Abstract
Den økende interessen for å kvantifisere den molekylære grunnlaget for protein kinase aktivering og allosterisk regulering av kreft mutasjoner har drevet beregnings studier av allosterisk signalisering i proteinkinaser. I denne studien, kombinert vi datasimuleringer og energien landskapsanalyse av protein kinaser å karakterisere samspillet mellom onkogene mutasjoner og lokalt frustrerte områder som viktige katalysatorer av allostetric kinase aktivering. Mens strukturelt stiv kinase kjernen utgjør en minimal frustrert knutepunkt for den katalytiske domene, lokalt frustrert rester klynger, hvis interaksjon nettverk er ikke energisk optimalisert, er utsatt for dynamisk modulering og kan føre til at allosteriske konforme overganger. Resultatene av denne undersøkelsen har vist at energi landskapet effekten av onkogene mutasjoner kan være allosteriske med å utløse globale forandringer i den romlige fordeling av meget frustrerte rester. Vi har funnet at mutasjon indusert allosterisk signalering kan medføre en dynamisk kobling mellom strukturelt stiv (minimal frustrert) og plast (lokalt frustrerte) klynger av rester. Den presenterte studien har vist at aktivering kreft mutasjoner kan påvirke termodynamisk likevekt mellom kinase statene ved allosterisk å endre fordelingen av lokalt frustrerte områder og øke den lokale frustrasjon i inaktiv form, mens de eliminerer lokalt frustrerte nettsider og gjenopprette strukturell stivhet av den aktive formen. Energien landsape analyse av protein kinaser og den foreslåtte rolle lokalt frustrerte steder i aktiveringsmekanismer kan ha nyttige konsekvenser for bioinformatikk basert screening og testing av funksjonelle områder kritiske for allosterisk regulering i komplekse biomolekylære systemer
Citation. Dixit A, Verkhivker GM (2011) The Energy Landscape Analyse av kreft mutasjoner i proteinkinaser. PLoS ONE 6 (10): e26071. doi: 10,1371 /journal.pone.0026071
Redaktør: Jie Zheng, University of Akron, USA
mottatt: 21 juni 2011; Godkjent: 19 september 2011; Publisert: 06.10.2011
Copyright: © 2011 Dixit, Verkhivker. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet er delvis støttet av midler fra The University of Kansas. Ingen ekstra ekstern finansiering ble mottatt for denne studien. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Rask og effektiv kommunikasjon av lang konformasjonsendringer på proteiner spiller en viktig rolle i allosterisk regulering av biologiske systemer [1], [2]. Nye banebrytende vurderinger av protein allostery har vektlagt en sentral rolle cooperativity og den oppfatningen at katalyse og allostery kan dukke opp via vanlige kommunikasjonsveier [3], [4]. Modellering av allosteriske overganger i biologiske molekyler har blitt betydelig fremmet av utviklingen av elastiske nettverksmodeller og normal modus analyse tilnærminger [5] – [22]. Elastiske nettverksmodeller av protein dynamikk og signal forplantning teori har tillatt for en kvantitativ analyse av langtrekkende allosteriske protein interaksjoner [13] – [16]. Sekvens-baserte evolusjonære analyse [23], [24] og strukturbaserte tilnærminger [19], [20], [25] – [27] har vist at allosteriske baner i proteiner kan bli dannet ved interaksjoner av evolusjonær konservert og tynt tilkoblet klynger av rester som er energisk koblet til mekle langtrekkende kommunikasjon. En omfattende analyse av allosteriske mekanismer har ført til en enhetlig oversikt over allosterisk regulering som innebærer eksistensen av preexisting konforme stater og flere kommunikasjonsveier på conformational landskapet [28] – [32]. Energi landskaps teorier og forenklede energimodeller har gitt et robust teoretisk rammeverk for å belyse grunnleggende aspekter av proteinstruktur, dynamikk og allosterisk regulering [33] – [43]. I henhold til moderne energimarkedet teori, tilfeldige sekvenser har robuste landskaper med mange lokale minima på grunn av alvorlige motstridende interaksjoner (et fenomen kalt «frustrasjon») og, som et resultat av forekomsten av strukturelt alternative ennå energisk lignende konformasjoner. Energilandskapsmodeller har også foreslått at proteinlignende sekvenser kan ha utviklet seg til å delvis eliminere frustrerte interaksjoner mellom aminosyrer og har glattet ( «trakt-lignende») landskap å sikre rask folding til deres termodynamisk stabile innfødte strukturer. Dette har blitt kjent som «prinsippet om minimal frustrasjon «[44], [45]. Den kanaliseres-lignende karakter av energi landskap for naturlige proteiner innebærer at conformations som er strukturelt ligner på naturlig tilstand er også lav i energi, og de innfødte statlige interaksjoner er minimal frustrert [33] – [45]. En generell oversikt over allosterisk regulering basert på energi landskapet teori (ofte betegnet som en «konformasjonell utvalg modellen») tyder på at et protein som kan fungere i en dynamisk likevekt av strukturelt forskjellige konformasjonelle tilstander, hvorved virkningen av binde- eller mutasjon kan formeres i løpet lange avstander med samvirkende å forskyve likevekten mot en funksjonelt relevant konformasjon [46] – [52]. Den «gamle» view (indusert fit mekanisme) og den «nye» view (conformational utvalg mekanisme) av protein allostery syntes ikke å være gjensidig utelukkende, men snarere komplementære i rasjonalisere allosteriske mekanismer på molekylært nivå [53] – [56]. Fysikkbasert simulerings tilnærminger har gitt en overbevisende bevis for kopling mellom kollektive bevegelser og lokale strukturelle endringer som en viktig underliggende prinsippet om allosterisk kommunikasjon i biomolekyler [53] – [60]. Termodynamikk baserte tilnærminger har videre knyttet globale og lokale strukturelle forstyrrelser med gratis energi endringer av allosterisk kobling i mekanismene conformational koblings [61] – [64]. Dessuten har energi landskapsmodeller antydet at langtrekkende cooperativity av protein-protein interaksjoner under allosteriske overganger kan favorisere en kombinasjon av befolkningen-shift og indusert-fit mekanismer, mens korte avstander, allosterisk binding av proteiner med hemmere kan ofte fortsette via befolkningen-skiftemekanisme [65] – [72]
Ferreiro og Wolynes [69] nylig har avansert energi landskapet teori ved å kombinere biofysiske modellering og strukturelle bioinformatikk analyser av lokale protein interaksjoner som er grunnleggende for folding. , binding og allosterisk regulering. Ifølge denne modellen, kan minimalt frustrerte landskap av protein nettverk har utviklet seg til å få muligheten til regulering via samarbeids allosteriske endringer. Den foreslåtte metoden har kvantifisert graden av romlige lokal frustrasjon i proteiner ved hjelp av en lokal versjon av den globale gap kriteriet formulering av minimal frustrasjon prinsippet [33] – [45]. Denne modellen innført en lokal frustrasjon metrisk betegnet «konfigurasjonsmessige frustrasjon indeks» som et mål for lokal stabilisering for et enkelt naturlig par med hensyn til et sett av strukturelle lokkeduer som genereres ved å perturbere både identiteter og plassering av de samvirkende aminosyrene [69], [ ,,,0],70]. I henhold til dette kriteriet, dersom interaksjonen energien til en innfødt par av rester er tilstrekkelig stabilisering i forhold til settet av strukturelle lokkeduer, denne rest paret er betegnet som «minimalt frustrert », ellers kan interaksjonene kan bli klassifisert som enten» nøytral » eller «lokalt frustrert». Det er verdt å merke seg at prinsippet om minimal frustrasjon ikke krever en fullstendig eliminering av lokalt stabile alternative strukturer. En viss grad av lokal frustrasjon er alltid til stede i en ellers stort sett unfrustrated proteinstruktur og kan ha oppstått fra evolusjonære krav for å tilpasse protein dynamikk for spesifikke funksjoner [43].
Analysen av lokalt frustrerte protein regioner ved hjelp av en ikke- -redundant sett av 314 monomere proteindomener og et utvalgt sett av nonredundant dimere komplekser har vist at de lokalt frustrerte områder svarer til de som er involvert i binding med andre makromolekyler og ligander regioner, og kan ofte sammenstille med de funksjonelle grupper utsatt for store strukturelle endringer [69 ], [70]. Wolynes og medarbeidere har nylig undersøkt en utvalgt database med allosteriske proteiner med kjente inaktiv og aktiv krystallstrukturer og har vist at allosteriske proteindomener er forbundet ved et nett av minimal frustrerte interaksjoner, mens høyt frustrerte rester kan fortrinnsvis gruppert nær protein overflaten [71 ], [72]. Ifølge denne studien, minimalt frustrerte regioner i allosteriske proteiner domener utgjør nesten 40% av de totale kontaktene, med omtrent 10% av den totale interaksjoner anses å være «høyt frustrert», og resten av interaksjoner tilskrives til kategorien «» nøytrale » .
protein kinaser signaliserer brytere med en konservert katalytisk domene som phosphorylate protein underlag og spiller en avgjørende rolle i cellesignalveier [73] – [82]. Protein kinase-gener utgjøre ca. 2% av alle gener i humane genom, og dette proteinfamilie består av mer enn 500 forskjellige medlemmer. Det krystallstrukturer på menneske proteinkinaser inkluderer 167 unike menneskelige protein kinase domener og 170 kinaser, vurderer nært beslektede orthologues (https://www.sgc.ox.ac.uk/research/kinases/). Strukturelle studier av protein kinase katalytisk domenestrukturer og regulatoriske protein komplekser har avdekket ulike scenarioer der kinaser kan styre en dynamisk likevekt mellom strukturelt lignende aktive og svært spesifikke inaktive kinase stater – en strukturell kjennetegn på kinase domene kritisk for normal funksjon [83] – [89]. Allosterisk regulering kan oppnås via forskjellige mekanismer, inkludert inhibitor-indusert stabilisering av den spesifikke inaktive konformasjon i ABL [90] – [95], BRAF [96], KIT [97], PDGFR, P38 [98], PI3K kinaser [99] og binding til allosterisk myristoyl-bindende lomme i ABL [100] – [103]. Protein kinase aktivering kan også reguleres via dannelse av strukturelt ulike regulatoriske komplekser særlig eksemplifisert for ABL [104], [105] og EGFR kinaser [106] – [109], men likevel en samlende strukturell mekanisme forbundet med asymmetriske tyrosinkinase ordninger i regulerings komplekser kan ligge under den aktiveringsmekanisme for hele EGF-protein familien [110] – [113]. En jevn fremgang i forståelsen av protein kinase mekanismer har drevet en betydelig innsats for å oppdage og design selektive ATP-konkurrerende og allosteriske hemmere rettet mot bestemte former for kreft, kinase kreft mutanter og tilknyttede målrettede trasé [114] -. [116]
unormal aktivering av regulering i proteinkinaser er en dominerende kilde av tumorassosierte somatiske mutasjoner. Strukturelle og mutagenese undersøkelser av ABL [93] – [95] og EGFR kinaser [117] – [119] har avdekket strukturelle divergens av kinaser som svar på aktiverende mutasjoner. Kinome omfattende bioinformatikk studier har bidratt til identifisering av konserverte sekvensmotiver som bærer sykdomsassosierte og kreft mutasjoner, noe som tyder på at et betydelig antall onkogene kreft mutasjoner kan danne strukturelt konserverte mutasjons hotspots innenfor kinase katalytiske kjerne [120] – [123]. Datasimulering studier har undersøkt molekylære mekanismer av protein kinase aktivering i c-Src [124] – [127], adenylatkinasen [128], ABL [129], cdk5 [130], KIT [131], RET, MET [132] og EGFR kinase [133] – [135]. Multi-skala simulering studier av konforme overganger i normale og onkogene former for ABL og EGFR kinaser har indikert at virkningen av de onkogene mutanter kan spres utover den umiddelbare området av mutasjon som fører til globale allosteriske endringer [134]. I det siste har beregnings modellering av allosterisk regulering viste organiserende prinsipper for mutasjon-indusert aktivering i ABL og EGFR-kinaser, som kan bestemmes ved hjelp av en dynamisk kobling mellom strukturelt stiv koaks-heliks og konformasjonelt adaptiv ai-heliks og αC-spiraler [136] . Disse strukturelle elementer danner et dynamisk nettverk av effektivt samspill funksjonelle regioner som kan universelt styrer langtrekkende Interdomain kommunikasjon og allosterisk aktivering i proteinkinaser. Energilandskaps studier har tidligere antydet at lokaliserte frustrasjon kan ha sammenheng med allosteriske konformasjonsendringer på proteiner [69] -. [72]
Til sammen har beregnings studier antydet at molekylære mekanismer for allosterisk regulering i proteinkinaser kan være rives ved hjelp av modeller av mutasjon-indusert modulering av conformational landskapet og konforme utvalgsprinsipper av termodynamisk aktuelle statene. I dette arbeidet ble kinome baserte strukturelle bioinformatikk analyse og biofysiske modellering av protein kinase strukturer ansatt for å karakterisere og kvantifisere samspillet mellom onkogene kinase mutasjoner og lokalt frustrerte nettsider som potensielle katalysatorer og formidlere av kinase aktivering. Resultatene av denne undersøkelse tyder på at energien landskapet effekten av onkogene mutasjoner kan være allosterisk i naturen, utløsning av globale forandringer i den romlige fordeling av meget frustrerte rester. Vi viser at kreft mutasjoner kan fungere ved samtidig perturbing nettverket av minimal frustrerte interaksjoner i den inaktive kinase staten, og samtidig redusere lokal frustrasjon og gjenopprette allosteriske interaksjoner i den aktive kinase form. Derfor kan lokalt frustrerte steder i den katalytiske kjerne tjener en viktig funksjonell rolle ved at mutasjon-indusert konformasjonsforandringer overganger mot konstitutivt aktiv kinase konformasjon.
Resultater
Energi Landskap og Lokal Frustrasjon i Protein kinaser
i denne studien, kombinert vi molekyldynamikk (MD) simuleringer av proteinkinaser med energi landskapsanalyse for å karakterisere rollen som lokal frustrasjon som en viktig faktor i forbindelse med allostetric kinase aktivering. Fra energimarkedet perspektiv, bør de mekanistiske trekk ved aktiverings overgangene bli bestemt av den strukturelle topologien av kinasedomenet fold og derfor kunne fange fremtredende aspekter ved aktiveringsmekanismen. For å undersøke hvilken rolle lokale frustrasjon i konforme overganger mellom strukturelt ulike funksjonelle tilstander, undersøkte vi de lokale frustrasjon profilene i protein kinase strukturer og preget nettverk av minimalt frustrerte interaksjoner med ansvar for strukturell stabilitet av kinase katalytiske kjerne. Vi har også plassert og preget klynger av lokalt frustrerte områder der minimal frustrasjon prinsippet kan bli krenket. Endringen i konfigurasjonsmessige frustrasjon indeksen ved mutasjon kan gi et kvantitativt mål på en tendens til å få til en konformasjonsendring i proteinet. Effekten av kinase kreft mutasjoner på lokale frustrasjon profiler tillatt oss å kvantifisere hvor mutasjon-indusert omfordeling av lokalt frustrerte rester kan fremme allosteriske overganger mellom strukturelt forskjellige funksjonelle tilstander. Konfigurasjonen frustrasjon indeksen kunne måle den relative stabiliteten av et spesielt innfødt kontakt i forhold til settet av alle mulige kontakter i den posisjonen, noe som tillater å klassifisere de enkelte tilpassede kontakter i proteinstrukturen i henhold til deres frustrasjon nivå. En kinome bred undersøkelse av konfigurasjonsmessige frustrasjon indeksen beregnet for et stort antall av proteinkinase-krystallstrukturer (tabell S1 i File S1) viste at typiske verdier kan være i området mellom -4 til +4. Den samlede rest-basert distribusjon av en frustrasjon indeks for de villtype (WT) kinaser ble forutinntatt mot minimal frustrerte rester med de positive verdier av frustrasjonen indeksen (figur 1A). Fordelingen viste også en mindre grunt topp tilsvarende lokalt frustrerte rester med frustrasjon indeks i området fra -0,6 til -0,7-enheter. Virkningen av mutasjoner resulterte i en subtil, men merkbar endring i fordelingen lokal frustrasjon i den katalytiske kjerne, avslører en andre like viktige topp rundt -1,0 verdi. Derfor er den totale fordelingen var nesten jevnt fordelt mellom minimal frustrerte og frustrerte rester og etterlater mindre rester på nøytral status (figur 1B).
(A) Vill-type kinaser og (B) Mutant kinaser.
Vi fokuserte deretter på lokal frustrasjon analyse utført for en undergruppe av protein kinase gener (ABL, EGFR, BTK, KIT, BRAF, MET, og RET) som står for det store flertallet av svært onkogene mutasjoner i det katalytiske domenet (tabell S2 i File S1). Disse protein kinase genene ble valgt for en mer detaljert analyse på grunn av rikdommen av strukturell og funksjonell informasjon som ga utfyllende eksperimentelle data for validering av modellene våre. Enda viktigere er imidlertid en mangfoldig repertoar av aktivering og medikamentresistente mutasjoner i disse kinaser genene representerer kritiske kreftgjerningsmannen som kan ofte bidra til en tilstand av onkogen avhengighet i en rekke krefttyper. Fordelingen av lokal frustrasjon hos disse kinase-genene, som målt ved konfigurasjonsmessige frustrasjon indeksen, viste et tydelig mønster hvor toppene ble merkbart forskjøvet i retning av mer frustrerte rester for både WT og muterte kinaser (figur 2). Prosentandelen av minimal frustrerte interaksjoner i den katalytiske kjerne sto for mer enn 40% av de totale kontaktene, med omtrent 15-20% av interaksjoner betraktes som frustrert og resten nøytral. Denne analysen generelt enige med den rapporterte fordeling av frustrerte regioner og delingen av minimal og svært frustrerte rester i proteiner [69], [70]. Imidlertid, den gjennomsnittlige andel av lokalt frustrerte rester var høyere hos proteinkinaser enn den som rapporteres for små monomere proteiner. Derfor våre data antydet at konforme landskap av kinase onkogener kan være preget av en økt grad av lokal frustrasjon og protein mobilitet.
(A) Wild-type kinaser og (B) Mutant kinaser. Et sett med ansatt kinase onkogener inkludert ABL, EGFR, BTK, KIT, MET, BRAF, og RET kinaser. Analysen inkluderte mutanter av disse kinase gener med høy onkogene potensial i henhold til frekvens profiler i mutasjons prøver ( 5). Hentet fra den kosmiske depotet [153]
Basert på denne analysen, vi foreslått at den romlige fordelingen av lokal frustrasjon i proteinkinaser kan reguleres og lett endres av onkogene mutasjoner. Ifølge vår formodning, kunne aktivere kinase mutasjoner forsterke lokal frustrasjon i inaktiv status, mens eliminere (eller delvis fjerning) lokalt frustrerte steder i aktiv tilstand. Som resultat av dette kan mutasjon-indusert omfordeling av lokal frustrasjon i proteinkinase strukturer bidrar til de molekylære mekanismer som styrer kinase-aktivitet ved å endre den dynamiske likevekt mellom funksjons kinase former. For å bekrefte denne hypotesen, analyserte vi endringer i de lokale frustrasjon profiler for et representativt sett av svært onkogen ABL (figur 3) og EGFR kinase mutanter (figur 4) i begge inaktive og aktive stater. Vi observerte at svært onkogene mutasjoner kan faktisk føre til en økning i den lokale frustrasjon over muterte rester i den inaktive autoinhibitory staten ABL (PDB ID 1IEP) [90] og EGFR (PDB ID 1XKK) [117] (figur 3, 4). Derfor kan kinase mutasjoner med en høy onkogene potensial destabilisere autoinhibited kinase form. Viktigere, kan onkogene mutasjoner delvis avhjelpe lokal frustrasjon i den aktive kinase-tilstand (figurene 3, 4). En mer omfattende minimal frustrert nettverk av interaksjoner avstiver den aktive formen av det katalytiske domenet for ABL (PDB ID 1M52) [91], [92] og EGFR (PDB ID 2J6M) [118]. Selv om krystallstrukturer som benyttes i vår studie (tabell S1 i File S1) ble stort sett løst i ubundet form, var det noen strukturer i studert sett (spesielt ABL og EGFR kinaser) som opprinnelig ble krystallisert i komplekser med ATP eller små molekyl hemmere . Siden ATP-binding kan potensielt øke strukturell stivhet av katalytiske domene, det lokale frustrasjon analyse som inkluderte strukturer med en fjernet ATP kan produsere kunstige endringer i frustrasjon indeksen for binding nettstedet rester. Vi evaluerte den totale statistiske fordelingen av form frustrasjon ved hjelp indeksen krystallstrukturer med bundne molekyler. Effekten ble funnet å være ganske ubetydelig, og den resulterende fordeling var praktisk talt umulig å skille fra den som er vist i figur 1. Faktisk en signifikant fraksjon av proteinkinase-residuer som er involvert i bindingsseteinteraksjoner hører til den strukturelt stive hengsel-regionen som er en minimal frustrert element av den katalytiske kjerne og som sådan robust til mindre forstyrrelser av interaksjoner. Men vi fant noen interessante små variasjoner i de lokale frustrasjon profiler av ABL (figur S1) og EGFR kinaser (Figur S2), som ble observert for onkogene mutasjoner i glysin rike P-loop (ABL-G250E, ABL-Q252H, ABL-E255K, EGFR-G719S, EGFR-G719A, EGFR-G719C). Det er kjent at P-loop i ABL kinase kan stabiliseres i Imatinib-bundet inaktive struktur, noe som kan forklare den økte lokale frustrasjon på P-loop-mutasjoner i inaktiv tilstand (Tall S1, S2). Interessant nok er disse punktmutasjoner er kjent for å svekke binding av Imatinib (Glivec) til ABL ved å skifte den termodynamiske likevekten mot den aktive formen uforenlig med inhibitor-bindings [114] – [116]. Våre data antydet at mutasjon-indusert lokal frustrasjon i inhibitor-bundet inaktive kinase tilstand kan delvis bidra til å initiere en befolkning skift mellom funksjonelle former. Vi har også analysert fordelingen og strukturelle partisjon av minimal frustrerte og lokalt frustrerte regioner i ABL kinase (Figur S3). Et tett nettverk av minimalt frustrerte rester ble funnet i den strukturelt stiv kjerne av det katalytiske domenet (forbundet med grønne linjer). Denne minimalt frustrert web ble dannet av strukturelt konservert koaks-helix og αE-helix. I kontrast til klynger av lokalt frustrerte rester (forbundet med røde linjer) montert på proteinet periferien, inkludert αC-helix, aktivering sløyfe, P + 1 sløyfe i den C-terminale lobe. Som autoinhibiting interaksjoner utgitt i aktiv form, kan proteinkinaser bli mer fleksibel med en betydelig grad av gjenværende lokal frustrasjon. Dette ble reflektert i økt tilstedeværelse av lokalt frustrerte rester forbundet med røde linjer i αC-helix, og C-terminal flik av den aktive ABL (figur S3b).
Resten baserte frustrasjon indeksverdiene vist for et sett med onkogene ABL kinase mutanter i den inaktive (A) og aktive former (B). De frustrasjon indeksverdier er vist i fylte gule barer for villtype kinase form og i røde fylt barer for mutante former. Analysen ble utført på ubundet form av krystallstrukturer av ABL i inaktiv form (PDB ID 1IEP) [90] og aktiv form (PDB ID 1M52) [91], [92].
Resten baserte frustrasjon indeksverdier er vist for et sett av onkogene EGFR kinase mutanter i den inaktive (A) og aktive former (B). De frustrasjon indeksverdier er vist i fylte gule barer for villtype kinase form og i røde fylt barer for mutante former. Analysen ble utført på ubundne form av krystallstrukturer av EGFR i inaktiv form (PDB ID 1XKK) [117] og aktiv form (PDB ID 2J6M) [118].
Lokale Frustrasjon og protein fleksibilitet
Vi har også undersøkt forholdet mellom lokal frustrasjon og protein fleksibilitet kinase strukturer. I våre tidligere studier, har vi preget konformasjonelle landskap av ABL, EGFR, RET og MET-kinaser, så vel som ulike kreft mutanter ved bruk av MD-simuleringer av Apo kinase og komplekser med ATP og lavmolekylære inhibitorer [132], [134], [ ,,,0],136]. Her sammenlignet vi resultatene av lokal frustrasjon analyse med kinase fleksibilitet profiler, som ble utledet fra MD-simuleringer og evaluert ved hjelp av root mean square svingninger (RMSF) av det katalytiske domenet rester. Spesielt, MD studier av ABL og EGFR-kinaser i de normale og onkogene tilstander viste en høy lokal fleksibilitet i den nedre del av aktiverings sløyfen [134], [136]. Tilsvarende bunt av a-helikser i den C-terminale, som representerte den tetteste klyngen av minimal frustrerte rester (figurene S4, S5), viste også den minste variasjon i de RMSF verdiene – et karakteristisk for strukturelt stiv protein kjerne [134] . De lokale frustrasjon profiler også matchet opp pent med B-faktorer av protein kinase rester. Et eksempel på en slik sammenlignende analyse ble beskrevet for EGFR-WT i den aktive form (figur S5). En robust sammenheng ble funnet mellom rest-baserte lokale frustrasjon indeksen og B-faktorverdier (Figur S5 D). Vi observerte også at svært frustrerte EGFR rester tilsvarte konformasjonelt mobile regioner med høyere B-faktorverdier. For ytterligere å illustrere disse funnene, utførte vi strukturell kartlegging av gjennomsnittlig B-faktorer på et sett av inaktive (figur S5 A) og aktive strukturer (figur S5 B) av ABL, EGFR, BTK, KIT, BRAF, MET, og RET kinaser . I tillegg lokalt frustrerte restene ble også kartlagt på den katalytiske kjerne. De lokalt frustrerte nettsider samsvarer med protein regioner med økt termisk mobilitet og overlappet med proteinrester høyere B-faktorer.
Analysen av protein kinase fleksibilitet har også vist at konformasjonsendringer i funksjonelt viktige kinase områder kan være allosterisk kombinert og høyt korrelert. Mer spesifikt, fant vi bevis for høyt korrelerte protein bevegelser og allosterisk kobling av αC-helix og aktivering sløyfe med alle andre kinase regioner (Tabell S3 i File S1). Interessant, αC-helix og aktiverings sløyfe representert to mest koplede proteinkinase regioner. Andre sterkt korrelerte segmenter av det katalytiske domenet inkludert (a) hengselregionen og katalytisk løkke, og (b) P-løkke og aktivering sløyfe. Disse funnene konsistente med vår siste analyse av kollektive bevegelser i ABL og EGFR regulatoriske komplekser som manifestert i «puste» stive bevegelser i det katalytiske kjerne kombinert med svingningene i P-loop, aktivering loop, αC-helix og αG-helix av den C-terminale [136]. Mange strukturbiologi studier har også indikert en sentral involvering av αC-helix og aktivering sløyfe i allosterisk kobling som styrer reguleringen av protein kinase aktivitet [110] -. [113]
allosterisk Effekt av onkogene mutasjoner på lokal Frustrasjon
Vi har undersøkt om romlig fordeling av lokal frustrasjon kan presentere innvielses poeng for globale konformasjonsendringer og om effekten av onkogene mutasjoner på den lokale frustrasjon ville være lokale eller allosterisk. Hvis effekten av onkogene mutasjoner var lokal, ville det føre til at bare lokale forstyrrelser og resultere i negative verdier av frustrasjon indeksen for rester i umiddelbar nærhet av mutasjons området. Men hvis effekten av onkogene mutasjoner var global, kan den romlige fordelingen av høyt frustrerte rester være allosterisk berørt og resultere i merkbare forandringer ved den fjerntliggende fra mutasjons nettstedet regionene. En sammenligning av lokalt frustrert rester kartlegging i ABL-WT og ABL-T315I mutant avslørte subtile ennå relevante endringer, der de fleste av berørt rester var fjernt fra mutasjons området (figur 5). Vi observerte at gate-keeper mutasjon i inaktiv kinase form kan allosterisk forurolige strukturell stivhet av den katalytiske kjerne og øke lokal frustrasjon over koaks-helix, αE-helix, og αC-helix regioner. Våre funn bekreftet med en hydrogen-utveksling massespektrometri (HX MS) studie av abl-kinase [100], hvilket indikerer at effekten av ABL-T315I mutasjon kan resultere ikke bare i lokale konformasjonsmessige forstyrrelser i nærheten av den αC-helix, men også allosterisk forandre protein fleksibilitet i fjernt fra mutasjon protein regioner. Endringene i den lokale frustrasjon indusert av ABL-T315I mutasjon i den inaktive kinase kan bli vist i eksemplene som presenteres i figurene S6, S7. Mens frustrasjon plott av ABL-WT og ABL-T315I var som regel lik, det var noen endringer i den røde linjen klynger forbinder Asp-381 av DFG motiv til Glu-286 som gjør en viktig hydrogenbinding med Lys-271 (figur S6) . En annen endring kunne noteres i den anti-parallelle β-ark fra den nedre del av aktiverings sløyfe (figur S7). I denne regionen noen av restene bli svært frustrert over mutasjon som tydelig av røde linjer som kobler rester Tyr-393, Ala-395 og Pro-402.
Den romlige fordelingen av lokal frustrasjon i de inaktive former for ABL -WT (A) og ABL-T315I (B). Fargen skyve ordningen med lokal frustrasjon varierer fra minimalt frustrert (markert med blått) til svært frustrert (vist rød). De viktigste funksjonelle regioner av proteinkinase sammen med den respektive rekke proteinrester er referert til ved hjelp av piler. Strukturelle kartlegging av lokal frustrasjon på ABL kinase katalytiske kjerne er vist for den inaktive ABL-WT struktur (PDB ID 1IEP) [90]. Effekten av T315I på inaktive ABL strukturen ble evaluert via strukturell modellering beskrevet i Materialer og metoder. Den Pymol program ble brukt for visualisering av protein kinase strukturer og den lokale frustrasjon kartlegging (The PyMOL Molecular grafikksystemet, versjon 1.2r3pre, Schrödinger, og LLC).
Viktigere, delvis utbretting av anti- parallell β-ark ved den nedre ende av aktiverings sløyfen ble tidligere bestemt som en forutsetning for stabilisering av mellomproduktet Src-lignende struktur og en felles mekanistisk trekk ved de ABL og EGFR-aktiveringsveier [134]. I den Src-lignende konformasjon, ble αC-helix rotert og beveget ut av det aktive sete (αC-helix-Glu-out stilling), det DFG motiv vippet i den mellomliggende DFG-i posisjon, den anti-parallelle β-ark fra
