (TSA, 0,5 pm) og natriumbutyrat var fra Sigma-Aldrich, UO126 (10 uM) fra Promega, LY294002 (10 uM) fra Calbiochem og Fibronektin fra BD Biosciences.
2,2. Cellekultur
Tykktarmskreft cellelinjer HCT116 og deres derivater HAE6 og HAF1 ble kommersielt kjøpt fra GRCF Biorepository og Cell Center, ved Johns Hopkins University. Alle cellelinjer ble dyrket i McCoys 5A modifiserte medium (Gibco) supplementert med 10% FBS, penicillin /streptomycin og L-glutamin og holdt under standardbetingelser.
2,3. Protein utvinning og immunoblotanalyse
Totalt proteiner ble hentet i RIPA buffer supplert med hemmere og natriumbutyrat. Like mengder av proteiner ble underkastet elektroforese i SDS-PAGE-geler og overført på nitrocellulosemembraner og immunoblottet som beskrevet andre steder [18]. Blottene ble utviklet av forbedret chemoluminiscence (ECL Detection Kit, GE Healthcare). Protein nivåer ble kvantifisert ved densitometri og normalisert ved β-aktin eller GAPDH uttrykk.
2,4. 2D-elektroforese og acetylome analyse
Proteinekstrakter (100 ug) ble separert ved to-dimensjonal (2D) elektroforese som tidligere beskrevet [18]. Proteomikk bildene ble kjøpt med en Typhoon Trio Imager. Parallelt ble 2D-geler elektro på nitrocellulosemembraner og analysert ved western blot med anti-acetylert lysin antistoff. Acetylert proteiner overlappende med SYPRO Ruby-farget gels ble skåret ut for MS-analyse. Gel prøvene ble behandlet med en MassPrep stasjon (Waters). NanoLC-ESI-MS /MS og dataanalyse ble utført som beskrevet [19] av proteomikk og bioinformatikk Unit, (CIMA-universitetet i Navarra, Spania).
2,5. Immunpresipitasjon
500 ug av proteiner ble immunopresipitert over natten med spesifikke antistoffer eller normal serum IgG (Dako) ved 4 ° C på en roterende enhet. Protein-antistoffkomplekser ble revet ned med 50% (v /v) Dynabeads (Invitrogen, Life Technologies). Etter flere vaskinger i PBS ble immunokomplekser gjenvunnet ved koking i LB og deretter analysert ved hjelp av Western blot som beskrevet. 1% av proteinekstrakter som brukes for immunoprecipitation ble lastet som inngang.
2,6. RNA isolering og uttrykk analyse av qPCR
RNA ekstraksjon, komplementær DNA syntese og QRT-PCR ble utført som preciously beskrevet. [18]. Primer sekvenser for
hnRNPA1
,
hnRNPA3
,
hnRNPA2 /B1
,
hnRNPL Hotell og
GAPDH
er vist i supplerende data. Pre-utviklet TAQMAN primere for
KRAS
,
ADAM19
,
Cathepsin C
,
cathepsin L Hotell og
18S
var fra Applied Biosystems. Relativ genekspresjon ble uttrykt som 2
-Δ (ΔCt) Data ble normalisert ved
18S
kvantifisering i samme prøve reaksjon. Alle reaksjoner ble utført i tre eksemplarer.
2,7. Microarray genuttrykk. Hybridisering og dataanalyse
Total RNA (5 Hg) ble brukt for å få biotinylated cRNA henhold til produsentens protokoll (Affymetrix). Kvaliteten av den merkede cRNA ble bekreftet ved hybridisering til en prøve Affymetrix brikke (Test3-chip). Merket cRNA ble hybridisert til Affymetrix Genechip Menneskelig Gene 1.0ST. Microarray data ble innhentet av AGCC Affymetrix programvare. Rådata fra tre replikater for hver cellelinje ble analysert ved R /Bioconductor hjelp av Limma pakken [20]. F-statistikk, t-statistikk og logge oddsen for dette uttrykket ble beregnet ved empirisk Bayes moderasjon av de vanlige feilene mot et felles verdi. Differensielt uttrykte gener ble identifisert ved parvis sammenligning (p-verdi = 0,05 cutoff). Bare gener med en fold endring over 1,5 og under -1, ble vurdert forskjellig uttrykt for videre analyser og klassifisert i henhold til den biologiske prosessen kategorien følge kriteriene for Gene ontologi Consortium [21].
2,8. BrdU Celleproliferering analysen
Celleproliferering ble undersøkt av en bromdeoksyuridin (BrdU) inkorporering analysesett (Calbiochem). I korthet ble cellene sådd ut ved en tetthet på 5×103 celler /brønn i en 96-brønners kulturplate. Etter 24 timer sult, ble cellene behandlet med EGF (20 ng /ml) i serumfritt medium. Den BrdU-reagens ble tilsatt til brønnene i 4 timer i nærvær eller fravær av EGF. Ved de angitte tidspunkter ble cellene fiksert i løpet av 30 min i et fiksativ /denaturerende oppløsning. Celler ble inkubert med anti-BrdU-antistoff (1: 100) i 1 time og etter flere vaskinger, inkubert med HRP-konjugert IgG i 30 min. Tetra-metyl-benzidin-substrat ble deretter tilsatt i 15 minutter og reaksjonen ble stoppet ved tilsetning av 1,25 M svovelsyre stoppoppløsning. Absorbansen ble målt i hver brønn ved to bølgelengder 450-540nm.
2,9. Sårhelende analysen
De tre cellelinjer ble dyrket under standardbetingelser. Flytende monolag var riper med en 10 ul pipettespiss for å indusere et sår. De sårede kantene ble fotografert ved hjelp av en invertert mikroskop Nikon Eclipse Ti (10x forstørrelse). Bilder ble samlet på 0, 24 og 48 timer etter scratch.
2,10. Statistisk analyse
Dataene er middelverdien ± SEM fra minst tre uavhengige eksperimenter. Signifikante forskjeller ble bestemt ved en-prøve Students t-test. Forskjeller ble betraktet som signifikant på
p
0,05. Representative blotter vises.
Resultater
3
.
en
. Differential effekten av
KRAS
A146T
og KRAS
G13D i EGF-behandlede CRC celler
HCT116 CRC cellelinje, husing en endogen aktive
KRAS
G13D /vekt mutasjon, og to isogen HAF1 (
KRAS
vekt /-) og HAE6 (
KRAS
G13D /-) kloner ble anvendt for denne studien. Alle disse genene anbefalte å forutsi en klinisk utfall for kreftbehandling ble sekvensert i de tre cellelinjer [22] (S1 Table). Interessant, mens alle mutasjoner er funnet i HCT116 ble også observert i HAE6 celler, fant vi at i HAF1 celler en
KRAS
A146T
hotspot mutasjon hadde spontant oppstått i det som så langt var ment å være en villtype-allelet. Gitt dette resultatet, preget vi
KRAS
A146T
celler og sammenlignet dem med HCT116 eller HAE6 cellelinjer (S1 Fig og S1-fil). HAE6 celler viste den høyeste spredning rente og de laveste nivåene av celle adhesjon. En sårheling analyse av cellevandring avslørte forskjeller mellom de tre cellelinjer (, med HCT116 viser en høyere rente enn HAF1 men lavere enn HAE6 celler. I motsetning til tidligere resultater,
KRAS
mutasjonsstatus hadde tilsynelatende ingen effekt på ERK og AKT fosforylering under basale forhold. Dette er ikke overraskende, siden de tre cellelinjer havn en PIK3CA aktivere mutasjon.
KRAS
A146T
virket å være mindre tumorigen mutasjonen. Likevel usynkroniserte cellekultur i henhold til basale betingelser kunne maskere virkningen av KRAS mutasjon som respons på en spesifikk stimulus. Derfor, for ytterligere å utforske den nedstrøms effekten av
KRAS
A146T
versus godt karakterisert
KRAS
G13D
mutasjon, HAF1 og HAE6 celler ble dyrket i serum fratatt media og deretter stimulert med EGF. For å utelukke muligheten for at mutasjonen kan påvirke
KRAS
uttrykk, qPCR ble utført og
KRAS
mRNA-nivåer ble funnet i begge cellelinjene var lik (data ikke vist). Selv om EGF-behandling indusert rask fosforylering av ERK1 /2 og AKT i HAF1, dette svaret var dårlig i HAE6 celler (fig 1A). Merkbare, perk nivåene var allerede høy i ubehandlede HAE6 kontroller. I tillegg, som allerede er beskrevet i andre cellelinjer med en hyperactivated ERK-reaksjonsveien [23], redusert EGF pakt nivåer i dette HAE6 cellelinje.
A. Nedstrøms mål for KRAS signalveien ble analysert ved western blot å bestemme Pakt og pErk1 /2 nivåer etter EGF-behandling. B. Celleadhesjon ble bestemt ved western blot-analyse av Talin spalting i HAF1 og HAE6 celler. C. Migration forhold ble studert etter EGF (20 ng /ml) behandling av sårheling analysen. Grafen viser prosentandelen av celler som migrerte til sårområdet etter 24 timer. D. celleproliferasjon, målt med BrdU-analysen, for å analysere proliferativ aktivitet i EGF-behandlede (20 ng /ml) celler. * P 0,05 EGF-behandlet vs ubehandlede kontroller (n = 4)
Cell vedheft eksperimenter kunne ikke utføres i serumfritt medium fordi HAF1 cellene følsomme for trypsinering etter 24-serum deprivasjon.. En høyere talin-spalting har vært forbundet med lavere celleadhesjon [24]. Derfor har vi analysert kløyvet-Talin som en indirekte metode for å måle celle adhesjon. I ustimulerte celler, Talin-spalting var allerede høyere i HAE6 enn i HAF1 celler. Videre, mens talin-spaltning ble indusert i respons til EGF i HAF1 celler, dette proteolytisk spaltning ble EGF-uavhengige i HAE6 celler (figur 1B). Vi neste analyserte cellemigrering og fant at HAE6 celler ble også svarer til EGF, i motsetning til den cellemigrering indusert av EGF i HAF1 cellelinje (figur 1C). Til slutt, celleproliferasjon, selv om indusert av EGF i begge cellelinjene, ble øket i mindre grad i HAE6 enn i HAF1 celler (figur 1D). Vi tenkte at hyperaktive av ERK1 /2 indusert av KRAS
G13D kunne nå et platå utover som cellene ikke kan bli ytterligere stimulert av EGF.
3,2. Differensial mRNA nivåer i KRAS
G13D vs KRAS
A146T CRC cellelinjer
Vi har undersøkt de mulige KRAS-avhengig transkripsjons effekter i begge cellelinjer med Affymetrix DNA-mikromatriser (S2 og S3 filer). Under tilstedeværelsen av
KRAS
G13D
mutasjon, mest differensielt uttrykte gener ble nedregulert (Fig 2A og 2B, S2 figur) sammenlignet med
KRAS
A146T
mutasjon (HAF1). Med uttrykket av flertallet av gener som ikke i det vesentlige endres, og bare noen få av dem ble oppregulert. For å validere disse data ble ekspresjonen av et utvalg av oppregulert gener analysert ved qPCR. Disse genene ble valgt for deres fremtredende rolle i tumormetastase, vekstfaktor shedding eller CRC medikamentresistens [25, 26]. Uttrykket av disse genene var dramatisk oppregulert i celler med mutert
KRAS
G13D
allelet, noe som bekrefter microarray data (Fig 2C og S2 Fig). Blant de genene nedregulert i HAE6 vs. HAF1 celler, den mest representative veien berørt var EGFR1 signalering; 43 gener ble nedregulert ut av 156 beskrevet for EGFR1 kanoniske veien. Men andre reaksjonsveier som utløses av cytokiner og vekstfaktorer, slik som VEGF, PDGF, HGF, IGF1, TGFp, TNFa og flere interleukiner, ble også nedregulert. Dette er ikke overraskende siden de fleste av dem har flere trinn innenfor RAS signalveien.
Total RNA fra CRC celler dyrket i basale forhold med 10% FBS ble analysert ved microarray. A. Venn-diagram som viser hvor mange prosent av opp- og ned-regulert gener som finnes i cellelinjen huse en
KRAS
G13D
mutasjon (HAE6), sammenlignet med mRNA nivåer funnet i HAF1 celler (
KRAS
A146T
)
. B. Bar diagram som representerer forskjellig uttrykt gener (p-verdi ≤ 0,001) blant de to cellelinjene HAE6
versus
HAF1 celler, vurderer bare-log2 ganger endring 1,5 og -1,5. Gene symbol for hvert gen er angitt til venstre. C. Tre gener,
Cathepsin L
,
cathepsin C Hotell og
ADAM19
ble valgt på grunnlag av deres potensielle rolle i celle invasjon og migrasjon, for microarray godkjenning ved qPCR. * P 0,05 versus HAF1 celler.
3,3. Effekt av KRAS-mutasjoner på den globale acetylome av CRC
En av de potensielle veier som berøres av KRAS mutasjonsstatus som kan regulere flere biologiske prosesser er protein acetylering. Vi ønsket å undersøke om det globale acetylering profil i CRC ble ulikt påvirket av aktivert KRAS
G13D og aktivert KRAS
A146T. Isolerte proteiner fra begge cellelinjer dyrket i 10% FBS, ble immunutfelt og analysert ved western blot med anti-acetyl-Lys-antistoffer (figur 3A). En 2D western blot proteomikk tilnærmingen ble anvendt for å analysere dypt acetylerte-proteinene fra de to cellelinjene. Globalt protein Lys-acetylering ble økt i HAE6 forhold til HAF1 celler, i henhold til økt antall oppdaget flekker (Fig 3B).
A. Cellehomogenater ble immunopresipitert med anti-acetyl-lysin-antistoff og bunnfallet ble deretter immunoblottet mot acetyl-lysin-rester, inkludert en lik mengde av start homogenat (kalt Input). IgG: Homogenater immunopresipitert med normal serum IgG. Molekylmasse markører (kDa) er på venstre side av gelen. B. protein uttrykk profiler av begge cellelinjene adskilt av IEF todimensjonal PAGE, farget med SYPRO Ruby (venstre panel) eller immunoblottet mot acetyl-lysin antistoff for å identifisere acetylerte proteiner (panel høyre). PH-verdien øker fra venstre mot høyre på abscissen og den molekylvekt avtar fra topp til bunn på ordinaten. C. Fordeling av GO biologiske funksjonene til de acetylerte proteiner identifisert i acetylome av HAE6 celler.
Positive flekker fra HAE6 acetylome ble skåret ut og identifisert ved massespektrometri. 67 flekker ble påvist, men bare de med en trygg Mascot ion score og en høy peptid matchende ble valgt (S2 tabell). The (GO) biologisk funksjon analyse av våre 36 acetylerte proteiner viste at target proteiner ble beriket i fire hovedkategorier knyttet til cellevekst, energi metabolisme, RNA metabolisme og protein metabolisme (Fig 3C). Mange av disse proteinene ble allerede beskrevet å være mål for antatte acetyltransferases eller deacetylases og å bli acetylert under ulike eksperimentelle forhold (anmeldt i S2 tabell). Våre microarray Resultatene bekreftet at forskjeller i acetylering mønsteret var ikke på grunn av økt mRNA uttrykk. Faktisk, de genene som har produkter ble identifisert i vår acetylome analyse forble uendret i HAE6 sammenlignet med HAF1 celler (S2 og S3 filer).
3,4. Acetylering av hnRNP familiemedlemmer
Blant de acetylerte-mål var det en interessant gruppe av RNA-bindende proteiner, alle av dem medlemmer av familien av heterogene atom ribonucleoproteins (hnRNPs), som er involvert i en rekke forskjellige molekylære funksjoner som skjer fra mRNA prosessering, transport, stabilitet eller til og med oversettelses [27]. Vi analyserte i de to cellelinjene om basal acetylering av hnRNPs var avhengig av
KRAS
mutasjonsstatus. Acetylering ble målt ved immunoutfelling eksperimenter med acetyl (Lys) antistoffer etterfulgt av western blot med antistoffer som erkjenner spesifikke hnRNP elementet. Som vist i figur 4A, hnRNPA1 og A2 /B1 ble funnet å være hyperacetylated henhold vekstbetingelser (10% FBS) i HAE6 sammenlignet med HAF1; Men dette mønsteret var ikke så klart i andre familiemedlemmer testet som hnRNPA3 eller L. mRNA og proteinnivåer hnRNPs ble analysert ved henholdsvis qPCR og western blot (fig 4B og 4C); ekspresjonen av ingen av hnRNPs viste en signifikant endring sammenlignet mellom de forskjellige cellelinjer. Derfor de ulike nivåene av acetylering observert er ikke et resultat av en høyere rate av genekspresjon eller protein stabilisering.
A. Totale ekstrakter fra de to CRC-cellelinjer i henhold til basalbetingelser (10% FBS) ble isolert og immunopresipitert med α-acetyl-lysin-antistoffer. Den immunopresipitert Prøven ble deretter analysert ved western blot med antistoffer som gjenkjenner det spesifikke hnRNP elementet (venstre panel). Tilførslene av hver enkelt hnRNP i de forskjellige cellelinjer er vist (høyre panel). B. mRNA-nivåer av hnRNPs ble analysert ved qPCR (n = 3). Ingen statistisk signifikans ble funnet. C. Western blot-analyse som viser proteinnivåene for de forskjellige hnRNPs i HAF1 og HAE6 celler. p-aktin ble brukt som lasting kontroll.
3,5. Acetylering av hnRNPA1 og L som respons på EGF
Selv om acetylering av hnRNPs allerede er blitt beskrevet i andre cellesystemer, i dag er det ikke kjent hvorvidt dette acetylering er en del av EGF-respons i CRC-celler. Skulle det være tilfelle, vil det være viktig å finne ut om de
KRAS
mutasjonsstatus kan betinge en differensiert indusert-acetylering av hnRNPs på EGF stimuli. Begge cellelinjer ble dyrket i serumfritt medium og deretter stimulert med EGF for et kort (20 min.) Og en lang (2h) periode (figur 5A). Prøver fra hver tilstand ble immunopresipitert med enten anti-hnRNPA1 eller anti-hnRNPL antistoffer. Disse hnRNPs ble valgt fordi de representerer de isoform som viser den høyeste og laveste acetylering forskjeller når man sammenligner HAF1 og HAE6 celler. Å etablere acetylering ratio (acetyl-hnRNP /total hnRNP), ble pull-ned proteiner ytterligere analysert ved western blot med spesifikke antistoffer mot acetyl-Lys eller tilsvarende hnRNP.
Begge CRC cellelinjer ble dyrket i serum -Gratis medium og deretter stimulert med EGF (20 ng /ml) for 20 og 120 min. A. Protein utdrag fra kontroll eller EGF-behandlede celler ble isolert og immunopresipitert med α-hnRNPA1 (øvre panel) eller hnRNPL (nedre panel) antistoffer. De immunoutfelte Prøvene ble deretter analysert ved western blot med antistoffer som gjenkjenner acetyl-lysin-rester og, enten hnRNPA1 eller hnRNPL. Tilførslene av hver enkelt hnRNP i de forskjellige cellelinjer er vist. B. mRNA-nivåer av hnRNPA1 og hnRNPL ble analysert ved qPCR i kontroll og 2h EGF-behandlede celler. Ingen statistisk signifikans ble funnet (n = 3). C. Western blot analyse som viser proteinnivåer både hnRNPs i HAF1 og HAE6 celler i kontroll- og 2t EGF-behandlingsforhold. Intensiteten av hnRNPs båndene ble målt og normalisert ved β-aktin; grafer i nedre panel viser kvantifisering for både hnRNPL og A1 i HAF1 (hvite søyler) og HAE6 (grå søyler) cellelinjer.
Under serum deprivasjon, basale acetylering nivåer av både hnRNPs var høyere i HAE6 enn i HAF1-celler (figur 5A, spor 0). Imidlertid acetylering av begge, hnRNPA1 og hnRNPL ved sluttpunktet av EGF-behandling var den samme i de to cellelinjene. Interessant, da den acetylering av EGF-behandlede prøver ble sammenlignet med ubehandlede kontroller, acetylerte-hnRNP nivåene ikke signifikant endre hele tidsforløpet av EGF-behandling i HAE6 celler (figur 5A). Motsatt EGF indusert en dramatisk acetylering av begge hnRNPs i HAF1 celler. Interessant samme respons ble observert etter behandling EGF i HCT116 opphavelige cellelinje (S3 Fig). Til slutt, mRNA og proteinnivåer fra hnRNPA1 eller-L ble ikke indusert i noen EGF-behandlet cellelinje ved de undersøkte tidspunkter (figur 5B og 5C, S3 fig). Følgelig kan EGF-indusert acetylering observert i HAF1 ikke tilskrives transkripsjons eller translasjonsforskning modulering av hnRNPs.
3,6. Rollen til
KRAS
A146T mutasjon på hnRNP acetylering
For å undersøke om
KRAS
A146T
mutasjon kan gjøre rede for EGF-indusert acetylering av hnRNPs, vi spesielt hemmet KRAS signalveien i HAF1 cellelinje. Uavhengig av
KRAS
A146T mutasjon, HAF1 celler også omfatte en
PI3KCA
mutasjon. Derfor analyserte vi acetylering av hnRNPs indusert av EGF i celler forbehandlet med hemmere av både, MEK1 /2 (U0126) og PI3K (LY294002). Hemming av en enkelt bane enten MEK1 /2 eller PI3K, ved hjelp av den spesifikke inhibitor alene, hadde ingen effekt på protein acetylering (figur 6A). Muligheten av RAS til å påvirke PI3K-aktivitet, og omvendt har vært godt dokumentert [28, 29]. Faktisk har blokkerende MEK1 /2-aktivitet blitt vist å indusere AKT-fosforylering i CRC-cellelinjer [30]. På den annen side har blokkerende PI3K-aktivitet er vist å øke pErk1 /2 nivåer i respons til en rekke stimuli [28]. Etter avtale med dette, når begge hemmere ble brukt samtidig, hemming av RAS /PI3K signalveier blokkeres fullstendig EGF-indusert acetylering av både hnRNPA1 og hnRNPL (fig 6B). Interessant, basale nivåer av acetylerte hnRNPs i serum-sultet kontrollene ble ikke påvirket av kinaser inhibitors.
A. HAF1 celler ble behandlet med EGF i nærvær eller fravær av MAPK-inhibitorer (MEK, UO0126 eller PI3KA, LY294002). Proteinekstrakter fra HAF1 celler ble immunoutfelt med α-hnRNPA1 eller hnRNPL antistoffer. De immunoutfelt Prøvene ble deretter analysert ved western blot med antistoffer som gjenkjenner acetyl-lysin rester og, enten hnRNPA1 eller hnRNPL (Venstre panel). Fosforylering av ERK1 /2 og AKT i HAF1 celler ble også vurdert å bekrefte effektiviteten av individuelle hemmere ved doser brukt (høyre panel). B. Begge MAPK-inhibitorer ble samtidig anvendt for å studere deres virkning på EGF-indusert acetylering av hnRNPs. C. Role of deacetylases på basale nivåer av acetylering hnRNPs ble ytterligere undersøkt i HAF1 celler behandlet med trichostatin A. Immunoutfelling med hnRNPs antistoffer og western blot mot acetyl-lysin, eller L hnRNPA1 i HAF1 celler behandlet med EGF, TSA eller en kombinasjon av begge vises.
Basal nivåer av acetyl-hnRNPs kan være avhengig av halveringstiden til acetylations. Egentlig er acetylering av proteiner ikke bare et resultat av acetyltransferase-indusert aktivitet, men også av deacetylases. For å undersøke rollen til deacetylases på basal acetylering, undersøkte vi hvorvidt den deacetylase inhibitor trichostatin A (TSA) kunne etterligne virkningen av EGF i HAF1 celler. Faktisk økte TSA acetylering av både hnRNPs til samme nivå som de som nås av EGF-behandling, selv om ingen synergistisk effekt ble observert (figur 6C).
Diskusjoner
Heri vi avdekke flere aspekter ved de molekylære hendelser som ligger til grunn for colon carcinogenesis som vil bli ytterligere diskutert. Vi gir den første rapporten indikerer at acetylering av 36 spesifikke proteiner er avhengig av
KRAS
mutasjonsstatus; Blant dem, flere medlemmer av familien hnRNP. Videre er våre data indikerer at hnRNP acetylering er en del av den EGF-induserbare respons. Dernest viser vi de molekylære konsekvensene av allelet ubalansen ved sletting av heller, en vill-type eller en mutant allel i
KRAS
G13D /WT
CRC celler. Delesjon av villtype-allelet (HAE6) fører, ikke bare til hnRNP acetylering, men også til flere tumorigen og EGF-profil svarer til disse cellene. Motsatt, sletting av mutant allel (HAF1) induserer en spontan
KRAS
A146T
mutasjon i villtype-allelet.
Kollektivt våre observasjoner synes å parallell de kliniske funn som indikerer at forstyrrelse av
KRAS
villtype-allelet er en negativ prognostisk faktor for CRC [31]. Overraskende, i HAF1 celler, en spontan
KRAS
A146T
punktmutasjon ble funnet. Etter avtale med dette, de siste rapportene viser dynamiske
KRAS
genotypiske endringer gjennom progresjon av metastatisk CRC [11]. Denne punktmutasjon gjør også en konstitutiv aktivering av KRAS [32], I nær fremtid, ville det være viktig å analysere mulige spontane mutasjoner i en hvilken som helst annen CRC cellelinje anvendt som eksperimentell modell for å studere de molekylære mekanismer for terapi-resistens eller nytt medikament utvikling.
Mutasjons screening tester basert på fokuset
KRAS
kodon 12 og 13 har resultert i mis-klassifisering av opptil en tredjedel av pasientene som feilaktig ble ansett som
KRAS
villtype og var resistente mot anti-EGFR-behandling [33, 34].
KRAS
mutasjoner i kodon 61 og 146 er signifikant assosiert med kortere progresjonsfri overlevelse sammenlignet med vill-type
KRAS
i CRC pasienter behandlet med en kombinasjon av cetuximab og kjemoterapi [10].
