Abstract
Lungekreft er den ledende dødsårsaken fra ondartede sykdommer over hele verden, med ikke-småcellet (NSCLC) subtype sto for de fleste tilfeller. NSCLC er preget av hyppige genomisk ubalanse og kopi nummer variasjoner (CNVs), men de epigenetiske avvik som er knyttet til klinisk prognose og behandlingssvikt er fortsatt ikke helt identifisere. I denne studien ble totalt 55 lungekreftpasienter inkludert, og vi gjennomførte genomisk og genetisk uttrykk analyser, immunhistokjemiske protein deteksjon, DNA metylering og kromatin immunoutfellingsstudier analyser for å få genetiske og epigenetiske profiler knyttet til prognose og chemoresponse av NSCLC pasienter. Til slutt, siRNA transfeksjon-mediert genetisk taushet cisplatinaindusert cellular cytotoksisitetsassayer hos NSCLC cellelinjer A-427 og iner-37 ble vurdert å beskrive chemoresistance mekanismene som er involvert. Våre resultater identifisert høye frekvenser av CNVs (66-51% av tilfellene) i 7p22.3-p21.1 og 7p15.3-p15.2 cytogenetiske regioner. Men overekspresjon av gener, for eksempel
MEOX2
,
HDAC9
,
TWIST1 Hotell og
AhR
, ved 7p21.2-p21.1 locus skjedde til tross for fraværet av CNVs og små endringer i DNA-metylering. I kontrast til promoter sekvenser av
MEOX2 Hotell og
TWIST1
vises betydelig lavere /reduksjon i det undertrykkende histone mark H3K27me3 og økt i den aktive histone mark H3K4me3 nivåer. Endelig disse resultatene korrelerer med dårlig overlevelse i NSCLC og cellulær chemoresistance til onkologiske narkotika i NSCLC cellelinjer i et
MEOX2 Hotell og
TWIST1
overekspresjon avhengig-måte. I konklusjonen, rapporterer vi for første gang at
MEOX2
deltar i chemoresistance uavhengig av høy CNV, men det er betydelig avhengig H3K27me3 berikelse sannsynligvis knyttet til aggressivitet og kjemoterapi svikt i NSCLC pasienter, må imidlertid flere kliniske studier være utført for å bekrefte våre funn som nye sannsynlige kliniske markører i NSCLC
Citation. Ávila-Moreno F, Armas-López L, Álvarez-Moran AM, López-Bujanda Z, Ortiz-Quintero B, Hidalgo-Miranda A, et al. (2014) Overuttrykte
MEOX2 Hotell og
TWIST1
er assosiert med H3K27me3 Levels og Bestemmer Lung Cancer Chemoresistance og prognose. PLoS ONE 9 (12): e114104. doi: 10,1371 /journal.pone.0114104
Redaktør: Santosh Patnaik, Roswell Park Cancer Institute, USA
mottatt: 12 august 2014; Godkjent: 29 oktober 2014; Publisert: 02.12.2014
Copyright: © 2014 Ávila-Moreno et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter tall og filer. Array data er blitt sendt til GEO database (GSE62407)
Finansiering:. FAM forfatter ble støttet av National Council of Science and Technology (CONACyT), midler til forskning i grunnleggende vitenskap, Prosjekt 0053643; Forskning Direction av National Institute of luftveissykdommer (iner); og National Autonomous University of Mexico, UNAM, Prosjekter IACOD-PAPIIT IA201611, PAPIIT IB202512 og PAPIIT RR282512. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft er fortsatt den ledende årsak til kreft dødsfall i både USA [1] og på verdensbasis, med ikke-småcellet (NSCLC) subtype sto for de fleste tilfellene hos røykere og ikke-tobakks relaterte pasienter [2]. Sene diagnoser og ineffektive therapeutics bidra til dårlig prognose og gjennomsnittlig 5-års overlevelse mindre enn 15% [1], [3], [4], [5].
NSCLC er preget av genomiske avvik, som omfatter vanlige somatiske DNA kopi nummer variasjoner (CNVs). Sammen genomisk hybridisering (CGH) ved spektral karyotypering [6] eller lav oppløsning genomisk DNA microarray analyser [7], [8], [9] har markert tap /slettinger på 2q36-37, 3p21, 8p22, 9p21-22, 9q22 , 13q22 og 17p12-13, og gevinst /presiseringer i 1q23, 1q31, 3q25-27, 5p13-14, 6p, 7q og 8q23-24; Men få av disse endringene har vist seg å være involvert i tumor aggressivitet [9] eller den kliniske utviklingen av NSCLC.
Nylig har internasjonale konsortier for studiet av lungekreft brukes høy tetthet SNP arrays (250 K) for å beskrive CNVs, slik som 5p15.33, 7p11.2, 14q13.3 og 17q12, samt microdeletions ved 5q11.2, 7q11.22 og 9p23 [10]. Noen av disse CNVs, som for eksempel gevinst ved 14q13.3 inneholder
NKX2-8 product: [11] og
NKX2-1
gener [10], har vist seg å være funksjonelt involvert i vekst , overlevelse og tumorigen aktivitet i NSCLC [10], [11]. Økninger i den CNV ved 5p13.2 locus er blitt foreslått som en ny molekylær markør for tidlig pre-invasivitet [12]. I tillegg er en genetisk signatur av mRNA overekspresjon fra 7q11.23, 14q23.2 og 17q21.2 (
STX1A
,
HIF1A Hotell og
CCR7
, henholdsvis) har vært identifisert som en prediktiv progresjon-prognose signatur i de tidlige kliniske stadier av NSCLC [13].
Dårlige prognoser har blitt assosiert med den 7p locus, som kan være delvis forårsaket av, for å øke CNV og overekspresjon av potensielle onkogener ved 7p15.3-11.2, som har blitt beskrevet i 56% av NSCLC-cellelinjer [14]. Også gevinst ved 7p12-21 har blitt identifisert i nesten 50% av NSCLC pasienter med metastatisk sykdom [15], som kan representere en av de karyotypic evolution modeller av NSCLC basert på gevinster på kromosom 7 [16]. Videre kan epigenetiske avvik, slik som DNA hypermethylation ved 7p15.2 [17], representerer relevante reguleringsmekanismer og /eller markører, ikke bare for lungekreft biologi [16], men også for NSCLC progresjon, på grunn av deres nærvær i løpet av den tidlige [ ,,,0],17] og sene kliniske stadier [10], [11], [15]. Men til dags dato, de molekylære relasjoner mellom høyfrekvente CNVs, epigenetiske avvik, pasient prognoser og onkologisk svikt i NSCLC har ennå ikke fullt ut undersøkt.
I denne studien har vi forsøkt å relatere potensielle epigenetiske modifikasjoner med mønsteret av DNA kopiere antall endringer i NSCLC gjennom bruk av høyoppløselige flislegging SNP arrays (500 K). Vi identifiserte presiseringer ved 7p22.3-p22.1, 7p21.3-p21.1 og 7p15.3-p15.2 cytogenetiske regioner i området 66-51% av våre saker. Disse presiseringer resulterte i
MEOX2
,
HDAC9
,
TWIST1 Hotell og
AhR
overekspresjon tross de små økte nivåer av DNA metylering. Men den betydelig lavere berikelse av det undertrykkende histone markør H3K27me3 og betydelig økt aktivering av H3K4me3 både på
MEOX2 Hotell og
TWIST1
promoter regioner ble korrelert med dårlige kliniske prognoser. Derfor, som vi viste i NSCLC cellelinje-modeller, korrelerer cisplatinaindusert chemoresistance med en over-uttrykk for
MEOX2 Hotell og
TWIST1
gener, hovedsakelig på grunn av tap av histone undertrykkende merkene H3K27me3. Våre resultater tyder på at epigenetiske mekanismer stige genetiske (CNV) avvik på 7p21 og utfylle dem, og dermed bidra til aggressivitet og svikt i onkologisk behandling i NSCLC.
Materialer og metoder
Prøvevalg
Det er totalt 55 lungesvulster (LT), 15 tilstøtende ikke-involvert lunge matchet vev (LNAT) og 20 lunge forstadier (LP) fra Fresh Frozen (FF) og formalinfiksert og parafin Embedded (FFPE) vev behandlingen metoder, ble hentet fra Thoracic Kirurgisk service og patologi service ved Statens institutt for luftveissykdommer (iner). I tillegg er NSCLC-cellelinjene SK-MES-1, A-549, A-427, ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA) og Iner-37, iner-51 ble oppnådd fra meksikansk Mestizo pasienter, som tidligere rapportert [18], [19].
Etikk erklæringen
Institutional Review Board (IRB) av National Institute of luftveissykdommer (iner) godkjente protokoller med register B17 -07 og B09-08, og fra Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM), FES-Iztacala, biomedisin Research Unit gjennomgått og godkjent protokoller for disse genetiske og molekylærbiologiske studier. Informert samtykke ble oppnådd fra pasienter med diagnose av LT og gjennomgår kirurgiske prosedyrer. Alle fag signert informert samtykke brev for disse undersøkelsene på thoraxkirurgi service, iner, og de autoriserte lagring av sine biologiske prøver på iner og UNAM repositories for dette og fremtidige studier. I denne studien har vi ikke samlet prøver fra mindreårige /barn, bare unge voksne eldre enn 18 år ble inkludert.
SNP Kartlegging Array 500 K Hybridisering og bioinformatikk Analyser
Totalt 30 LNAT, LT, LP og NSCLC cellelinje DNA-prøver ble inkludert i matrisen hybridisering plattform (SNP 500 K) og i noen tilfeller for SNP 6,0 arrays, i henhold til produsentens anbefalte instruksjoner (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA), og analysert ved hjelp av den tidligere beskrevne metoden [20] ved å sammenligne 300 humane friske donorer fra den meksikanske Mestizo populasjonen haplotype Kartdatabasen databasen~~POS=HEADCOMP tidligere beskrevet [21]. Affymetrix SNP arrays data (Affymetrix Console versjon 4.1.3), ble importert, normalisert og økninger av CNV ble identifisert ved hjelp av Partek Genomics Suite Program Mislighold og Partek Genome Se Tools (Parteks, Saint Louis, MI, USA), da gjennomsnittet av 20 SNP skredet en kopi rekke forhold på 2,5 eller var mindre enn 1,5 (
FDR
≤0.02). Pathway prediksjon analyser fra genene med kopi nummer endringer i våre NSCLC prøvene (File S1) ble utført ved hjelp av programvaren Oppfinnsomhet System Program (versjon 7.0). Listen over avvikende gener som inngår i vår mobil vei prediksjon analyser, ble valgt basert på tilgjengeligheten av uttrykk profiler i menneskelige lunge vev og lunge carcinoma vev, ved hjelp av data i EntrezGene surfing (https://www.ncbi.nlm.nih.gov /gen) og nettleser GeneCards Menneskelig Gene Database (https://www.genecards.org/). SNP tabellens data inkludert i denne studien ble sendt inn og godkjent av Gene Expression Omnibus (GEO) database med GEO offisielle tallet. GSE62407
Immunohistokjemiske Analyser i Histologiske Samples
Immunohistokjemiske Analysene ble utført på LNAT, LT og LP vevsprøver fiksert med formaldehyd 10% eller håp i /II reaktive Metode (Innovative Diagnostik-System, Tyskland), og deretter ved hjelp av 1-2 ug av spesifikke antistoffer anti-MEOX2, anti-TWIST1, anti-HDAC9 og anti-EVX1 (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, Texas, USA), ved inkubering i et fuktighetskammer og i tillegg av den antigen-spesifikke reaksjon med avidin-biotin-peroksidase /diamino-benzidin system (Dako, Carpinteria, CA, USA ). En Ventana System enhet (Roche, Tucson, Arizona, USA) og en overført lysmikroskopi studie (Leica, Bannockburn, IL, USA), ble brukt for å photomicrographs på 40X og 80X forstørrelse.
Real-Time PCR for mRNA uttrykk og DNA Kvantifisering analyser
for mRNA uttrykk analyser, cDNA ble syntetisert fra 2 mikrogram total RNA med høy kapasitet Kit (Life Technologies Corporation, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). cDNA og genomisk DNA ble også forsterket ved hjelp av SYBR Grønn qPCR analyser og oligonukleotid sett designet av Primer Design og /eller Vector NT programmer, og syntetisert av Sigma-Genosys (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), beskrevet for mRNA uttrykk analyser i tabell S1, og for DNA promotersekvenser analyse i tabell S2.
kvantitativ real-time PCR (qPCR) ble utført på en Step One Plus og 7500-enhet (Life Technologies Corporation, Applied Biosystems, Foster City , CA, USA), og i en LightCycler 480 System (Roche, Mannheim, Tyskland) ved hjelp av strøm SYBR Grønn (Life Technologies Corporation, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) og Maxima SYBR Grønn qPCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific , Fermentas, Life Science, Foster City, CA,).
vilkår for relativ kvantitativ PCR-reaksjon ved hjelp Fermentas SYBR Grønn var som følger, en syklus på 50 ° C i 2 min, en syklus på 95 ° C for 10 minutter, 40 sykluser av 95 ° C i 15 s, 60 ° C i 30 s, og ytterligere forlengelsestrinn ved 60 ° C i 30 sek. Mens for Applied Biosystems Strøm SYBR grønn var som følger: en syklus på 50 ° C i 2 minutter, en syklus på 95 ° C i 10 minutter, 40 sykluser av 95 ° C i 15 s, 60 ° C i 30 s, og 72 ° C i 30 sek. Ved slutten av PCR-reaksjonen, ble prøver underkastet en smelting analyse for å bekrefte spesifisiteten av amplikon, og β-aktin-genet ble anvendt som rengjøring for normalisering analyse.
Restriction Enzyme Metylering-Sensitive Assays
Metylering status av genomisk DNA (200 ng) som ble avledet fra LNAT, ble LT og LP vev og lungekreft cellelinjene undersøkt ved anvendelse av 0,5 enheter hver enkelt av en kombinasjon av metylering følsomme restriksjonsenzymer
HpaII
,
HpyCH4IV Hotell og /eller
AciI plakater (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) og inkubasjon ved 37 ° C, i 4 timer. Etterfulgt av metylering-sensitive PCR amplifikasjonsanalyser hjelp oligonukleotid sett (Tabell S2), designet innsiden av den anslåtte CpG øyene arrangørens målgener (
MEOX2
,
HDAC9, TWIST1
, og
AhR
), etter kriterier som øya size 100, og GC Prosent . 50.0, som bruker MethPrimer å legge så mange restriksjonsseter for å oppnå enzymer følsomme for metylering status, inne i amplicon og indikerte at Table S3
metylering Sensitive PCR-analyser
metylering status (%) ble beregnet på grunnlag av metylering Sensitive PCR-analyser ved å bruke oligonukleotid sett inneholder CpG områder inne på amplicon på arrangørens målgener undersøkt (
MEOX2
,
HDAC9, TWIST1
, og
AhR
) beskrevet i tabell S3. I korthet, ble 50 ng av spaltede DNA brukes som inngang på 25 ul av total PCR-reaksjon, og produktstørrelser analysert, i henhold til tabell S3, følger de neste PCR-betingelser: en syklus på 95 ° C i 10 minutter, 40 sykluser av 95 ° C i 15 s, 55 ° C i 30 s og 72 ° C 45 s.
Videre ble (NSCLC) celle human lunge linjene A-427 og iner-37 anvendes for å standardisere enzymatisk restriksjons forhold, utvikle
in vitro
metylering analyser ved anvendelse av CpG metyl-transferase (M.SssI) og S-adenosylmethionin (SAM), ved inkubering ved 37 ° C i 4 timer. Standard metylert DNA og menneskelig sæd DNA ekstrahert fra friske donorer ble brukt som hyper-denaturert og hypo-denaturert DNA-kontroller for enzymatiske restriksjons analyser.
In Vitro
DNA Metylering og Histone Modification Hemming Analyser
A-427 og iner-37 humane NSCLC (adenokarsinom) cellelinjer (5 × 10
5 celler) ble behandlet
in vitro
med 5′-aza-deoxycytidine [4 mikrometer ], for å inhibere
de novo
DNA-metylering ved sekvenspromotorer, og /eller med TSA [300 nm], for å inhibere aktiviteten av histon deacetylases (HDACs) i løpet av 48 timer.
Kromatin Immunoutfelling (chip)
Fersk frossen LT (3 mm
3) ble pulverisert under flytende nitrogen frysing og festes med 1% formaldehyd under 10 min, og umiddelbart nøytralisert med 0,125 M glysin under 5 min. Resulterende cellene ble vasket med 1% PBS og lysert med lyseringsbuffer (50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA pH 8, Triton X-100 1%, 0,1% natriumdeoksycholat, 0,1% SDS) inneholder proteasehemmer
komplett mini
en tablett i 10 ml (Roche, Indianapolis, iN, USA).
Chromatin fra LT prøvene ble ultralyd bruke 10 pulser av 20 sekunder w /u 60 watt. 10 ug av kromatin ble immunopresipitert (chip) ved bruk av kommersielt sett EZ-Magna ChIP G (Millipore, Temecula, CA, USA), og ved bruk av 2,5 ug av anti-H3K27Ac, anti-H3K4me3, anti-H3K27me3, anti-H3K9me3 og anti -RNA Pol II aktivert antistoffer (Abcam, Cambridge Science Park, Cambridge, UK). 1 ug av anti-muse-IgG ble anvendt som en negativ kontroll for brikke (Millipore, Temecula, CA, USA). Integritet og kvalitet av promotersekvenser av immuno-utfelt DNA (IP-DNA) ble vurdert ved PCR-amplifisering produkt av 166 bp for den promoter-sekvensen av genet som GADPH som anbefalt av leverandøren (Millipore, Temecula, CA, USA).
IP-DNA-amplifikasjon og chip Kvantitative analyser bruke qPCR Analyser
immunopresipitert DNA (IP-DNA) 20 ng ble lineært forsterket ved hjelp av Whole Genome Amplification (WGA1) Kit (Sigma, St. Louis, MO , USA), og etter dette ble renset ved MiniElute kolonner (QIAGEN, Hilden Renania-Westfalia, Tyskland).
IP-DNA oppnådd fra både LT prøver og LT-cellelinjer ble analysert ved qPCR absolutt kvantifisering ved hjelp av LightCycler 480 System (Roche, Mannheim, Tyskland), og SYBR Grønn Master Mix (Thermo Fisher Scientific, Fermentas Life Science, Foster City, CA, USA) og oligonukleotid sett for målene og kontroller (tabell S2).
IP-DNA 20 ng ble anvendt per reaksjon, ble likeledes forsterkningen av standardkurver utvikles, gjennom seriefortynninger av nativt DNA fra perifert blod mononukleære celler fra friske givere (100 ng, 10 ng, 1 ng, 0,1 ng, og 0,01 ng), og bruke oligonukleotid sekvenser mål (Tabell S2), og oligonukleotid sekvensstyring som C-fos promoter tatt fra Chromatin Immunpresipitasjon kit Magnify System (Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA).
Cellular cytotoksisitetsassayer
Cellular levedyktighet analysene ble utført i 96-brønners plater ved anvendelse av 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -5- (3-carboxymethoxyphenyl) -2- (4-sulfofenyl) -2H-tetrazolium (MTS ) (Promega, Madison, WI, USA) i fravær eller nærvær av den oncologic medikament cisplatina. For å gjøre dette, ble 96-brønners plater sådd med 3000 til 5000 celler i 200 ul RPMI-1640 medium i 48 timer, og senere, inkubert med 10 ul MTS [5 mg /ml] i 3 timer, for senere lesing på 550 nm og /eller 570 nm, ved å benytte formelen: cellenes levedyktighet = (OD av prøven /kontroll OD) x 100. Likeledes ble stoffet motstand kurver utviklet i et dose-respons avhengig måte ved hjelp av serielle fortynninger av kreftmedisinen cisplatinaindusert.
Genetisk lyddemping (siRNA Transfeksjon Analyser)
Vi brukte små interfererende RNA (siRNAs) rettet mot
MEOX2 plakater (sc-106233),
TWIST1 plakater (sc-38604) og ikke-menneskelige relatert mRNA som en negativ kontroll (sc-37007 og sc-44230) alle hentet fra Santa Cruz Bioteknologi (Dallas, Texas, USA). Kort sagt ble cellekulturer med 3% av antibiotika-fritt FCS inkubert i 96-brønners plater i løpet av 12 timer og deretter transfektert med RNAi-reagens, Lipofectamine (Life Technologies Corporation, Invitrogen, Foster City, CA, USA) og sirnas ved 50 nM, i et totalt volum på 100 ul.
Western blot
Proteiner ble ekstrahert og renset ved fremgangsmåten ifølge TRIZOL (Invitrogen), suspendert i 5% SDS med proteasehemmere (komplett mini, Roche, Indianapolis, IN, USA) og kvantifisert ved Lowry-metoden. Total proteiner (30 ug) ble underkastet elektroforese i vertikal akrylamidgeler 12%, og deretter ble overført til nitrocellulosemembraner ved hjelp av Trans-Blot-Turbo utstyr /Transfer System (BioRad, Hercules, CA, USA). Membraner ble inkubert over natten ved 4 ° C, blokkering med lettmelk 5% i PBS 1X /Tween 20 0,1%, og inkubert 2 timer med antistoffer (MEOX2) 1:1500, (TWIST1) 1:1500, (β-actin) 1 :3000, eller (GAPDH) 1:3000 (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, Texas, USA). Membranene ble inkubert i 1 time med et sekundært antistoff (anti mus HRP /anti kanin HRP) 1:10000, ved værelsestemperatur og avdekket med Luminol 1 min ved romtemperatur ved hjelp av C-siffer scanner (Li-cor, Lincon, Nebraska, USA ) og Hypercassette og Films (Amersham, Chalfont, Buckinghamshire, England).
statistiske analyser
Fishers eksakte test,
t
-test og Mann Whitney-U statistiske testene var brukes til å analysere forskjeller mellom grupper av pasienter,
p
verdier ≤0.05 ble ansett som statistisk signifikant. Vi brukte også Log-Rank (Mantel Cox) og Gehan-Breslow-Wilcoxon overlevelse kurve tester. Alle statistiske analyser ble utført ved hjelp av SPSS statistisk programvare for Mac-OS X (versjon 11.0) og GraphPad (versjon 5.0).
Resultater
kromosom Microaberrations og økt kopiantall variasjoner (CNVs) med høy frekvenser på 7p22-21 og 7p15 i lungekreftpasienter
for å identifisere de hyppigste genetiske microaberrations med sin sannsynlige genetisk uttrykk profiler og epigenetiske avvik i lungekreftpasienter, LNAT-, LP-, LT og NSCLC cellelinje-avledet DNA-prøver (n = 30) ble underkastet genomiske hybridiseringsanalyser på SNP 500 K mikromatriser. Den bioinformatikk segmentanalyser kunne identifisere kromosomavvik og økt CNVs i LT-avledede prøver, som ikke ble observert i LNAT-avledet matchet vev. Typiske kromosomavvik i lungekreft blant 3p slettinger; amplifikasjon av flere områder på kromosom 5, 12, 14, 16, 18, 19 og 20; og forsterkning /sletting av flere deler av kromosom 8 ble identifisert (figur 1A).
Focal analyse av hele genomet og kromosom 7. (A) En hel-genomet forsterkning og en bioinformatikk sekvensiell analyse av tre lungekreft pasienter ble utført med matchet, histologisk tilstøtende ikke-involverte lungevev (LNAT) og lungekarsinom (LT). (B) Hel-genom og fokale analyser av normal lunge, lunge forstadier og lungekarsinom (18-14 av 27 lungelesjoner med høy CNV). (C) Et samlings analyse av kromosom 7 avdekket en høy frekvens av CNV i regionen 7p21 (pil) i forstadier lungelesjoner og lungekarsinom.
En høy frekvens av CNV å bruke fokus genomisk analyser på 7p22. 3-p22.1, ble 7p21.3-p21.1 og 7p15.3-p15.2 (figur 1B) oppdaget. Spesielt observerte vi DNA presiseringer på 7p21.1 locus i LT og LP-avledet prøver i nesten 55% av tilfellene (15/27 lungelesjoner), inkludert 3 av 4 forstadier (figur 1C og Figur S1), som ikke ble observert i LNAT-avledede prøver (figur 1C).
Videre bekreftet vi økninger i CNV på 7 p locus i både LP- og LT-avledede prøver ved bruk av SNP 6,0 plattformen (figur S2 ). De 39 gener med de høyeste tallene for endring i CNV er vist i tabell S4. Disse endringene ble plassert i 7p22.3-p22.1 og 7p21.3-p21.1 cytogenetiske regioner, og de inkluderte
ZNF12
,
RPA3
,
MEOX2
BZW2
,
TSPAN13
,
AGR2
,
AGR3
,
AhR
,
TWIST1 Hotell og
HDAC9
. Endringer i
TWISTN
,
HNRNPA2
,
CBX3
,
Hoxa
klynge og
EVX1
, som er plassert på 7p15. 3-p15.2, ble også identifisert (tabell S4).
Vi oppdaget totalt 1.376 gener med kopi nummer endringer i våre menneskelige lungekreft prøver (File S1). Av disse genene, ble 809 gener amplifisert ved en frekvens på 37-66% ved kromosom 7.
Basert på denne analysen fant vi en anriking av gener involvert i mange cellulære signalbaner, særlig cellesykluskontroll, cellulær bevegelsen , celledød og embryoutvikling nettverk (data ikke vist), noen av dem oppført i tabell S4, noe som tyder på at genetiske og /eller epigenetiske avvik spiller en funksjonell viktig rolle i lungekreft biologi.
Økning i CNV på 7p21 og 7p15 korrelerer med mRNA og protein Overuttrykte og ikke med DNA metylering i Lung Cancer
korrelasjonen mellom økningen i CNV og relative mRNA uttrykk nivåer, samt virkningen av DNA metylering på mRNA uttrykk profiler ble analysert i lungekarsinom. Bruke QRT-PCR-analyser, fant vi at bare
MEOX2
,
HDAC9 Hotell og
TWIST1 plakater (figur 2A), samt
AhR Hotell og
EVX1
gener (fig S3A-B) ble overuttrykt og positivt korrelert med CNV-høy kontekst (figur 1 B og C, og fig S1), sammenlignet med andre gener ved 7p21 (ikke vist). Uttrykket av disse genene var signifikant høyere i LT-avledet prøvene enn i de LNAT-avledede prøver (
p
≤0.05). I tillegg er de kjernefysiske protein nivåer av
MEOX2
,
HDAC9 Hotell og
TWIST1
ble konsekvent økt de LT-avledede prøver (figur 2B) samt
MEOX2
og
TWIST1
protein nivåer /mengder i NSCLC-cellelinjer (figur S4A-C), mens ekspresjonen av disse proteiner i den tilstøtende pulmonale parenchyma og LNAT-avledede prøvene ikke ble øket (figur 2B ), som detektert ved hjelp av immunohistokjemi. En økning i
EVX1
uttrykk ble oppdaget på membraner i LP- og LT-avledede prøver og NSCLC cellelinjer (figur s5a-B).
(A)
MEOX2
,
HDAC9 Hotell og
TWIST1
mRNA uttrykk. Feilfelt representerer 95% av konfidensintervall for gjennomsnittet. (B) Protein ekspresjon i tilgrensende ikke-involvert lungevev (LNAT), lunge forstadier (LP) og lungekarsinomer (LT) (mikrofotografier ved 200X og 400X), så vel som formalinfiksert og parafin-innleiret (FFPE) og ferskt frosset (FF) vev, ble sammenlignet. (C) promotoren sekvensanalyse metylering. Forskjellene var statistisk signifikante med hensyn til LNAT og ble oppdaget ved hjelp av Fishers eksakte test, en uparet
t
-test og en Mann-Whitney U test, *
p
≤0.05; **
p
≤0.005; ***
p
≤0.001. Feilfelt angir min til max rank med 95% konfidensintervall, og boksplott representerer standardavvik av gjennomsnittet.
For ytterligere å undersøke effekt på genekspresjon av gener assosiert til CNV, involvering av epigenetisk endringer, spesielt DNA-metylering, ble målt. Metylering følsomme enzymatiske restriksjons analyser viste små forskjeller i DNA metylering prosent mellom LNAT- og LT-avledede prøver i promotor sekvenser av
MEOX2
,
HDAC9 Hotell og
TWIST1
(figur 2C), noe som tyder på en manglende sammenheng mellom mRNA uttrykk og DNA metylering (figur 2A og 2C). I tillegg identifiserte vi en reduksjon i DNA metylering for
MEOX2
,
HDAC9 Hotell og
TWIST1 product: (
p
≤0.005 og
p
≤0.001, henholdsvis), i LP-avledet prøvene som ikke ble observert i LNAT- og LT-avledede prøver (Figur 2C).
som et supplement, en sammenkoblet analyse mellom LNAT- og LT avledede prøver i noen CNV-frie pasienter avslørte også en mRNA overekspresjon av
MEOX2
,
HDAC9
, og
TWIST1
, tyder på en mangel på genetisk (CNV) og epigenetisk (DNA-metylering) korrelasjon (figur S6a-C), og en mangel på genetisk-epigenetisk korrelasjon i CNV-høy pasienter (figur S7A-C); med unntak for
AhR
gen mellom LNAT- og LT-prøvene (figur S3A, S3C), og mellom CNV-frie og CNV-høy pasienter (S6D og S7D). Oppsummert våre data tyder på at DNA metylering er ikke hovedansvarlig for de observerte uttrykk mønstre på 7p21 cytogenetisk regionen i lungekarsinom, for eksempel NSCLC.
Reduksjoner av Histone Code of H3K27me3 og Økninger i H3K4me3 er assosiert med
MEOX2 Hotell og
TWIST1
Overuttrykte og korrelert med dårlig klinisk Prognose i NSCLC
Derfor spurte vi om andre epigenetiske modifikasjoner kan delta i reguleringen av de berørte gener, fokus på 7p21 cytogenetisk regionen i NSCLC.
på dette, som et helt uavhengig valideringsstudie, rollen histonmodifikasjonene i overekspresjon av
MEOX2 Hotell og
TWIST1
i NSCLC pasienter ble evaluert. For denne analysen en ekstra gruppe pasienter som hadde gjennomgått en klinisk oppfølging ble undersøkt for å finne ut om
MEOX2 Hotell og
TWIST1
overekspresjon i tumorvevet ble assosiert med nivåene av H3K27me3
vs.
H3K27Ac og H3K4me3 og kan bestemme prognose og /eller reaksjonsevne til onkologisk behandling i NSCLC.
En paret analyse mellom LNAT- og LT-avledet prøver, i samarbeid med
MEOX2 Hotell og
TWIST1
overekspresjon (figur 3A-B), viste en reduksjon i H3K27me3 (figur 3C-D). De pasienter med lavere berikelse nivåer av det undertrykkende histone H3K27me3 og høy
MEOX2 Hotell og
TWIST1
mRNA uttrykk (figur 3A-D) vises dårlig overlevelse, med et gjennomsnitt på 6,2 måneder (DSE, RSCL, MGGR, GOMJ og GCH pasienter), mens pasienter med høyere H3K27me3 berikelse nivåer og lav
MEOX2
og
TWIST1
mRNA uttrykk (figur 3A-D) vises bedre overlevelse, med et gjennomsnitt på 53,4 måneder (GMRM, AEE, SPN, GHM og PMA pasienter med
p
≤0.0027) (Figur 3E, tabell 1).
(A)
MEOX2
uttrykk i NSCLC og LNAT-avledede prøver, og (B)
TWIST1
uttrykk i NSCLC og LNAT-avledede prøver. Feilstolpene representerer standardfeil av gjennomsnittet av tre replikater. (C) Histone modifikasjon berikelse profil av
MEOX2
promotorsekvens. (D) Histone modifikasjon berikelse profil av
TWIST1
promotorsekvens. Boksplott representerer gjennomsnittet av tre gjentak. Analysen avdekket en sammenheng mellom lav mRNA uttrykk og H3K27me3 berikelse. (E) Overlevelse kurve analyser basert på Log-Rank (Mantel Cox) og Gehan-Breslow-Wilcoxon tester av den relative uttrykk indeksen for
MEOX2
pluss
TWIST1 product: (
p
≤0.0027).
også signifikant økt nivå (
p
≤0.008) av det undertrykkende histone markør på H3K27me3 både
MEOX2 Hotell og
TWIST1
promotersekvenser ble bekreftet for pasienter med høyere overlevelsesrate (figur 4A-B). Det ble imidlertid ikke vesentlige endringer i H3K27Ac nivåer observert (Figur 4C-D). Derimot ble reduserte nivåer av aktiverings markør H3K4me3 oppdaget både på
MEOX2 product: (
p
≤0.028) og
TWIST1 product: (
p
≤ 0,0006) promoter sekvenser i høy overlevelse pasientgruppen (figur 4E-F) og ble korrelert med delvis respons på adjuvant cisplatinaindusert eller carboplatinum, som første linje kjemoterapi hos NSCLC pasienter (tab 1).
(A ) H3K27me3 berikelse i
MEOX2
promotorsekvens (** Mann-Whitney U test,
p
≤0.01, og F-test,
p
≤0.0003) og (B ) H3K27me3 berikelse i
TWIST1
promotorsekvens i høye overlevelses pasienter sammenlignet med pasienter med dårlig prognose (*** Mann-Whitney U test,
p
≤0.01 og uparet t-test
p
≤0.02). (C) H3K27ac berikelse i promotorsekvens av
MEOX2 plakater (ingen vesentlige endringer) og (D) H3K27ac berikelse i promotorsekvens av
TWIST1
i høye overlevelses pasienter sammenlignet med pasienter med dårlig prognose (ingen signifikante endringer). (E) H3K4me3 berikelse i
MEOX2
promotorsekvens (* F-test,
p
≤0.02) og (F)
TWIST1
promotorsekvens i høy overlevelse pasienter sammenlignet
