Abstract
Bakgrunn og formål
For å forstå mekanismene som er involvert i den sterke drapet effekten av karbon-ion bestråling på kreftceller med
TP53
tumorsuppressorgenet mangler .
Materialer og metoder
DNA skade respons etter karbon-ion stråle eller røntgenbestråling i isogene HCT116 tykktarmskreft cellelinjer med og uten
TP53 plakater (p53
+ /+ og p53
– /-, henholdsvis) ble analysert som følger: celle overlevelse ved klonogene analysen, celledød moduser av morfologiske observasjon av DAPI-farget kjerner, DNA dobbel-tråd pauser (DSB sin) ved farging av fosforylert H2AX (γH2AX), og cellesyklus ved flowcytometri og farging av Ser10-fosforylert histon H3
Resultater
p53
-. /- cellene mer motstandsdyktig enn p53
+ /+ celler til røntgenbestråling, mens følsomheten til p53
+ /+ og p53
– /- celler til karbon-ionestrålen bestråling var sammenlignbare. Røntgen og karbon-ionestråle bestrålinger overveiende indusert apoptose av p53
+ /+ celler, men ikke p53
– /- celler. I p53
– /-. Celler, karbon-ion bestråling, men ikke røntgenbestråling, markert indusert mitotisk katastrofe som ble assosiert med for tidlig mitotisk oppføring med husing lang beholdt DSB sin på 24 timer etter bestråling
Konklusjoner
effektiv indusering av mitotisk katastrofe i apoptose-resistente p53-manglende celler innebærer en sterk kreftcelle-drepende virkning av karbon-ion strålebestråling som er uavhengig av p53-status, hvilket antyder dets biologiske fordel i løpet av X-ray behandling
Citation. Amornwichet N, Oike T, Shibata A, Ogiwara H, Tsuchiya N, Yamauchi M, et al. (2014) Carbon-Ion Beam Bestråling dreper X-Ray-Resistant p53-Null kreftceller ved å fremkalle Mitotisk katastrofe. PLoS ONE 9 (12): e115121. doi: 10,1371 /journal.pone.0115121
Redaktør: Peiwen Fei, University of Hawaii Cancer Center, USA
mottatt: 17 juli 2014; Godkjent: 18 november 2014; Publisert: 22.12.2014
Copyright: © 2014 Amornwichet et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Grants-in-Aid fra departementet for utdanning, kultur, sport, vitenskap og teknologi i Japan for programmer for ledende Graduate Schools, Dyrker Global Leaders i Heavy Ion Therapeutics og Engineering, og for Strategic Young Forsker Seas Besøk Program for Akselerer Brain sirkulasjon, og forskning på innovative områder (22131006). Dette arbeidet ble også støttet av Grants-in-Aid fra Japan Society for Promotion of Science for Unge Forskere (B) KAKENHI [10643471]. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Carbon-ion strålebehandling har vært vekk interesse innen kreftbehandling. Carbon-ion bjelker har fordelaktige egenskaper over X-ray; en overlegen dosefordeling i forbindelse med den skarpe penumbra og Bragg-topp, og sterk celle-drepende virkning [1], [2]. Den store lovende kliniske resultatet av karbon-ion strålebehandling er å overvinne den terapeutiske motstanden av kreftceller til røntgen strålebehandling. For eksempel, en fersk studie der karbon-ion strålebehandling ble brukt til å behandle pasienter med endetarmskreft rapportert en 5-års lokal kontroll og total overlevelse priser på 97% og 51% for postoperative gjentatte tilfeller [3]. Denne prisen er overlegne i forhold til 5-års overlevelse priser (0-40%) som vanligvis oppnås ved konvensjonell røntgen strålebehandling eller kirurgisk fjerning [3], [4]. Imidlertid har den biologiske grunnlaget for den sterke celle-drepende virkning av karbon-ionestrålen bestråling med røntgen-resistente tumorer ikke fullt ut klarlagt.
genetiske avvik bidra til røntgen motstand av kreftceller [ ,,,0],5], [6]. Inaktivere mutasjoner i tumor suppressor genet
TP53
er representative for svulst motstand, og disse avvikene er assosiert med dårlig prognose etter X-ray strålebehandling [7], [8]. P53-proteinet spiller flere roller i den DNA-skade respons (DDR) for røntgenbestråling, inkludert regulering av celledødsveier og cellesykluskontrollposter [9]. Induksjon av apoptose av p53 er en viktig faktor som påvirker følsomheten av kreftceller til røntgenstråling. Flere prekliniske og kliniske studier har vist at
TP53
mutasjoner er forbundet med resistens av kreftceller til røntgenstrålingsterapi [7], [10], [11].
tidligere studier viste at karbon-ion bestråling effektivt dreper røntgen-resistent mutant p53-cancerceller [12–15]. Selv om det er involvert i denne prosessen mekanismer ble undersøkt i disse studiene, var resultatene inkonsekvent. Uoverensstemmelser er sannsynligvis tilskrives det faktum at hver studie fokuserte på bare noen aspekter av DDR (for eksempel apoptose eller cellesyklusen respons) [12] – [15], og hver av dem brukes cancercellelinjer med ulike genetiske bakgrunn; dermed effekten av avvik i andre enn
TP53 gener
kan ha maskert resultatene [12], [13]. Her, for å avklare mekanismene bak den sterke drapet effekten av karbon-ion bestråling på røntgenbestråling resistente kreftceller med
TP53
avvik, utførte vi en omfattende studie av flere aspekter av DDR hjelp av et sett av isogene menneskelige kreftceller som avvek bare i sin p53 status.
Materialer og metoder
Cellelinjer linjer~~POS=HEADCOMP
menneske~~POS=TRUNC kolorektal kreft HCT116 celler som villtype p53 (p53
+ /+) og dens isogen p53-null derivat (p53
– /-) ble gitt av Dr. B. Vogel av Johns Hopkins University. HCT116 p53
+ /+ celler har intakte DNA skade sjekkpunkter [16]. p53-ekspresjon, og effekten av røntgen og karbon-ion bestråling på p53-ekspresjon i p53
+ /+ og p53
– /- celler, ble undersøkt ved immunblotting med antistoffer mot p53 (Santa Cruz) og β-aktin (lasting kontroll, Cell Signaling Technology) (S1 A fig.). Det var ingen signifikant forskjell i populasjonen doblingstid mellom de to cellelinjer (S1b fig.).
human koloncancer (RKO, LS123 og WiDr) celler, human lungekreft (H1299) celler, og humane osteosarkomceller (Saos-2-celler) ble anskaffet fra ATCC. RKO celler havn villtype p53. LS123 og WiDr celler havn en missense mutasjon i p53 på R175H og R273H, henholdsvis. H1299 og Saos-2-celler er p53-null. H1299-celler som stabilt uttrykker et p53 missense mutasjon (R175H, R273H, R249S eller R280K) ble etablert som beskrevet tidligere [17]. Alle celler ble dyrket i RPMI-1640 medium supplert med 10% føtalt bovint serum.
hTERT-udødelig normale humane diploide forhudsfibroblaster (BJ-hTERT) som bærer vill-type p53 ble innkjøpt fra Clontech. BJ-hTERT celler som uttrykker shRNA mot EGFP (BJ-hTERT-WT, kontroll). Eller p53 (BJ-hTERT-shp53) ble etablert som tidligere beskrevet [18], og dyrket i Minimum Essential Eagle Medium
Bestråling
røntgenbestråling ble utført ved anvendelse av en Faxitron RX-650 strålingskilde (100 kVp, 1,14 Gy /min; Faxitron Bioptics). Carbon-ion bestråling ble utført ved Gunma Universitetet Heavy Ion Medical Center bruker de samme stråle spesifikasjoner som er brukt i kliniske settinger (290 MeV /nukleon og en gjennomsnittlig lineær energioverføring (LET) i sentrum for en 6 cm spredt ut Bragg topp på tilnærmet 50 keV /um). Karbon-ionestråler ble levert i en vertikal retning, slik at celler på kulturskåler kan motta dosen jevnt.
klonogene overlevelsesanalyse
Celler ble sådd ut i 6-brønns plater og eksponert (eller ikke ) til røntgen eller karbon-ion bestråling. Etter inkubering i ytterligere 10 dager ble cellene fiksert med metanol og farget med krystallfiolett. Kolonier av minst 50 celler ble talt opp. Den overlevende fraksjon ble normalisert til de tilsvarende kontroller. Dosen som resulterte i en overlevende brøkdel av 10% (D
10) ble beregnet ved bruk av lineær-kvadratiske modellen, som beskrevet tidligere [19].
celledød evalueringer
Celler ble dyrket på dekkglass, eksponert (eller ikke) til røntgen eller karbon-ion strålebestråling, og deretter farget med 4 «, 6-diamidino-2-fenylindol-dihydroklorid (DAPI), som beskrevet tidligere [20]. Confocal bilder ble samlet ved hjelp av en BX51 mikroskop (Olympus) er utstyrt med en CCD-kamera (VB-7000, Keyence). Apoptose ble fastsatt basert på morfologi av kjerner, inkludert tilstedeværelse av apoptotiske legemer, kjernekondensering og fragmentering [21]. Celler som inneholder kjerner med to eller flere forskjellige lapper ble scoret som positive for mitotisk katastrofe [20], [22]. Celler som inneholder kjerner viser senescence-forbundet heterochromatic foci ble scoret som positive for alderdom [23]. Prosentandelene av celler som gjennomgår apoptose, mitotisk katastrofe eller begynnende alderdom ble kvantifisert ved å telle minst 300 celler for hver eksperimentell tilstand.
cellesyklusanalyse
Celler eksponert (eller ikke) til røntgen eller karbon-ion strålebestråling ble høstet ved de angitte tidspunkter, fiksert med etanol, farget med propidiumjodid i nærvær av RNase, og deretter analysert ved hjelp av strømningscytometri, som beskrevet tidligere [19].
Immunfarging
Celler utsatt (eller ikke) til X-ray eller karbon-ion bestråling ble farget med antistoffer mot Ser139-fosforylert histon H2AX (γH2AX Millipore) eller Ser10-fosforylert histon H3 (pH 3, Millipore), som beskrevet tidligere [24]. γH2AX foci per kjerne ble scoret i sekvensielle 2D-bilder som er tatt fra flere fokusplan. Minst 500 celler ble evaluert for hver eksperimentell tilstand.
Statistisk analyse
Eksperimenter ble utført in triplo i minst mindre annet er angitt. Statistisk signifikante forskjeller ble bestemt av uparede Student
t
-UNDERSØKELSER hjelp StatMateIII ver. 3,17 programvare (minibanker).
P
. 0,05 ble betraktet som signifikant
Resultater
Carbon-ion bjelker har mer potente kreft celle-drapet aktivitet enn røntgen uavhengig av p53 status
De sensitiviteter av p53
+ /+ og p53
– /- HCT116 cellene til X-ray og karbon-ion bestråling ble vurdert av klonogene overlevelsesanalyser (fig. 1). Som forventet basert på resultatene fra tidligere undersøkelser [14], [15], p53
– /- celler som var mer resistente overfor røntgenbestråling enn p53
+ /+ celler; D
10 Verdiene for disse to cellelinjene var 6,8 Gy og 3,8 Gy, respektivt. I motsetning til følsomheten p53
+ /+ og p53
– /- celler til karbon-ion bestråling var sammenlignbare; D
10 Verdiene for disse cellelinjene var 1,7 Gy og 1,9 Gy, respektivt. Derfor er den relative biologiske effektiviteten av karbon-ion strålebestråling for røntgenbestråling ved D
10 var 2,2 i p53
+ /+ celler og 3,6 i p53
– /- celler. Disse data indikerer at karbon-ion bestråling effektivt dreper røntgen-resistente
p53
-null kreftceller.
Cellene ble utsådd i 6-brønners plater, inkubert over natten, og deretter eksponert for røntgen eller karbon-ion bestråling. Etter inkubering i ytterligere 10 dager ble cellene fiksert, farget og tellet. Den overlevende fraksjon ble normalisert til verdien av de tilsvarende kontroller. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SD. C-ion, karbon-ion.
Avvik i p53 bytte modus for bestråling-indusert kreft celledød fra apoptose til mitotiske katastrofe
For å utforske mekanismene bak p53 status- uavhengig celle-drepende aktivitet av karbon-ion strålebestråling, ble moduser av celledød indusert ved røntgen eller karbon-ion bestråling undersøkt (fig. 2, 3). p53
+ /+ og p53
– /- cellene ble bestrålt med doser av røntgen eller karbon-ion bjelker som var lik D
10 for p53
+ /+ celler (X -ray, 4 Gy, karbon-ion bjelker, 1,5 Gy). Apoptose ble mitotisk katastrofe og begynnende alderdom bestemmes ved å undersøke de karakteristiske morfologi av kjerner farget med DAPI (fig 2a-c.) [20] – [23]. I p53
+ /+ celler, apoptose var den dominerende modusen for celledød indusert av røntgen og karbon-ion strålebestråling (fig. 2d, f, 3a). I motsetning til dette, p53
– /- celler som var mindre utsatt for apoptose forårsaket av begge typer av bestråling (figur 2e, g, 3b.). Interessant, i p53
– /- (Fig. 2g, 3b) celler, karbon-ion bestråling indusert mitotisk katastrofe mer tydeligvis enn røntgenbestråling. En høyere dose av røntgenbestråling ekvivalent til D
10 (6,8 Gy) for p53
– /- celler indusert et tilsvarende nivå av mitotisk katastrofe til det som blir indusert ved karbon-ionestrålen bestråling ved 1,5 Gy (S2 fig.). Induksjonen av senescens var ikke tydelig i alle eksperimentelle betingelser (Fig. 2). Dette resultatet ble bekreftet ved senescence-assosiert β-galaktosidase fargingsanalyser, hvori fraksjonen av farge-positive celler var mindre enn 2% for begge cellelinjer som er utsatt for røntgen eller karbon-ion strålebestråling (data ikke vist). Disse data indikerte at apoptose og mitotisk katastrofe er den viktigste måten å celledød i p53
+ /+ celler og p53
– /- celler, respektivt, både etter eksponering for røntgen og karbon-ion strålebestråling, og at karbon-ion bestråling induserer mitotisk katastrofe mer effektivt enn røntgenbestråling i apoptose-resistente p53
– /- celler
celler utsådd på dekkglass ble inkubert over natten, eksponert (eller ikke.; 0 h) til X-ray (4 Gy) eller karbon-ionestråle (1,5 Gy) bestråling, og deretter farvet med DAPI. Apoptose, mitotisk katastrofe, og begynnende alderdom ble bestemt i henhold til de karakteristiske atom morfologi (se «Materialer og metoder» for definisjoner). (A-c) Representative bilder som viser atom morfologien av celler som gjennomgår apoptose (a), mitotisk katastrofe (b), eller begynnende alderdom (c). Bildene av p53
– /- celler ble tatt 72 timer etter at karbon-ion bestråling. (D, e) Mode av celledød i p53
+ /+ (d) og p53
– /- (e) celler ved 0, 12, 24, 48, 72, 96 og 120 timer etter X- ray bestråling. (F, g) Mode av celledød i p53
+ /+ (f) og p53
– /- (g) celler ved 0, 12, 24, 48, 72, 96 og 120 timer etter karbon- ion bestråling. IR, bestråling; C-ion, karbon-ion.
Celler ble sådd på dekkglass, ruges over natten, utsatt for karbon-ion bjelker (1,5 Gy), og deretter farget med DAPI 72 timer senere. Apoptose, mitotisk katastrofe, og begynnende alderdom ble bestemt i henhold til de karakteristiske atom morfologi (se «Materialer og metoder» for definisjoner). (A) p53
+ /+ celler: 12,5%, 0% og 0% av cellene viste apoptose, mitotisk katastrofe, og begynnende alderdom, henholdsvis. (B) p53
– /- celler: 0%, 12,8% og 0% av celler viste apoptose, mitotisk katastrofe, og senescence, henholdsvis. Pilene i (a) og (b) angir celler som gjennomgår apoptose og mitotisk katastrofe, respektivt. Skala barer, 10 mikrometer.
For å undersøke dette videre, vi undersøkte måte celledød i flere humane cellelinjer med ulik p53 status etter X-ray eller karbon-ion bestråling (Fig. 4 ). RKO celler som vill-type p53 viste en apoptose-dominant fenotype etter enten røntgen eller karbon-ion strålebestråling, mens p53-null H1299 og Saos-2-celler viste en mitotisk katastrofe-dominant fenotype. Følgelig undertrykkelse av p53-ekspresjon i BJ-hTERT fibroblaster fremmet induksjon mitotisk katastrofe ved røntgen eller karbon-ion strålebestråling (S3 fig.). Interessant, LS123 og WiDr celler (som uttrykker p53 huse en missense på R175H og R273H, henholdsvis), viste også en mitotisk katastrofe-dominant fenotype (Fig. 4). Disse mutasjon er lokalisert i DNA-bindende domene av p53 protein, som spiller en nøkkelrolle i transcriptional aktivering av flere mål gener, inkludert de som er involvert i apoptose induksjon [25]. Derfor vi neste undersøkte modus av bestrålings-indusert celledød ved hjelp av en serie av isogene H1299-celler som stabilt uttrykker p53-proteiner som bærer missense mutasjoner i DNA-bindende domene som ofte er observert i humane kreftformer (dvs. R175H, R273H, R249S og R280K ) [25]. Alle disse cellelinjene viste en mitotisk katastrofe-dominant fenotype ved bestråling (fig. 5). Tatt sammen indikerer disse resultater at dysfunksjon av p53 DNA-bindende domene skiftes modus av bestrålings-indusert kreft celledød fra apoptose til mitotiske katastrofe. Disse resultatene bekreftet også at karbon-ion bestråling var bedre enn røntgenbestråling ved indusering av mitotisk katastrofe i kreft celler som avvikende p53.
Cellene ble sådd ut på dekkglass, inkubert over natten, bestrålt med røntgenstråler ( D
10 dose) eller karbon-ionestråler (D
10 dose), og deretter farvet med DAPI 72 timer senere. Apoptose, mitotisk katastrofe, og begynnende alderdom ble bestemt i henhold til de karakteristiske atom morfologi (se «Materialer og metoder» for definisjoner). Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SD. Ap, apoptose; MC, mitotisk katastrofe; SNS, senescence; IR, bestråling; C-ion, karbon-ion
Celler ble sådd på dekkglass, ruges over natten, bestrålt med røntgenstråler (10,9 Gy, D
10 for røntgen., Eller 3,8 Gy, D
10 for karbon-ion bjelker) eller karbon-ion bjelker (3,8 Gy, D
10 for karbon-ion bjelker), og deretter farget med DAPI 72 timer senere. Apoptose, mitotisk katastrofe, og begynnende alderdom ble bestemt i henhold til de karakteristiske atom morfologi (se «Materialer og metoder» for definisjoner). Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SD. MC, mitotisk katastrofe; C-ion, karbon-ion; IR, bestråling. Legg merke til at en del av p53-null H1299 panel er den samme som den som er vist i fig. 4 (men sammenhengen er nå annerledes).
Celler løslatt fra stråleindusert G2 /M arrest 24 timer etter X-ray eller karbon-ion bestråling
Mitotisk katastrofe er tenkt å skje når cellene gå gjennom avvik mitose med ureparert DNA-skade [26]. Derfor, for å undersøke mekanismen bak induksjon av mitotiske katastrofe i p53-null-celler ved karbon-ion strålebestråling, effekter av røntgen og karbon-ion bestråling på cellesyklus statusene til p53
+ /+ og p53
– /- HCT116-celler ble bestemt ved flow-cytometri (fig. 6a, b). I likhet med celledød analysene ble cellene bestrålt med doser av røntgen (4 Gy) eller karbon-ionestråler (1,5 Gy). Induksjonen av G2 /M rest som nådde en topp 12 timer etter bestråling ble observert i begge cellelinjer etter røntgen eller karbon-ion strålebestråling, blir mer tydelig i p53
– /- celler enn p53
+ /+ celler. Spesielt, i begge cellelinjer som er utsatt for røntgen eller karbon-ion strålebestråling, G2 /M rest ble fullstendig frigjort 48 timer etter bestråling.
Cellene ble sådd ut i 35 mm kulturplater (a, b) eller på dekkglass (c), inkubert over natten, og eksponert (eller ikke, 0 h) til X-ray (4 Gy) eller karbon-ionestråle (1,5 Gy) bestråling. (A, b) Celler bestrålt med røntgenstråler (A) eller karbon-ionestråler (b) ble inkubert i 0, 12, 24, 48, 72, 96 eller 120 timer, fiksert med etanol, farget med propidiumjodid, og cellesyklusstatus analysert ved flow-cytometri. (C) Cellene ble bestrålt med røntgenstråler eller karbon-ionestråler, inkubert i 1 time, og deretter underkastet farging for pH 3, en spesifikk markør for M-faseceller. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SD. *
P
0,05 og †
P
0,01 kontra tilsvarende kontroller. IR, bestråling; C-ion, karbon-ion
Deretter prosenter av p53
+ /+ og p53
-. /- Cellene i M fase før og etter X-ray (4 Gy) eller karbon-ion bjelker (1,5 Gy) bestråling ble vurdert ved farging hjelp av et antistoff mot pH 3 (fig. 6c) [24]. Ca 2% av ikke-bestrålt p53
+ /+ og p53
– /- celler som var i M-fasen. En time etter at karbon-ion strålebestråling, ble prosentandelen av disse cellene i M-fasen reduseres i betydelig grad, selv om p53
– /- celler som var mindre følsomme enn p53
+ /+ -celler til røntgenbestråling. Spesielt, 24 timer etter røntgen eller karbon-ion strålebestråling, prosentandelene av p53
+ /+ og p53
– /- celler i M-fasen gjenvinnes til grunnlinjen, noe som tyder på at begge cellelinjer startet på nytt mitose 24 timer etter behandlingen.
DNA dobbel tråd pauser generert av karbon-ion bestråling vise tregere reparasjon kinetikk enn de som genereres av X-ray bestråling
til slutt, reparasjonskinetikk DNA dobbel -Strand pauser (DSB sin), den mest dødelige typen DNA-skade som genereres av ioniserende stråling, ble undersøkt i p53
+ /+ og p53
– /- HCT116-celler [27]. Bestrålte celler ble underkastet farging ved hjelp av et antistoff mot γH2AX, og antallet γH2AX foki pr celle i 15 min og 24 timer etter bestråling ble talt (fig. 7, tabell S1) [24], [28]. Cellene ble bestrålt med en 2 Gy dose av røntgenstråle eller en 1 Gy dose av karbon-ionestråler; ved disse dosene, antall γH2AX foci per celle ved kontroll tidspunkt (15 minutter etter bestråling) var tilnærmet 20-30, som var egnet for vurdering [24], [28]. Tjuefire timer etter røntgenbestråling, av antall γH2AX foci i p53
+ /+ og p53
– /- celler som var 24 ± 4,3% og 23 ± 5,3% av de tilsvarende kontroller (i 15 min tidspunkt), henholdsvis (fig. 7a, b), noe som indikerer at det store antall av DSB sin generert av røntgenbestråling ble reparert innen 24 timer. I motsetning til 24 timer etter at karbon-ion strålebestråling, av antall γH2AX foci i p53
+ /+ og p53
– /- celler som var 93 ± 11% og 85 ± 7,3% av de tilsvarende kontroller henholdsvis (fig. 7a, c), noe som indikerer at DSB sin generert av karbon-ion bestråling ikke var reparert effektivt, sannsynligvis på grunn av den strukturelle kompleksitet DSB slutter [29]. Faktisk, p53
+ /+ og p53
– /- celler som farget dobbel-positive for γH2AX og pH 3 ble identifisert 24 timer etter karbon-ion bestråling, viser at celler som DSB sin hadde gått inn mitose (Fig. 7d). P53-status påvirket ikke kinetikken av tap av γH2AX foci etter X-ray eller karbon-ion bestråling. Samlet utgjør disse dataene tyder på at p53-null celler som ureparert DSB sin angi mitose 24 timer etter karbon-ion bestråling, som fører til mitotisk katastrofe.
Celler ble sådd på dekkglass, inkuberes over natten, utsatt for X- stråler (2 Gy) eller karbon-ionestråler (1 Gy), inkubert i ytterligere 15 minutter eller 24 timer, og deretter underkastet farging for γH2AX og pH 3. Cellene ble deretter farget med DAPI. (A) ANTALL γH2AX foci per celle ved 15 min eller 24 timer etter bestråling. Resultatene for hver cellelinje ble normalisert til antall γH2AX foci i 15 min tidspunkt. Minst 500 celler ble tellet pr eksperimentell tilstand. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SD. *
P
0,05 kontra tilsvarende prøver i 15 min. (B, c) Representative mikroskopiske bilder som viser cellekjerner eksponert for X-ray (b) eller karbon-ionestråle (c) bestråling, og immunofarget for γH2AX. I hvert panel, blir omrisset av kjernen detekteres av DAPI farging antydet med en stiplet linje. (D) Representative mikroskopiske bilder av kjerner som utsettes for karbon-ion bestråling og immunofarget for γH2AX og pH 3 ved 24 timer etter bestråling. Pilene angir dobbel-positive kjerner. C-ion, karbon-ion.
Diskusjoner
Her viser vi at karbon-ion bestråling induserer forskjellige moduser av celledød i henhold til mutasjonsstatus av
TP53
. Etter at både X-ray og karbon-ion strålebestråling, apoptose var den dominerende modusen for celledød av p53
+ /+ celler, men ikke p53
– /- celler. Spesielt, frekvensen av mitotiske oppføring og kinetikken DSB reparasjon etter bestråling, som kan være viktige faktorer som induserer mitotisk katastrofe, var lik i p53
+ /+ og p53
– /- cellene uavhengig av type bestråling brukt. Disse data indikerer at apoptose spiller en primær rolle i kreftcelledøden forårsaket av bestråling i nærvær av p53. I fravær av p53, kreftceller viste resistens mot apoptose-induksjon og mitotisk katastrofen ble observert etter både røntgen og karbon-ion bestråling. Dette funnet er trolig forklares med begrensning av G2 /M sjekkpunkt etter bestråling. Aktivering av dette sjekkpunkt tillater reparasjon av skadet DNA før den sendes videre til dattercellene og fungerer som en barriere for å hindre for tidlig inntreden i mitose [30]. Imidlertid har tidligere studier antydet begrensning av G2 /M sjekkpunkt etter IR; G2 /M sjekkpunkt frigjøres når antallet DSB blir lavere enn ~10-20, etterfulgt av mitotisk oppføring [24], [31]. Etter G2 /M sjekkpunkt release, celler som 10-20 DSB sin er i stand til å fullføre den mitotiske hendelsen og gå inn i G1 fasen [32], [33]. DSB reparasjon er nedregulert i M fase; Derfor kan denne skaden repareres i den neste cellesyklusen, selv om reparasjonsprosessen i datterceller gjenstår å bli belyst [34]. En annen mulig årsak til effektiv induksjon av mitotisk katastrofe i p53
– /- cellene er høyere tilbøyelighet av disse cellene til stall i G2 /M fase etter bestråling enn p53
+ /+ celler. Dette G2 /M fase akkumulering er et resultat av en feil i p53-p21 signalveien som demper G1 arrest etter bestråling [16]. Denne egenskapen av p53-mangelkreftceller kan øke sjansen for bestrålte celler som ureparert DSB sin taste mitose, som fører til forbedring av mitotisk katastrofe.
Resultatene fra denne studien tyder på at både mangel på p53 og missense mutasjoner i p53 bidra til overgangen fra apoptose til mitotisk katastrofe. Totalt 75% av p53 mutasjoner identifisert i humane kreftformer er enkeltmissense mutasjoner. De fleste missense mutasjoner, inkludert de undersøkt i denne studien, ligger innenfor p53 DNA-bindende domene, som spiller en nøkkelrolle i transcriptional aktivering av mange målgener, inkludert de som induserer apoptose [25]. De muterte p53-proteiner har en dominant-negativ effekt, som fører til dysfunksjon av de gjenværende normale p53-proteiner. Derfor, er det rimelig at, sammen med mangel på p53, missense mutasjoner i p53-DNA-bindende domene også bidra til den apoptose-resistente fenotype ved å forstyrre evnen av normale p53-proteiner for å aktivere transkripsjonelt apoptose-relaterte gener; Dette kan gjøre bestrålte celler som ureparert DSB sin mer mottakelige for mitotisk katastrofe. Likevel er det verdt å merke seg en studie begrensning på dette punktet: vi ikke var i stand til å etablere H1299 celler som uttrykker villtype p53 (enten forbigående eller stabilt); Derfor, en sammenligning mellom villtype p53 og mutert p53 var umulig. Fremtidige studier bør sammenligne modus for bestråling-indusert celledød i isogene cellelinjer som bærer villtype, mutant, og null-p53.
Av notatet, de resultatene som presenteres her demonstrerer effektiv induksjon av mitotisk katastrofe av karbon- ion bestråling i p53-null og p53-mutant celler. Faktisk, i alle p53-null og p53-mutant cellelinjer testet, den dosen som er nødvendig for å indusere visst nivå av mitotisk katastrofe var tydeligvis lavere i karbon-ion bjelker enn i X-stråler. Dette resultat kan forklares ved de vanskeligheter som er knyttet til reparasjon av DSB sin generert av karbon-ion strålebestråling, som beholder mer komplekse strukturer av skadet DNA-ender enn de som genereres ved røntgenbestråling [35]. Ineffektiv DNA skade reparasjon forårsaket av kompleksiteten av DSB ender kan ligge til grunn for den effektive celledrepende effekt av karbon-ion bestråling på kreftceller som bærer p53 avvik.
Resultatene som beskrives her er delvis motstridende til de av tidligere studier som undersøkte DDR etter karbon-ion stråle bestråling av p53-mutant kreftceller. Selv om noen få undersøkelser observert effektiv apoptose (S2 tabell) [12] – [15], det skal bemerkes at denne modusen for celledød ble bare indusert effektivt ved LET-verdier større enn 70 keV /um. I motsetning til dette var den gjennomsnittlige LET verdien ved midten av klinisk brukte spredt ut Bragg topp, slik det anvendes her, er tilnærmet 50 keV /um. I tillegg, i motsetning til de resultater som er beskrevet her, induksjon av senescens og forlenget (mer enn 3 dager) G2 /M rest ble også observert i tidligere studier ved hjelp av karbon-ion bestråling med høy LET-verdier [12], [36] . Disse data tyder på at DDR varierer avhengig av LET verdien av karbon-ion bestråling anvendes. Tilleggs
in vitro Hotell og
in vivo
studier av en rekke cellelinjer er nødvendig for å validere den terapeutiske effekten av karbon-ion bestråling på LET som brukes i kliniske settinger.
i sammendrag, denne omfattende analyse av DDR i bestrålte isogene cellelinjer viser at røntgenbestråling bestandig p53-null cancerceller er utsatt for karbon-ion strålebestråling, som effektivt induserer mitotisk katastrofe (fig. 8). Induksjon av mitotisk katastrofe i apoptose-resistente svulster kan være en viktig biologisk fordel av karbon-ion strålebehandling spissen røntgen strålebehandling. Andre studier med dyremodeller eller kliniske prøver er nødvendig for å belyse dette spørsmålet nærmere.
C-ion, karbon-ion.
Hjelpemiddel Informasjon
S1 Fig.
Egenskaper av p53
+ /+ og p53
– /- celler
doi:. 10,1371 /journal.pone.0115121.s001 product: (PDF)
S2 Fig. Bedrifter Den moduser av celledød indusert av røntgenbestråling for D
10 i HCT116 p53
– /- celler
doi:. 10,1371 /journal.pone.0115121.s002
( PDF)
S3 fig. Bedrifter Den moduser av celledød indusert av X-ray eller karbon-ion bestråling i BJ hTERT-WT eller -shp53 celler
doi:. 10,1371 /journal.pone.0115121.s003 product: (PDF)
S1 Table. .
Antallet γH2AX foci per celle etter bestråling
doi: 10,1371 /journal.pone.0115121.s004 product: (PDF)
S2 Table.
LET-avhengighet av effekten av apoptose induksjon av karbon-ion bestråling i p53-mutant kreftceller
doi:. 10,1371 /journal.pone.0115121.s005 product: (PDF)
takk
Vi takker Dr. Tetsushi Sadakata, Dr. Kohta Torikai, og Dr. Mayumi Komachi (Gunma University) for teknisk assistanse. Vi takker Dr. Volgelstein (Johns Hopkins University) for å gi cellelinjer.
