Abstract
Flere krefttyper er følsomme for deaktivering av bare én eller svært få gener som er stadig aktiv i kreftceller, et fenomen som er kalt «onkogen avhengighet «. Legemidler som er rettet mot produkter av disse onkogener kan gi en midlertidig lindring, og til og med komplett remisjon. Dessverre er mange pasienter som får onkogen målrettede terapier tilbakefall på behandling. Dette skjer ofte på grunn av somatiske mutasjoner i onkogen ( «motstand mutasjoner «). «Sammensatte mutasjoner «, som i forbindelse med kreftlegemiddelresistens er definert som to eller flere mutasjoner av medikamentet målet i samme klon kan føre til økt motstand mot de mest selektive inhibitorer. Her er det vist at de aller fleste av de resistente mutasjoner som forekommer hos kreftpasienter behandlet med tyrosin kinase inhibitorer rettet mot tre forskjellige proteiner følge en evolusjonær svei. Ved hjelp av verktøy bioinformatiske analyse, er det funnet at narkotika-resistente mutasjoner i tyrosinkinase domener av Abl1, ALK og eksoner 20 og 21 av EGFR favorisere transformasjoner til rester som kan identifiseres i tilsvarende stillinger i evolusjonære relaterte proteiner. Resultatene viser at evolusjonære presset former mutasjons landskapet i tilfelle av resistens somatiske mutasjoner. Begrensningene på mutasjons landskapet tyder på at det kan være mulig å motvirke én medikamentresistenspunktmutasjoner. Observasjonen av forholdsvis mange resistensmutasjonene i Abl1, men ikke i andre gener, kan forklares ved det faktum at mutasjoner i Abl1 tendens til å være biokjemisk konservativ, mens mutasjoner i EGFR og ALK tendens til å være radikal. Analyse av Abl1 sammensatte mutasjoner tyder på at slike mutasjoner er mer utbredt enn tidligere rapportert, og kan være vanskeligere å møte. Dette underbygger at slike mutasjoner kan gi en rømningsvei for målrettet kreft narkotika motstand
Citation. Friedman R (2013) Drug Resistance missense mutasjoner i kreft er gjenstand for Evolutionary begrensninger. PLoS ONE 8 (12): e82059. doi: 10,1371 /journal.pone.0082059
Redaktør: Raffaele A. Calogero, Universitetet i Torino, Italia
mottatt: 06.09.2013; Godkjent: 29 oktober 2013; Publisert: 20.12.2013
Copyright: © 2013 Ran Friedman. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien har vært støttet av Linnéuniversitetet Senter for biomaterialer kjemi. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatteren har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
kinase inhibitor (KI) imatinib er foreskrevet siden 2001 til kronisk myelogen leukemi (KML) pasienter [1]. Rettet mot tyrosin kinase domene av den unormale kimære protein BCR /Abl1, imatinib var den første vellykkede målrettet kreftmedisin. Etter sin bemerkelsesverdige suksess og relativ sikkerhet, er flere KIS nå administrert for behandling av ulike kreftformer, og mange andre er under utvikling [2]. Spesifisitet av KIS varierer, og noen medisiner brukes til å behandle flere typer kreft. Imatinib, for eksempel, er registrert i Sverige, ikke bare for behandling av CML men også Philadelphia kromosom-positiv akutt lymfoblastisk leukemi (Ph
+ – ALL), forskjellige blodsyndromer, gastrointestinal stromal tumor (GIST) og dermatofibrosarcoma protuberans (DFSP) . Fremme av genomsekvense teknikker gjør det mulig å identifisere pasienter som er mer sannsynlig å dra nytte av målrettet behandling basert på den genetiske profilen av svulstene. Videre er nye narkotika mål som er forskjellig fra kinaser blir ettertraktet. Eksempler inkluderer famesyltransferaseinhibitorene og varmesjokkprotein-antagonister.
Dessverre er mange pasienter etter hvert bli ufølsomt for behandling på grunn av somatiske mutasjoner i kinasedomenet av stoffet mål, som hindrer medikamentene fra hemme enzymer [3], [4]. Fremveksten av slike «sekundære mutasjoner «begrenser effekten av anti-kreft narkotika på lang sikt [5]. Oppdagelsen av at resistensmutasjonene føre til behandlingssvikt bedt utviklingen av andre (dasatinib, nilotinib) og tredje (bosutinib, ponatinib) generasjons Abl1 hemmere. Den klinisk mest beryktede Abl1 mutant er T315I, som er motstandsdyktig mot alle KIS unntatt ponatinib (nylig godkjent i USA og EU) og rebastinib (for tiden studert i kliniske studier). Studier med Ba /F3-celler, en praktisk modellsystem for KI utvikling, tyder på at motstanden mot ponatinib og rebastinib kan utvikle seg gjennom «sammensatte mutasjoner «, dvs to resistente mutasjoner som oppstår i samme klon av kreftceller [6], [7 ].
det er ikke mulig å følge utviklingen av resistens mutasjoner i enkelt kloner. Dette ville kreve evnen til å følge fremveksten av mutasjoner dynamisk, noe som ikke kan oppnås fordi prøvene skal bli sekvensert, og fordi mange av mutasjonene vil uunngåelig gå tapt i stedet for å festes i den cellelinjen. Av denne grunn har matematiske modeller for legemiddelresistens i cancer blitt utviklet og anvendt for å studere medikamentresistens under forskjellige scenarier. f.eks modifisere doseringen eller ved hjelp av flere inhibitorer [8] – [12]. Slike modeller gjør det mulig for testing av ulike hypoteser
i silico
, ofte i forbindelse med kliniske funn, før du går videre til celle eller kliniske studier.
Regnskap for de evolusjonære krefter som fører til resistens er viktig for utvikling av nye behandlingsregimer som vil være mindre sannsynlighet for å gi motstand. Hvis den evolusjonære landskapet er begrenset, små molekylære stoffer som er rettet mot de kjente mutanter er sannsynlig å lykkes. På den annen side, hvis stoffet målet kan innføre ytterligere mutasjoner uten en betydelig seleksjonspress, noe målrettet behandling vil til slutt svikte. Den nåværende paradigme i studier av resistente mutasjoner er at disse mutasjoner forekommer før behandling. Mutasjon priser i proteinkodende gener er i størrelsesorden 10
-9 erstatninger per år per område. Selv om mutasjon priser i kreftcellene er større 3-4 størrelsesordener, er det lite sannsynlig at mutasjoner utvikler i løpet av en behandlingsperiode på flere år, mens tilbakefall skjer ofte i løpet av måneder. Således må resistensmutasjonene tolereres før behandling. For dette formål er to scenarier er mulig. For det første kan man anta at alle kinase domene somatiske mutasjoner er selektivt nøytral eller svakt skadelig og derfor har en ikke-neglisjerbar sannsynlighet for å være fast i befolkningen [13]. Denne antakelsen kan rettferdiggjøres ved å hevde at den målrettet onkogen var allerede underlagt en gevinst på funksjon «mutasjon som fører til sin primære rolle i svulsten, og er nå relativt ufølsom for ytterligere mutasjoner. Hvis dette er sant, så den eneste begrensningen på fremveksten av resistente mutasjoner er substitusjons rate. I motsetning til dette, kan det antas at den aktive onkogen har en biologisk funksjon som kan bli kompensert ved mutasjoner, og dens evolusjonære landskap er begrenset ikke bare av hastigheten av mutasjon, men også ved rensing av utvalget. I dette tilfelle kan det å forstå omfanget av valget føre til utvikling av behandlinger som vil være
a priori
mindre følsom for medikamentresistens.
Her bruker jeg bioinformatiske analyse for å beregne hvilke disse scenariene er mer sannsynlig, dvs. om resistens mutasjoner i kinase domene vil trolig bli tolerert. For dette formål, I analysert utbredelsen av slike mutasjoner i sekvenser som er homologe til tre tyrosin kinaser som er viktige drug targets og hvor medikamentresistens på grunn av missense mutasjoner presenterer et akutt klinisk problem: epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR), anaplastisk lymfom kinase (ALK) og kinasedomenet av Abelson murin leukemi virus-onkogen homolog 1 (Abl1).
epidermal vekstfaktorreseptor
EGFR er et celleoverflate-reseptor tyrosin kinase (RTK) av ErbB familien. Forhøyet ekspresjon av EGFR er observert i kreft i forskjellige organer. Lavmolekylære inhibitorer av EGFR, slik som gefitinib og erlotinib ble godkjent for behandling av ikke-småcellet lungekreft (NSCLC). Disse molekylene er konkurrerende inhibitorer for ATP-bindings i det aktive sete av reseptoren. Tilstedeværelsen av flere somatiske mutasjoner i EGFR, som synes å gi øket kinase-aktivitet (aktiverende mutasjoner, også kjent som driver eller sensitive mutasjoner), er blitt korrelert med følsomhet for EGFR-hemmere [14] – [16]. Likevel, noen av de pasientene som fikk tyrosin kinase hemmere (TKI) ikke responderer på behandlingen, og bare ca 5% nyte fullstendig remisjon [17]. I mange tilfeller er behandlingssvikt på grunn av TKI resistensmutasjonene, som omfatter insersjoner og seks forskjellige missense mutasjoner i tyrosin-kinase domene [17], [18]. T790M er den vanligste av disse mutasjonene og overfører ligand uavhengighet.
anaplastisk lymfom kinase
ALK er en RTK som har vært forbundet med neuroblastom og lungekreft, gjennom ulike mekanismer. I lungekreft, fusjon av ALK og echinoderm mikrotubulus-assosiert protein-lignende 4 (EML4) fører til konstitutiv aktivering av kinasen [19]. I neuroblastom, på den annen side, økes ALK aktivitet forbundet med ALK genamplifikasjon, somatiske og kimlinje-mutasjoner [20] – [22]. ALK-hemmere blir nå utviklet som narkotika; den TKI crizotinib er i bruk hos lungekreftpasienter som bærer EML4-ALK-fusjonsprotein. Dessverre, kan sekundære mutasjoner føre til crizotinib motstand [23].
Abl1
Abl1 er et proto-onkogen som koder for en tyrosin kinase. Fusjonsproteinet BCR-Abl fører til kronisk myelogen leukemi (KML), som kan bli behandlet av TKI. 20 missense mutasjoner i Abl har vist seg å gi medikamentresistens (eller redusert sensitivitet) til minst en av de tre kommersielle stoffer imatinib, dasatinib og nilotinib [24]. En annen meta-analyse (dvs. analyse av funn fra flere eksperimenter som er rapportert i litteraturen) identifisert 34 slike mutasjoner basert på
in vitro
studier [25]. Angivelig, viser Bcr-Abl en mutator fenotype, dvs., det fører til kjøp av mutasjoner [26]. TKI behandling fører tilsynelatende til en nedgang i mutasjonsfrekvens [25], noe som indikerer at mutasjoner oppstår i hovedsak før behandling, mens mutante kloner bli dominerende som følge av TKI behandling.
Resultatene viser at narkotika-resistente mutasjoner i de tyrosinkinase domener av Abl1, ALK og eksoner 20 og 21 av EGFR favorisere transformasjoner til rester som kan finnes i tilsvarende stillinger i evolusjonære relaterte proteiner. Således er det vist at evolusjonære trykket former den mutasjons landskapet i tilfelle av medikament-resistenssomatiske mutasjoner. Analyse av sammensatte mutasjoner avslører en større andel av slike mutasjoner som ikke har vært hittil observert i relaterte sekvenser.
Resultater
epidermal vekstfaktor reseptor
Motstand mot erlotinib og gefitinib har vært knyttet til seks resistensmutasjonene [17], [18]. Analyse av sekvenser hvor kinasedomenet er homologt med det av EGFR viser at i 4 av de 6 motstand missense mutasjoner, er den samme aminosyre variasjon ble observert i andre sekvenser av beslektede proteiner (Tabell 1 og Tabell S1). Disse fire resistensmutasjoner er S768I, V769L, og T790M (på ekson 20), og T854A (på exon21), mens de to motstands mutasjoner som ikke kan observeres som SNVs i MSA (L747S og D761Y) er plassert på ekson 19. Dette kan forklares ved exon 19 er et mutasjons hot-spot, hvor mutasjoner forekommer i så mye som 45% av NSCLC [18]; det kan være at mutasjonsraten i ekson 19 er høy nok til at mutasjonene dukke opp under behandlingen.
På den annen side, er bare fem av 12 aktiverende mutasjoner observert i flere sekvenssammenstillingen (MSA ) av EGFR og homologe proteiner. Dette funn kan forklares ved å betrakte at den aktiverende mutasjoner kan beskrives som «vinning av funksjons «mutasjoner. Disse mutasjonene gjør kinase konstitutivt aktiv, noe som ikke er ønskelig ut fra rammen av tumoren. Derfor er mange av dem ikke kan observeres som variasjoner i beslektede sekvenser.
Alle de studerte missense mutasjoner er på grunn av enkelt-nukleotid varians (SNV), og det er mulig at en viss SNV er observert i MSA fordi alle av de mulige SNVs er dekket. I dette tilfellet, til sannsynligheten identifisere denne mutasjonen i MSA er 1. Ja, alle de ikke-synonyme SNVs av Ser768 har blitt observert i MSA. Motsatt av de seks mulige amino-syre erstatninger på grunn av ikke-synonyme SNVs i posisjon 790, bare to er observert i MSA: T790A, som er observert bare i en enkelt sekvens; og T790M, som er observert i 87-sekvenser (31%). T790M er den mest utbredte EGFR motstand mutasjon [18]. Thr790 kalles gatekeeper resten av EGFR, fordi det ligger ved inngangen til en hydrofob lomme der KI bind, noe som gjør det viktig for KI selektivitet. Den KI motstand på grunn av den T790M mutasjonen hadde derfor vært foreslått å skyldes steriske sammenstøt med den bundne Kis. Det ble imidlertid senere oppdaget at de T790M mutantene er i stand til å binde KIS, men forblir aktiv på grunn av økt affinitet til ATP [27]. Forekomsten av Met i samme posisjon som rest 790 i MSA av EGFR homologer er i tråd med dette funnet. Som Thr790, kan rester Thr854 bli mutert til seks andre rester gjennom SNVs, men bare tre slike endringer er observert: T854A (146 sekvenser, 52%), T854I (en sekvens) og T854S (51 sekvenser, 18%). I dette tilfelle kan det mutasjon faktisk hindre binding av medikamentet [28]. I motsetning til den radikale mutasjon T854A, er T854S en konservativ mutasjon, og vil trolig ikke føre til resistens. T854I er bare til stede i en sekvens. De andre mulige mutasjoner T854K, T854P, og T854R kan føre til resistens, men er ikke funnet på MSA i det hele tatt, noe som tyder på at de er valgt for, selv om de dukker opp.
Videre analyser av sannsynligheten for å observere en gitt rest i kinasedomenet kan fås fra den konserverte domene Database (CDD) [29], ncbi.nlm.nih.gov/cdd. Den konserverte Domain Database er en ressurs for annotering av funksjonelle enheter i proteiner. Blant andre data, fremstiller det sannsynligheten for å finne hver av de 20 vanlige nukleotid-kodede aminosyrer ved hvilken som helst posisjon av justeringen som en log2 basert stilling spesifikk scoringsmatrise (PSSM) score. Jo større PSSM score, jo mer bevart er resten på anvist plass. Når undersøke posisjonene til motstands mutanter i EGFR er det funnet at Leu747, Asp761 og Ser768 er mutert til rester som er mindre sannsynlig i henhold til den konserverte domene. På den annen side, Val769, Thr790 og Thr854 mutert til rester som er mer vanlig i CDD. De mest vanlige aktive (driver) missense mutasjoner, G719A /C /S og L858R, ikke er til stede i den MSA, og den resulterende variant er anslått til å være mye mindre vanlig enn wt i den konserverte TK domene (tabell S1). Faktisk, i bare to aktiverende mutasjoner mutanten er mer vanlig i den konserverte domene enn wt, og i begge tilfeller (L861Q og G863D) med posisjons-spesifikk stillingen er 0, noe som indikerer at vekt- rest ikke er konservert. Dette er i samsvar med det synspunkt at disse mutasjonene fører til få-av-funksjon.
Anaplastisk lymfom kinase
Ifølge vår analyse, fem av de seks crizotinib resistente mutanter og alle 11 neuroblastom-assosierte ALK missense mutasjoner som fører til en rest som kan observeres i relaterte proteiner ved den samme posisjon (i markert forskjell driver mutasjoner i EGFR). Alle de neuroblastom-assosierte mutasjoner medfører en endring fra en rest som er sterkt konservert i CDD til en som er uvanlig (tabell S2), som også er tilfelle for tre av de seks resistensmutasjonene. Angivelig, både motstand og aktiverende mutasjoner i ALK er gjenstand for evolusjonære begrensninger som reduserer mutasjons landskapet.
Bcr-Abl
Enkelt mutasjoner.
Jeg har analysert 43 Abl1 mutasjoner båret av KML-pasienter der resistens var tydelig
in vitro
. Bemerkelsesverdig, ingen av de 43 SNVs er romanen, dvs. varianter av samme type er tydelig i beslektede proteiner (Tabell 1 og Tabell S3), og i det hele tatt, men to tilfeller endringen innebærer en rest som er mindre konservert i CDD ( i L387F og L387M mutant har en lignende bevaring score), noe som kan tyde på seleksjonspress.
Sammensatte mutasjoner.
Nylig Khorashad og medarbeidere identifisert et sett med doble mutasjoner i KML-pasienter behandlet med TKI [30]. Omtrent 70% av disse mutasjonene var sammensatt mutasjoner, hvor de to mutanter oppstår i den samme klon av kreftceller. Noen av disse sammensatte mutasjoner antas å bidra til økt resistens. Det er interessant å undersøke sammensatte mutasjoner fra et evolusjonært synspunkt. Undersøkelse av de 21 rapporterte sammensatte mutasjoner [30], viser at fem er fullstendig ny, dvs. en lignende (dobbel) variasjoner er ikke observert i noen av de 1282 sekvenser som er homologe til Abl1 (figur 1 og tabell S4). Noen av de andre 16 variasjoner er ganske vanlig. For eksempel ble flere narkotika motstand mutant T315I observert i samme klon med M244V, G250E, E255K, F311L, F359V, F359C, L387M eller H396R. 56% av sekvensene som, i henhold til den MSA, har isoleucin i den stilling som svarer til rest 315 av Abl1, også har lysin i den stilling som svarer til rest 255 – dvs. at de på linje med den T315I /E255K forbindelse mutasjon (figur 1, bunn). Legg merke til at rekkefølgen av forekomst av mutasjonene kan være viktig, da bare 8% av sekvensene som tilsvarer den E255K bære isoleucin i den stilling som tilsvarer T315 i Abl1 (sammenlignet med 56% hvis T315I regnes først). Interessant, da undersøke alle mulige kombinasjoner av de 43 resistente mutanter (se datablad S8) vi observere syv varianter som alltid er observert sammen i naturlige sekvenser: (K247N /F317L, E292V /F311I, E292V /F359I, Y253F /T315A, Y253F /F317I, T351A /V379I og Y253F /H375P). Disse mutasjoner ble ikke rapportert hittil, men det kan være på grunn av mangel på sensitivitet i sekvensering, og det lille antall pasienter som ble undersøkt. Bedre sekvenseringsmetoder [31] er sannsynlig å avsløre flere sammensatte mutasjoner i Abl1 og andre kreft narkotika mål.
(øverst) Sammensatte mutasjoner er doble mutanter som oppstår i samme klon og er påvist i behandlede pasienter. Ved hjelp av MSA av Abl1 proteiner, beslektede sekvenser hvor en av de identifiserte mutasjoner er observert som en variant ble identifisert. Hver sekvens ble deretter analysert for å undersøke hvorvidt en hvilken som helst av de andre variasjonene er observert sammen med den første varianten. Resultatene av denne analysen er angitt her som prosent. For eksempel, 50% av sekvensene, hvor en rest His ligger ved en posisjon som er det samme som Tyr253 av Abl1 (svarende til Y253H mutasjon) den rest som svarer til posisjon 250 er Glu (lik den G250E mutant). Legg merke til at matriksen er ikke symmetrisk. Tar samme eksempel bare 0,8% av sekvensene hvor Glu ligger i stilling som tilsvarer Gly250 i Abl1 (G250E) også besitter hans i stilling som svarer til Tyr253. Denne forskjellen oppstår fra den relative sjeldenhet av Y250H mutasjon (0,3%, Tabell S3) og den relative overflod av G250E mutasjon (21%). Sammensatte mutasjoner identifisert av Khorashad og medarbeidere [30] vises innenfor en fet ramme. Bare doble mutanter der både enkelt mutasjoner er kjent for å gi resistens er analysert, og bare rester som er involvert i sammensatte mutasjoner rapportert av Khorashad
et al
vises her.; for en fullstendig liste, se datablad S8. 102 av 240 mulige mutasjoner er ikke observert i MSA. Matrisen cellene er farget i henhold til overflod av den betingede variasjoner: mindre enn 10%, hvitt; 10-19%, gul; 19-50%, oransje; mer enn 50%, red. (Bottom) Sekvens justering mellom menneske Abl1 og menneskelig STK10. En del av den parvise justering mellom menneske Abl1 og menneskelig STK10 med plasseringen av Abl1 rester Glu255 og Thr315 indikert (røde rektangler). Justeringen til menneskelig STK10 er gitt som et eksempel, for å avklare de funnene som vises ovenfor. De to residuer på linje med lysin og isoleucin, henholdsvis svarende til E255K /T315I forbindelse mutasjon. 56% av sekvensene som, i henhold til den MSA, har isoleucin i den stilling som svarer til rest 315 av Abl1, også har lysin i den stilling som svarer til rest 255.
diskusjon
de fleste motstands mutasjoner er ikke ny
Analyse av SNVs som fører til legemiddelresistens i EGFR, ALK og Abl1 viser at i de aller fleste av disse ikke-synonyme SNVs (52 av 55, tabell 1), en viss rest er modifisert til en som kan observeres i homologe sekvenser. Dette kan tyde på at resistensmutasjoner er gjenstand for rensing av utvalget til en viss grad. Ellers ville man forvente at nye mutasjoner vil bli mer utbredt.
aktiverende mutasjoner tendens til å favorisere en endring i en mindre bevart rester
Når det gjelder aktive mutasjoner, det er en markant forskjell mellom proteiner. I EGFR, de fleste av mutasjonene er nye, som er på linje med dem som gain-of-funksjon mutasjoner. I ALK, mutasjonene er ikke romanen. I begge tilfeller, men analyse av de konserverte domenene viser at den nye varianten er nesten alltid mindre konservert innenfor domenet (Tabeller S1 og S2). Dette er i tråd med hypotesen om at slike mutasjoner medfører gevinst-of-funksjon.
Variasjon av de muterte rester
I de tre proteinene i undersøkelsen her, enkelte stillinger har ingen evolusjonære begrensninger for SNVs, mens andre posisjoner er begrenset. For eksempel seks ikke-synonyme SNVs er mulig på proteinnivået til Ser768 av EGFR. Alle disse er observert i sekvenser homologe til EGFR ved posisjon 768 (hvor mutasjon fra Ser Ile overfører resistens). På den annen side kan treonin i posisjon 790 av den samme sekvens kun bli mutert til metionin eller alanin, og den sistnevnte er bare observert i en sekvens. Det kan konkluderes med at det i det første tilfellet, det funn at motstanden mutasjonen er allerede observert i evolusjonen er bare tilfeldig: tross alt, alle SNVs er mulig; mens i det andre tilfellet er det meningsfylt fra et evolusjonært synspunkt. En alternativ forklaring er at alle variasjoner i posisjon 768 er mulig fordi de ikke fører til en betydelig reduksjon i den biologiske aktiviteten til proteinet. Dette resonnementet er sannsynlig basert på evolusjonære teorier [32], [33]. For dette formål, er andelen
alle
ikke-synonyme SNVs som forekommer i de tre sekvenser bør vurderes, og kan bli sammenlignet med andelen av resistens-mutasjoner i hvilken ikke-synonyme SNVs er observert i MSA. Hvis ikke synonymt SNVs som fører til resistente mutasjoner er bare underlagt begrensningen at de fører til resistens og er ellers evolusjonære nøytral, skulle man forvente at de tilsvarende SNVs faller utenfor MSA som beskriver evolusjonære relaterte proteiner. Dersom, på den annen side er disse SNVs er gjenstand for evolusjonære begrensninger, bør de aller fleste av slike SNVs tilsvarer rester som også kan identifiseres i andre proteiner. Som vist i tabell 2, i fravær av eventuelle evolusjonære begrensninger, 1508 non-synonyme SNVs
kunne
observert for kinase domene av EGFR. De 1038 SNVs som
er
observert er 31% mindre enn de som mulig. Kun 5% av resistensmutasjoner involvere SNVs som ikke er observert i kinase domene – mye mindre enn 31% som forventes for tilfeldige SNVs. Dette er en sterk indikasjon på at resistensmutasjoner er gjenstand for evolusjonære begrensninger. Forventningsverdien for å få det samme antall observerte mutasjoner tilfeldig (dvs. at 52 av de 55 resistensmutasjonene er observert i MSA skyldes tilfeldigheter alene, forutsatt at alle ikke-synonyme SNVs er like sannsynlige) er 5.6E-05 .
bevaring av de muterte rester på proteinnivå
Gitt at resistensmutasjoner, i motsetning driver mutasjoner, bør ikke forstyrre den biologiske aktiviteten til proteinet, kan man anta at evolusjons konserverte rester vil ha en mindre tendens til å bli påvirket (merk at rest bevaring på proteinnivået er annerledes enn dens sannsynlighet for å bli observert i CDD, og er ikke bare en funksjon av antall mulige vekslinger [32]). Imidlertid analyse av evolusjonær konservering på proteinet residuet nivå [34] – [36] viser at de muterte rester er relativt konservert (figur 2, Bord S5, S6, S7). Dette kan forklares ved resonnement at disse rester er enten plassert på substratet bindingssete, påvirke struktur eller modifisere proteinets konformasjonelle dynamikk; ellers mutasjoner ikke kan føre til resistens. Store forskjeller mellom de enkelte rester imidlertid observert. Noen rester er høyt konservert (f.eks gatekeeper rester Thr854 i EGFR, Leu1196 i ALK og Thr315 i Abl1), mens andre er noe variabel. Interessant, er median variasjon poengsum høyere for de aktiverende mutasjoner i EGFR og ALK enn for resistensmutasjoner, noe som indikerer at en mutasjon av en konservert rest er mer sannsynlig å gi en resistens mutant. Dette funnet er litt bakvendt fordi driver mutasjoner er forventet å gi funksjoner som er viktige for tumorvekst eller spredning [37], og det er derfor rimelig å forvente at de ville tendens til å oppstå på fredet områder og vil ikke være så følsom for evolusjonære begrensninger.
de strukturer av EGFR [68] ALK [69], og Abl1 [70] vises i et bånd representasjon, farget i henhold til den evolusjonære bevaring på restnivå. Farging er på BWR skala, dvs. er sterkt konserverte rester vist i mørkeblå, moderat konservert i lys blå, mildt konservert eller svakt variabel i hvitt, moderat variabel i rosa og svært variabel i rødt. Rester hvor mutasjoner fører til resistens er representert ved kuler og indikerte (kun for EGFR og ALK, merk at EGFR rest Leu747 ikke ble løst i X-ray struktur og vises ikke).
Gitt at det store og resistente mutasjoner oppstår på fredet områder, hvor er proteinet i stand til å opprettholde sin funksjon? En mulig forklaring er at resistensmutasjoner er konservative, dvs. de omfatter modifikasjoner av aminosyre-rester som ikke endrer deres biokjemiske egenskaper. Empirisk kvantifisering av biokjemiske avstanden mellom restene ble foreslått av Grantham [38], som er utformet for beregninger som er kjent som «Grantham avstand «. Jo mer radikal substitusjon, jo høyere er Grantham avstand. Dermed blir Grantham avstanden mellom isoleucin og leucin er 5, mens cystein og fenylalanin er 205 Grantham heter vekk fra hverandre. Den midlere Grantham avstand er 100, svarende til den biokjemiske forskjellen mellom fenylalanin og histidin, noe som indikerer at de fleste av de mulige vekslingene er radikal i stedet for konservative. Undersøkelse av Grantham avstander (tabell S5, Table S6 og Tabell S7) avslører at både radikale og konservative mutasjoner er observert. Median Grantham avstand, er imidlertid høyere for resistensmutasjonene enn for aktivering av mutasjoner i EGFR og ALK. Interessant, er median Grantham avstand for resistensmutasjoner i Abl1 ganske liten (51). Dette indikerer at relativt små endringer på bindingssetet allerede føre til resistens, og forklarer hvorfor narkotika motstand skyldes punktmutasjoner er så vanlig i CML.
Resistance mutasjoner er underlagt evolusjonære begrensninger
bioinformatiske analyse av resistens mutasjoner i EGFR, ALK og Abl1 avslører at selv om mange ikke-synonyme SNVs er mulig, noen av narkotika resistensmutasjonene er romanen i den forstand at lignende varianter som ikke ble observert i utviklingen. Dette begrenser antallet mulige SNVs med 19-35%, avhengig av proteinet (tabell 2). Ytterligere begrensning kommer fra det faktum at resistensmutasjonene er mer sannsynlig å forekomme på konserverte residuer, selv om de kan også innebære mildt konserverte-rester. Sammenligning mellom resistente og aktiverende mutasjoner i EGFR og ALK indikerer at de resistente mutasjoner er mer sannsynlig å være radikal fra et biokjemisk synspunkt. Dette kan ha implikasjoner for eksempel når hele genomer fra behandlede kreftpasienter blir analysert for ukjente mutasjoner, og det er et behov for å skille mellom driver mutasjoner, passasjer mutasjoner og resistensmutasjoner.
Sammensatte mutasjoner
Compound mutasjoner som fører til resistens vanligvis innebære en kombinasjon av to enkle resistensmutasjonene som til sammen fører til økt resistens og kan føre til tilbakefall i løpet av behandlingen. Analysen av sammensatte mutasjoner fører til to konklusjoner. Først blir 24% av den kjente forbindelse mutasjonene ikke observert
sammen
i en hvilken som helst Abl1 homolog, mens alle enkeltmutasjoner ble observert. Dette kan tyde på at multiple mutasjoner som ikke i vesentlig grad forringer funksjonen til enzymet er ikke gjenstand for ytterligere evolusjonære trykket som ville hindre deres akkumulering. Alternativt kan akkumulering av multiple mutasjoner bli noe skadelig som ikke hindrer dem fra å bli fast [39]. For det andre, flere alter synes å forekomme sammen i homologe sekvenser, men har hittil ikke blitt identifisert hos pasienter, enten på grunn av eksperimentelle begrensninger, små prøvestørrelser, eller fordi de er mindre fordelaktig for motstand. Begge funn tyder på at ytterligere sammensatte resistensmutasjonene vil bli rapportert i fremtiden, i Abl1 og andre gener, og vil være vanskelig å målrette. Dessuten har sammensatte mutasjoner nylig blitt observert også i sammenheng med EGFR aktiverende mutasjoner [40], [41], noe som ytterligere indikerer at slike mutasjoner bør forventes i andre gener.
Vårt forståelse av kreft evolusjon blir bedre på grunn av bedre sekvenseringsmetoder [42], nye analyseverktøy for kreft genet nettverk [43] og utvikling av evolusjonære modeller [44] – [47].
