Abstract
PRAME tilhører en gruppe av kreft /testis antigener (oppfordringer) som er preget av sin begrensede uttrykk i normale gametogenic vev og en rekke av tumorer.
PRAME
familien er en av de mest forsterkede genet familier i mus og andre pattedyr genomer. Medlemmer av
PRAME
genet familien kode leucine-rik repeat (LRR) proteiner som fungerer som transkripsjons regulatorer i kreftceller. Imidlertid er rollen til PRAME i normale gonader ukjent. Målet med denne studien er å karakterisere tidsmessige og romlige uttrykk for mus
Pramel1
genet, og for å bestemme den cellulære lokalisering av PRAMEL1 protein under musen spermatogenesis. Våre resultater indikerer at muse
Pramel1
ble uttrykt i testikkel bare. MRNA og protein uttrykk nivået var lavt i de nyfødte testiklene, og gradvis økt fra 1- til 3-ukers gamle testiklene, og deretter holdt seg konstant etter tre ukers alder. Immunofluorescent flekker på testis seksjoner med musen PRAMEL1 antistoff avslørte at PRAMEL1 ble lokalisert i cytoplasma av spermatocytter og acrosomal regionen rundt, forlengelse og langstrakte spermatider. Videre analyser av testis squash forberedelse og sædceller på et subcellulære nivå indikerte at protein lokaliseringsmønstre PRAMEL1 ble samordnet med morfologiske forandringer i løpet acrosome formasjon i spermatider, og var signifikant forskjellig i tilkoblingsstykke, midtstykket og rektor stykke av flagellen mellom testiklene og epididymal sædceller. Samlet våre resultater tyder på at PRAMEL1 kan spille en rolle i acrosome biogenesis og sperm motilitet
Citation. Mistry BV, Zhao Y, Chang T-C, Yasue H, Chiba M, Oatley J et al. (2013) ulike uttrykk av PRAMEL1, et Cancer /testikler Antigen, under spermatogenese hos mus. PLoS ONE 8 (4): e60611. doi: 10,1371 /journal.pone.0060611
Redaktør: Austin John Cooney, Baylor College of Medicine, USA
mottatt: 18 desember 2012; Godkjent: 28 februar 2013; Publisert: 02.04.2013
Copyright: © 2013 Mistry et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av USDA-NIFA (gi no. 2010-65205-20362) og oppstart midler fra Pennsylvania State University til W-SL. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Spermatogenesen er en kompleks biologisk prosess som involverer mitotiske spredning av spermatogonier, det meiotisk divisjon av spermatocytter, og morphogenic differensiering av spermatider å modne sædceller. Under spermiogenesen, de runde spermatider gjennomgå dramatiske morfologiske og cellulære forandringer, herunder dannelsen av akrosom, forlengelse og kondensering av kjernen, dannelsen av flagellen, og avhending av unødvendig cytoplasma, for å produsere høyt spesialisert og polarisert spermatozoer [1], [2- ]. Akrosomet er en Golgi-avledet vesikkel plassert på fremre område av sperm hodet [3]. Det spiller en avgjørende rolle i befruktningen av sitt engasjement i prosessen med sperm-egg binding og trenge inn i egget [4], [5]. Pattedyr menn bærer mutasjoner som påvirker acrosome biogenesis er infertile eller subfertile [4] – [7]. Acrosome biogenesis begynner på slutten pachytene spermatocyte fase av meiose og fortsetter gjennom hele første halvdel av spermiogenesen [4], [5], [8]. I første omgang er proacrosomal vesikler dannet fra Golgi-apparatet og montert i perinukleære regionen, nær en av polene av kjernen i pachytene spermatocytter. Etter fullførelse av meiotisk divisjon disse vesikler smelter sammen med hverandre for å danne en enkelt stor acrosomal vesikkel som festes til den kjernefysiske konvolutten av runde spermatider og fortsetter å utvides ved tilsetning av Golgi-avledet materiale [4], [8]. Under modningen av forlengelse spermatider, opphører Golgi å bidra glykoproteiner til acrosome, og acrosome-kjernen kompleks gjennomgår omfattende morfologiske endringer for å få en form karakteristisk for de gitte artens sperm [8].
flagellen av et pattedyr spermatozoon er en viktig og godt organisert mikrotubulus-baserte kompleks struktur som gir motilitet kreves for sædcellene å nå og befrukte et egg [9]. Strukturelt, er det delt inn i fire hovedkomponenter: koplingsstykket, midt stykke, rektor stykke, og endestykket [10]. Montering av flagellen starter i begynnelsen av spermiogenesen. I løpet av flagellen biogenese, et par Sentrioler flyttes til den motsatte siden av det fremkallende akrosom i det perinukleære plass av runden spermatid, hvor en av de to Sentrioler danner et flagellært axoneme. Deretter stikker den axoneme fra spermatid, hvilket ga flagellen [8]. Mer enn 400 proteiner har blitt funnet i flagellen, men bare en brøkdel av proteinene har blitt karakterisert på molekylært nivå og vist å fungere som struktur, metabolske eller signaleringsproteiner [11], [12].
Cancer /testis antigener (oppfordringer) er en gruppe proteiner som er sterkt uttrykt i et bredt utvalg av ondartede svulster, men deres ekspresjon i normale vev er stort sett begrenset til testiklene og eggstokk-bakterieceller [13] – [15]. På grunn av deres karakteristiske uttrykk mønsteret, blir brukt som CTA prognostiske markører for et spekter av tumorer og er også betraktet som lovende mål for cancer immunoterapi [16] – [18]. Minst 70 CTA genfamilier med mer enn 240 individuelle gener (eller isoformer) har blitt identifisert hittil [19]. Tidligere studier har antydet at CTA generelt ha en rolle i både tumorigenese og gametogenese [14], [15], [20]. Men informasjon om funksjon og presis cellulær lokalisering av CTA i kjønnsceller og kreft vev er sparsom i forhold til data om deres uttrykk og immunogenisitet [13], [15].
Fortrinnsvis uttrykt antigen i melanom (PRAME) er et medlem av CTA, og ble opprinnelig identifisert som en tumor antigen uttrykt på melanomceller, utløser en autolog cytotoksisk T-celle-mediert immunrespons [21].
PRAME
er en multi-kopi-genet som representerer en av de amplifiserte genfamilier i eutherian pattedyr, med ~ 90 eksemplarer i mus, ~ 50 eksemplarer i menneske og ~ 30 kopier i det bovine genom [19] , [22], [23]. Interessant,
PRAME
har blitt transponert til og forsterket på Y-kromosomet i bovidet avstamning, noe som tyder på en rolle i mannlig reproduksjon [19]. Medlemmer av
PRAME
genet familien kode LRR (leucine-rik gjenta) proteiner som kaster inn en hesteskoform i sin tertiær struktur. Den primære funksjon av LRR proteiner er å tilveiebringe en allsidig strukturelt rammeverk for dannelsen av protein-protein interaksjoner på ulike molekylære gjenkjennelsesprosesser, herunder signaltransduksjon, celleadhesjon, transkripsjonen regulering, RNA-bearbeiding, apoptose, immunrespons, og celle polarisering [24 ] – [28]. Ekspresjon og funksjon av PRAME er blitt grundig undersøkt i en rekke forskjellige kreftceller, og høy ekspresjon PRAME korrelerer med progresjon av kreft [28] – [30]. I melanomceller, PRAME fungerer som en repressor av retinsyre (RA) signalerings gjennom interaksjon med RA-reseptorer (RARs) og rekruttering av polycomb proteiner [27], [31]. Nyere studier har også antydet at PRAME fungerer som en transkripsjon aktivator. Costessi
et al. Plakater (2011, 2012) rapporterte at PRAME er en komponent av Cullin2 basert E3 ubiquitin-ligase, og er nødvendig for å rekruttere Cullin2 ubiquitin-ligase til den EKC /KEOPS kompleks. Dette komplekset er forbundet med de aktive arrangører regulert av
atomtranskripsjonsfaktor Y product: (
NFY
) [29], [32]. Vi hypotese at PRAME spiller også en rolle i spermatogenesen. Som et første skritt for å teste vår hypotese og å dissekere den molekylære rolle PRAME genet familien i reproduksjon, valgte vi å jobbe med musen
Prame lignende en product: (
Pramel1
) genet, en representant for
Prame
genet familien, som er homolog til den menneskelige
PRAME, etter og ligger på musen kromosom (MMU) 4. i dette arbeidet har vi preget
Pramel1
gen med hensyn til sin mRNA og protein uttrykk mønster og cellulær lokalisering under testikkel utvikling og spermatogenese.
Resultater
Temporal og romlig uttrykk analyse av mus
Pramel1
i testikkel
uttrykk mønster av musen
Pramel1
genet (iht. no. NM_031377) ble undersøkt i 11 vev av voksne mus ved RT-PCR. For sammenligningens skyld, fem andre paraloger fra musa
Prame
familie (X-bundet
Prame
,
Pramel3
, og
Pramel
, og MMU4- knyttet
Pramef8 Hotell og
Pramef12
) ble også analysert (tabell 1). Resultatene viste at alle seks paraloger ble sterkt uttrykt i testikkel, med varierende ekspresjonsnivåer i andre vev (fig. 1).
Pramel1 Hotell og
Prame
mRNA ble spesielt uttrykt i testikler, mens
Pramel
,
Pramel3
,
Pramef8
, og
Pramef12
mRNA ble hovedsakelig uttrykt i testikkel med en lav ekspresjon i ovarier, lever, milt, nyre, hjerne, lunge, muskel og thymus (fig. 1a). For ytterligere å undersøke tidsmessige og romlige uttrykk for
Pramel1, etter vi utført en gang studium under testikkel utvikling. Våre RT-PCR resultatene tyder på at, mens et lavere nivå
Pramel1
mRNA ble uttrykt i den nyfødte testis, ble et høyere nivå av konstant uttrykk påvist i en-uke-til 8-ukers gamle testiklene (Fig . 1b).
a. Romlig uttrykk analyse av seks
Prame
paraloger blant 11 forskjellige vev av voksne mus.
Prame Hotell og
Pramel1
ble uttrykt spesifikt i testikkel, mens
Pramel, Pramel3, Pramef8 Hotell og
Pramef12
ble uttrykt hovedsakelig gametogenic vev med en lav nivå av uttrykk i lever, nyre, hjerne, tynntarm, lunge, muskler og thymus. b. Temporal uttrykk analyse av
Pramel1
under testikkel utvikling. Lav ekspresjon ble observert i testis nyfødte, mens en konstant høy ekspresjon ble observert i prøvene fra 1- til 8 uker gamle mus.
ACTB
ble brukt som en positiv kontroll. M: markør; Ov: eggstokk; Te: testis; Li: leveren; Sp: milt; Ki: nyre; Br: hjernen; Si: tynntarmen; Ly: lymfeknute; Lu: lunge; Mu: muskler; Th: thymus; -:. Negativ kontroll
For å finne ut om PRAMEL1 protein er uttrykt i testikkel, ble utført en western blot analyse på hele testis lysat fra modne mus bruker en PRAMEL1-spesifikt antistoff. Som vist i figur 2a, er PRAMEL1 antistoff identifisert et spesifikt bånd med en molekylvekt på ~ 57 kDa, som er den forutsagte molekylvekt for mus PRAMEL1 proteinet (acc. No. NP_113554). I tillegg ble en svært små band (~ 42 kDa) observert (Fig. 2a). For å teste spesifisiteten av antistoffet, utførte vi en pre-absorpsjon kontroll med peptidet som brukes til å generere PRAMEL1 antistoff, hvor ingen bånd ble påvist (Fig. 2a), noe som tyder på at antistoffet er PRAMEL1-spesifikke og mindre bånd krever videre etterforskning. En gang kurs analyse av PRAMEL1 protein videre indikert at dens uttrykk i testiklene var aldersavhengig (fig. 2b). Protein Ekspresjonsnivået var meget lav ved den nyfødte trinn (fig. 2b), i overensstemmelse med det lave nivå av transkripsjon påvist ved RT-PCR (fig. 1b). Uttrykket ble øket gradvis fra 1- til 3 uker gamle testikler, og deretter holdt seg konstant etter tre ukers alder (fig. 2b). Som en positiv kontroll ble en monoklonale β-aktin (ACTB) antistoff anvendes for å påvise ACTB, og en forventet protein på 42 kDa ble påvist (Fig. 2a, 2b).
a. Western blot-analyse av PRAMEL1. Proteinekstrakter fra voksen mus testikkel ble underkastet Western blot-analyse ved å bruke en mus PRAMEL1 antistoff. En immun-reaktivt protein med forventet molekylvekt på ~ 57 kDa ble påvist i testiklene, og en meget mindre bånd på ~ 42 kDa ble også observert. Som en positiv kontroll og lasting et monoklonalt antistoff ACTB ble anvendt, og en forventet immun-reaktivt protein på 42 kDa ble observert. Som en negativ kontroll, utførte vi en pre-absorpsjon kontroll av peptidet som brukes til å generere PRAMEL1 antistoff, og ingen bånd ble påvist. b. Tidsforløpet analyse av PRAMEL1 proteinekspresjon under testis utvikling. Proteinekstrakter fra nyfødt (Nb), 1-uke (1w), 2 uker (2w), 3 uker (3w), 4 uker (4W) og 8 uker (8w)-gammelt testiklene ble utsatt for western blotting med musen PRAMEL1 antistoff. Uttrykket nivået av PRAMEL1 ble gradvis økt fra Nb til 3w og deretter holdt seg konstant etter 3-ukers alder. Tall til venstre indikerer molekylvektene til standardproteiner.
Lokalisering av PRAMEL1 protein i løpet av sædcelle
Vi undersøkte mobilnettet, romlig og tidsmessig uttrykk for PRAMEL1 protein i løpet av bakterie celle utvikling av indirekte immunfluorescens-mikroskopi. I utgangspunktet undersøkte vi PRAMEL1 protein lokalisering på tverrsnitt av testiklene hos unge mus, fra nyfødt til 3-ukers alder. Som vist på fig. 3, var det ingen spesifikk fargemønster som ble observert for PRAMEL1 antistoffet på tvers av seksjonen i en uker gamle testikkel (fig. 3a, c), skjønt svakt uspesifikk bakgrunnsfarging ble observert for både PRAMEL1 antistoff (fig. 3a, c) og pre-absorbert peptid kontroll (fig. 3d). Dette kan være en konsekvens av relativt lav ekspresjon av transkriptet og protein på dette stadiet (fig. 1b og 2b). I forhold til den pre-absorbert peptid kontroll hvor noen ikke-spesifikk farging ble observert (fig. 3i), ble spesifikk farging sett på den PRAMEL1 antistoffet hovedsakelig i cytoplasma av spermatocytter i to uker gamle testikkel (fig. 3f, h) . Når musene nådde 3 ukers alder, var en meget unik og sterk farging detektert av PRAMEL1 antistoff i perinukleære region av runde spermatider (fig. 3k, m), hvor en kapselformet struktur på atom overflaten ble observert (Fig . 3m).
Tverrsnitt fra en uke (a-e), 2-uke (f-j) og 3-ukers (k-o)-gammelt mus testikler ble farget med musen PRAMEL1 antistoff. Selv om det var ingen spesifikk signal observert over sædkanaler i en uke gammel testikkel, spesifikk farging (grønn) ble observert i cytoplasma spermatocytter (f, h) i to uker gamle testikkel og perinukleær regionen runde spermatider ( k, m) i tre uker gammelt testikkel. Paneler a, f, k er PRAMEL1 antistoff farging. Paneler b, g og l er kontra med DAPI å visualisere kjerner. Paneler c, h og m er flettede bilder for PRAMEL1 og DAPI farging. Pilene peker på et område med beskrevne signaler. Paneler d, i og n har peptid-preabsorbert antistoffarging som negativ kontroll. Paneler e, j og o er H E farging for å vise strukturen og celletyper av sædkanaler. Forstørrelse er × 400. Scale bar = 20 mikrometer.
For ytterligere å undersøke om cap-aktig struktur på den kjernefysiske overflaten av runde spermatider er på fremre eller bakre side, musen PRAMEL1 antistoff sammen med β-tubulin ( tubb) antistoff som er spesifikt farget i den bakre side av spermatider [33], ble påført på tverrsnitt av testikler fra voksne mus. Under lav forstørrelse (× 400), som differensiering av seminiferøse epitel inntektene, PRAMEL1 kan ses i perinukleær regionen etter meiotisk kjønnsceller (rund, elongating og langstrakte spermatider) (Fig. 4a, e, i), mens tubb ble sett på den motsatte side av PRAMEL1 farging i forlengelse og langstrakte spermatider (fig. 4e, i), noe som indikerer at PRAMEL1 protein ble plassert på den fremre side (
ie
akrosom) av atom region i mus spermatider. En nærmere undersøkelse av immunofluorescently-fargede testis seksjoner ved høyere forstørrelse (x 1000) viste at den PRAMEL1 proteinet først ble sett i runde spermatider, hvor det var nært forbundet med en hette-lignende struktur på den kjerneoverflaten (fig. 5a, b ). Sammenlignet med testis delen, den klemt utarbeidelse av runde spermatider tilbudt flere detaljer om fargemønster, hvor PRAMEL1 ble hovedsakelig observert i acrosomal vesikkel, med lite eller ingen flekker i acrosomal granulat regionen (fig. 5b). Dette mønster falt sammen med dannelsen av det acrosomal vesikkel som sprer seg i et tynt lag over den pol av kjernen for å danne acrosomal cap. På dette trinn ble ingen farging observert for tubb fordi flagellen ennå ikke var blitt dannet (figur 4a-d;. Fig. 5a, b). Spesielt, mønsteret av PRAMEL1 lokalisering endres i henhold til morfologiske forandringer som forekommer i akrosomet og kjernen i løpet av spermiogenesen (figur 4a, e, i;. Fig. 5a-g). Når den runde spermatider begynner å forlenge og flagellen begynner å utvikle seg, ble tubb sett på den motsatte side av PRAMEL1 farging i perinukleære regionen, for å markere posisjonen til leppe utvikling og flagell dannelse (figur 4e, i;. Fig. 5c- g). Med utviklingen av spermatid morphogenesis, den PRAMEL1 protein flekker utvidet gjennom omtrent 1/3 av den kjernefysiske overflaten, hermet acrosome utvikling (Fig. 5a-g). Derfor våre resultater viser tydelig at den PRAMEL1 proteinet er forbundet med akrosom i spermatider. Som negative kontroller ble snittene farget enten med det primære antistoff pre-absorbert med det respektive peptid eller med det sekundære antistoff eneste. Ingen fluorescens signal ble påvist i kontrollseksjoner, noe som indikerer at ikke-spesifikk farging var minimal. (Fig 4m-p;. Fig. 5 h)
Tverrsnitt fra voksen (≥ 2 måneder gamle) mus testes var dobbel-farget med musen PRAMEL1 (grønn) og TUBA (rød) antistoffer. Den PRAMEL1 farging ble observert i runde (a), forlengelse (e) og langstrakte (i) spermatider i løpet av spermiogenesen. TUBA farging ble observert i forlengelse (f) og langstrakt (j) spermatider, men ikke i runde spermatider (b). Alle deler ble kontra med DAPI (paneler c, g, k og o) for å visualisere kjerner. Paneler d, h, l og p flettes bilder for PRAMEL1, TUBA og DAPI farging. Pilene peker på et område med beskrevne signaler. De innfellinger i d, h, og l er forstørret bilde for pilspiss-merket områder (se også fig. 5a, C, E og G). Paneler m og n er sekundære antistoff-kontroller for FITC-merket esel anti-geit IgG og TRITC-merket esel-anti-mus IgG, respektivt. Forstørrelse er × 400. Scale bar = 20 mikrometer.
testikkel seksjoner (a, c, e og g) og squash preparater av sædkanaler (b, d, f og h) ble farget med anti-PRAMEL1 (grønn) , anti-tubb (rød) og DAPI (blå). Fusjonerte bilder for trippel-flekker i runde spermatider (a og b), elongating spermatider (c, d, e og f) og langstrakte spermatider (g) er vist. Den PRAMEL1 farging ble observert i acrosomal vesikkel regionen i alle utviklingsspermatider og Tubb farging ble observert i leppe til en forlengelse og langstrakte spermatider. Som et sekundært antistoff som kontroll testis squash preparat (h) ble farget med FITC-merket esel anti-geit IgG og TRITC-merket esel-anti-muse-IgG. Forstørrelse er × 1000. Scale bar = 10 mikrometer.
Lokalisering av PRAMEL1 i testiklene og epididymal sædceller
Vi videre undersøkt subcellulære fordelingen av PRAMEL1 i testiklene /epididymal sædceller ved å utføre indirekte immunfluorescens flekker, ved å bruke PRAMEL1- og α-tubulin (TUBA)-spesifikke antistoffer. Den sædceller ble samlet inn fra klemt sædkanaler av modne testikler og caput, corpus og cauda regioner i bitestikkelen. Resultatene viste at, i likhet med farging i spermatider, er PRAMEL1 hovedsakelig lokalisert til den fremre akrosom-regionen av spermatozoer (figur 6a, b, d, e,. Tabell 2). Som ble observert forskjellige fargemønstre mellom testikler og epididymal spermatozoer, over 200 sædceller fra hver gruppe (tabell 2) ble undersøkt for å studere den detaljerte lokalisering av PRAMEL1 proteinet i spermceller. Vi fant at alle testikkel spermatozoer (100%) viste acrosomal lokalisering av PRAMEL1, mens bare 86,5% av epididymal spermatozoer var positive for PRAMEL1 i acrosomal region (tabell 2). Videre PRAMEL1 ble observert på den viktigste del av flagellen (41%) i testikkel spermatozoer (fig. 6a, tabell 2), mens det ble observert i forbindelsesstykket (96%) og midtstykket (87,9%) i epididymal spermatozoer (caput, corpus, og cauda) (figur 6a, b, d, e,. tabell 2). PRAMEL1 farging ble også sett i cytoplasmatiske dråper av epididymal spermatozoer (Fig. 6d). Vi fant at 55% av epididymal spermatozoer hadde cytoplasmatiske dråper plassert ved den distale ende av midtstykket. Rundt 73% av de cytoplasmatiske dråpebærende spermier viste PRAMEL1 signal i det cytoplasmatiske dråpe (fig 6d;. Tabell 2). Vi observerte også at prosentandelen av cytoplasmatiske dråpebærende spermatozoa varierte blant de tre mus studert. For både testikkel og epididymal sædceller, ble det ikke PRAMEL1 farging observert i det ringformede område av flagellen. TUBA ble lokalisert i fremre acrosomal regionen sperm hoder, og midtstykket og rektor stykke sperm flagellen av epididymal sædceller (Fig. 6a, b, d, og e). Ikke noe signal ble observert når primære antistoffer ble utelatt i løpet av fargingen, noe som tyder minimale ikke-spesifikk binding av fluorescent-merkede sekundære antistoffer (Fig. 6c, f).
Mus sædceller oppsamlet fra squash preparater av sædkanaler (a , b og c) og bitestikkel (d, e og f) ble farget med PRAMEL1 (grønn), TUBA (rød) antistoffer og DAPI (blå). Den PRAMEL1 farging ble observert i akrosom-regionen av testiklene og epididymal spermatozoer (a, b, d og e). I testiklene sædceller (a) PRAMEL1 ble også påvist i hoved stykke sperm flagellen, mens i epididymal sædceller (d og e) PRAMEL1 farging ble observert hovedsakelig i tilkoblingsstykke, midtstykket og cytoplasmatiske dråpen. Som et sekundært antistoff kontroll av testiklene (c) og epididymal (f) spermatozoer ble farget med FITC-merket esel anti-geit IgG og TRITC-merket esel-anti-muse-IgG. Forstørrelse × 1000. Scale bar = 10 mikrometer.
Diskusjoner
Selv om PRAME har blitt grundig studert i tumorigenesis og kreft biologi, og blir brukt som en biomarkør for kreftdiagnose og antigen spesifikk kreftimmunterapi [28] – [32], [34], er funksjonen av den PRAME genfamilien i gametogenese og reproduksjon har ikke blitt karakterisert. I denne studien, preget vi mRNA og protein uttrykk av musen
Pramel1
genet, et medlem av
Prame
genet familie, under testiklene utvikling og spermatogenesen. Våre resultater klart indikerte at PRAMEL1 er uttrykt i cytoplasma av spermatocytter og acrosome og flagellen av spermatider og sædceller, som gir den første innblikk i potensialet funksjonen til
Prame
genet familie i spermatogenesen. For å forstå den biologiske rolle (r) i dette hele genet familien og forholdet mellom
Pramel1 Hotell og andre familiemedlemmer, vi hentet uttrykks data for totalt 10
Prame
paraloger fra Gene Expression Omnibus (GEO) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/geo) (tabell 3) [35] – [40]. Kombinert med RT-PCR data hentet fra dette arbeidet, var vi i stand til å klynge disse paraloger inn i tre hovedgrupper basert på deres romlige og tidsmessige uttrykk profiler: gruppe I, uttrykkes bare i mannlig gonade og bakterie celle (
Prame
og
Pramel1
); gruppe II, uttrykkes bare i kvinnelige gonade og bakterie celle (
Oog1-3
); og gruppe III, hovedsakelig uttrykt i både mannlige og kvinnelige gonader (
Pramel, Praeml3, Pramef8, Pramef12, etter og
Oog4
) (tabell 3). Kollektivt, de avvikende uttrykk mønstre av
Prame
paraloger under gametogenesis i både mannlige og kvinnelige indikerer at ulike medlemmer av
Prame
genet familien kan være involvert i ulike utviklingsstadier av gametogenesis og embryogenese.
Det har blitt rapportert i tidligere studier at ulike CTAs er involvert i ulike stadier av spermatogenesen. Noen av disse er uttrykt utelukkende i ett trinn, slik som SYCP1 (
synaptonemal sammensatt protein 1
, også kjent som HOM-TES-14), som er begrenset til meiotisk prophase av spermatocytter, og SP17 (
sperm protein 17
), som uttrykkes i den modne sædceller eneste [41], [42]. Andre CTAs som CTAG1 (
kreft /testis antigen 1
, også kjent som NY-ESO-1) og TRO (
trophinin
, også kjent som
magphinin
eller MAGE D3), er uttrykt i flere stadier av spermatogenesen. CTAG1 er uttrykt i spermatogoniene gjennom pachytene spermatocytter [43], [44], mens TRO er uttrykt i nesten alle typer kjønnsceller fra spermatogoniene å modne sædceller [45]. I denne studien har vi vist at, i likhet med
Tro
genet, mus
Pramel1
uttrykkes bredt i ulike typer kjønnsceller under spermatogenesis. Den PRAMEL1 protein ble først oppdaget, men på et relativt lavt nivå, i de nyfødte testes ved Western blotting, noe som tyder uttrykk for PRAMEL1 i spermatogonier. En gradvis øket nivå av PRAMEL1 ble påvist i testikler ved 1-, 2-, 3-ukers alder og opprettholdt på høyere nivå i modne testiklene. Denne økningen i proteinekspresjon faller sammen med økningen i RNA-ekspresjon fra nyfødt til en uker gamle testikler, og kan forklares ved en opp-regulering av genekspresjon, eller alternativt ved en økning i antallet av basillceller som der er dramatisk bakterie celleproliferasjon før den første bølgen av spermatogenesen.
i motsetning til de kreftceller hvori PRAME protein ble lokalisert i kjernen, ble musen PRAMEL1 første sett i cytoplasma av spermatocytter i 2-ukers gamle testikler i denne studien. En dominerende ekspresjon av det PRAMEL1 protein ble deretter observert i det fremre området av (rund, forlengelse og langstrakt) spermatider, samordne med morfologiske forandringer av akrosom, noe som antyder at
Pramel1
spiller en rolle i utviklingen akrosom . Videre observerte vi at PRAMEL1 ble differensiert fordelt langs forskjellige deler av sperm flagellen mellom testikler og epididymal spermatozoer. Som spermatozoa forsterkningen motilitet ved overgangen fra testis til kaudal region fra epididymis, kan den differensielle lokalisering av PRAMEL1 langs forskjellige deler av flagellen i løpet av sperm overgangen være en indikasjon på at PRAMEL1 er involvert i sæden modning og motilitet (se omtale nedenfor ).
Tidligere studier på kreftceller viste at PRAME fungerer enten som en transkripsjons suppressor av RA signalering [27], eller som en transkripsjonen aktivator i promotorområdene bundet av NFY [29], [32]. Men våre data tyder på at
Pramel1
kan ikke delta i transkripsjon regulering gjennom ra- og NFY-medierte mekanismer fordi (1) PRAMEL1 er lokalisert til cytoplasma av kjønnsceller under spermatogenesis, og (2) viktigst, transkripsjon er stengt i midten av spermiogenesen [27], [29], [31] og sædceller er terminalt differensierte celler egentlig blottet for transkripsjonen og translasjonell aktivitet [46].
Det er verdt å merke seg at to LRR- inneholder, testikkel-uttrykte proteiner har vært innblandet i spermiogenesen, nemlig LRRC67 (
leucine-rik gjenta inneholder 67
, også kjent som testikkel LRR eller TLRR) og PPP1R7 (
protein fosfatase 1, regulatoriske (hemmer) subenhet 7
, også kjent som Sds22) [47], [48]. Begge proteiner samhandle med en sentral fosfatase,
protein fosfatase en product: (PP1), som fungerer som en hub gen i flere reguleringsprosesser [46] – [48]. Den LRRC67-proteinet reagerer med PP1 for å danne et kompleks som er involvert i cytoskjelettet omleiring i hannkjønnsceller [49]. Den LRRC67 proteinet reagerer også med en kinesin relaterte molekylære motor, KIFC1 (
kinesin familiemedlem C1
), for å transportere molekyler langs mikrotubuli i leppe [33], [50]. Tilsvarende har samspillet mellom PP1 og PPP1R7 også vært innblandet i sperm utvikling. Den dimerisering av PPP1R7 og PP1γ2 fører til en nedgang på fosfatase aktivitet PP1γ2 og deretter induserer bevegelighet av hale sædceller [51], [52]. På grunn av lignende strukturelle og uttrykk mønstre, spår vi at PRAMEL1 kan samhandle med PP1γ2 å transportere molekyler langs mikrotubuli i sperm flagellen. Det gjenstår å bli etablert om PRAMEL1 utfører tilsvarende funksjon i acrosome formasjon og sperm motilitet.
Materialer og metoder
Dyr
C57BL /6J mus ble avlet i vår koloni på Pennsylvania State University mus anlegget, og totalt seks par oppdrettere ble satt opp. Testiklene ble fjernet fra mus på 0 dag (nyfødt), 1 uke, 2 uker, 3 uker, 4 uker og 8 ukers alder. Minst tre dyr (biologiske gjentak) ble anvendt for hver tid. Testikler, bitestikkel og andre vev fra den voksne mannlige oppdrettere og eggstokker fra de kvinnelige oppdrettere ble samlet etter hekkeperioden. Alle dyr prosedyrer ble godkjent av Pennsylvania State University Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC).
Utarbeidelse av testikkelvevet
For testikkel histologi, hele testiklene ble dissekert ut av voksne mus og fast ved inkubasjon over natten i Bouin løsning (Sigma-Adrich, St. Louis, MO) ved 4 ° C. Vevene ble deretter vasket i 70% etanol, dehydrert og innstøpt i parafinblokker. De parafininnstøpte vev ble seksjonert ved 4 um ved anvendelse av en mikrotom og montert på objektglass.
Squashed testis Prøvene ble fremstilt som tidligere beskrevet [53]. Kort sagt ble de voksne testikler tatt ut og overført til en glass Petri skål inneholdende iskald PBS (140 mM NaCl, 2,6 mM KCl, 6,4 mM Na
2HPO
4, og 1,4 mM KH
2PO
4, pH 7,4). Etter å ha fjernet tunica albuginea, ble sædkanaler overført til en ny petriskål med PBS. Bruke fin pinsett ble tubuli trukket forsiktig fra hverandre og en liten del av single tubuli ble kuttet. Stykket av seminiferous tubuli ble overført til en ny petriskål og 15-30 pl av 0,1 M sukrose-løsning fremstilt i PBS ble tilsatt. Cellene ble frigjort fra tubuli med pinsett hverandre tubuli og re-suspendere den i sukrose-løsningen ved å pipettere opp og ned.
