Abstract
Bakgrunn
Curcumin hemmer veksten av kreft i bukspyttkjertelen tumorxenotransplantater i nakne mus; derimot, er virkningsmekanismen ikke er godt forstått. Det blir stadig klarere at RNA bindende proteiner regulere posttranskripsjonelt genekspresjon og spiller en avgjørende rolle i RNA stabilitet og oversettelse. Her har vi fastslått at curcumin modulerer uttrykk for RNA bindende protein CUGBP2 å hemme kreft i bukspyttkjertelen vekst.
metodikk /hovedfunnene
I denne studien, viser vi at curcumin behandlet tumorxenotransplantater ha en betydelig reduksjon i tumorvolumet og angiogenese. Curcumin hemmet spredning, mens indusere G2-M og apoptose resulterer i mitotisk katastrofe av ulike kreft i bukspyttkjertelen celler. Dette ble ytterligere bekreftet ved øket fosforylering av kontrollpunktet kinase 2 (Chk2) proteinkoblet med høyere nivåer av kjerne cyklin B1 og CDC-2. Curcumin øket ekspresjon av cyklooksygenase-2 (COX-2) og vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) mRNA, men protein nivåene var lavere. Videre curcumin øket ekspresjon av RNA-bindende proteiner CUGBP2 /CELF2 og TIA-1. CUGBP2 binding til COX-2 og VEGF-mRNA ble også forbedret, og øker dermed mRNA-stabilitet, er halveringstiden endres fra 30 minutter til 8 timer. På den annen side, silencer-mediert knockdown av CUGBP2 delvis gjenopprettet ekspresjon av COX-2 og VEGF selv med curcumin behandling. COX-2 og VEGF mRNA nivåer ble redusert til å kontrollere nivåer, mens proteiner nivåene var høyere.
Konklusjon /Betydning
Curcumin hemmer bukspyttkjertelen tumorvekst gjennom mitotisk katastrofe ved å øke uttrykket av RNA bindende protein CUGBP2, og dermed begrenser oversettelsen av COX-2 og VEGF mRNA. Disse data tyder på at oversettelsen hemming er en ny virkningsmekanisme for curcumin under terapeutisk intervensjon av bukspyttkjertel kreft
Citation. Subramaniam D, Ramalingam S, Linehan DC, Dieckgraefe BK, Postier RG, Houchen CW, et al . (2011) RNA Binding Protein CUGBP2 /CELF2 formidler Curcumin-Induced Mitotisk Catastrophe av kreft i bukspyttkjertelen celler. PLoS ONE 6 (2): e16958. doi: 10,1371 /journal.pone.0016958
Redaktør: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, USA
mottatt: 14 oktober 2010; Godkjent: 18 januar 2011; Publisert: 11 februar 2011
Copyright: © 2011 Subramaniam et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Støttet av NIH gir DK062265, CA109269 og CA135559. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
til tross for fremskritt innen molekylær patogenese, kreft i bukspyttkjertelen er fortsatt et stort uløst helseproblem i USA [1]. Kreft i bukspyttkjertelen er en hurtig invasiv, metastatisk tumor, som er motstandsdyktig mot standardbehandling [2], [3]. I dag monoterapi basert kjemoterapi (f.eks gemcitabin) er bærebjelken behandling for metastatisk adenokarsinom i bukspyttkjertelen. Gemcitabin behandling har en svulst svarprosent på under 10%; på samme måte ingen av de tilgjengelige nåværende kjemoterapeutika har en objektiv responsrate på over 10% [4], [5]. Flere nylig, er legemiddelkombinasjoner med gemcitabin også blir undersøkt, men det er for tidlig å si om de er klinisk overlegen. Ikke desto mindre vil størrelsen av dette problem pålegger å behov for nye terapeutiske midler.
Epidemiologiske studier tyder på at kosthold spiller en viktig rolle i forhindring av mange kreftformer. Curcumin, en aktiv ingrediens i krydderet gurkemeie, har vist anti-tumor-effekter i prekliniske studier [6], [7]. Anti-tumor egenskaper av curcumin omfatte hemming av tumorvekst og induksjon av apoptose [8], [9], [10], [11], [12], [13], [14], [15], [16] . Pilot Fase I kliniske forsøk har vist at curcumin er trygt, selv når det forbrukes ved en daglig dose på 12 g i 3 måneder [17], [18], [19]. En siste fase I /II-studien viste at kombinasjonsbehandling med 8 g oral curcumin daglig med gemcitabin ble trygt og gjennomførbart for pasienter med kreft i bukspyttkjertelen som tilsier videre etterforskning i sin effekt [20].
Den anti-tumor egenskaper av curcumin har blitt tilskrevet, i det minste delvis, av dens evne til å hemme ekspresjon og aktivitet av cyklooksygenase-2 (COX-2) [21], [22]. Det er et hastighetsbegrensende enzym i arachidonsyre til prostaglandin synteseveien. Proteinet blir overuttrykt i inflammasjon og i en rekke kreftformer. I bukspyttkjertel kreft, er COX-2 overexpresssion forbundet med hemming av apoptose, økt svulst invasivitet, og fremming av angiogenese. Den CELF (CUGBP-ETR3-lignende faktorer) familie av RNA bindende proteiner består av seks medlemmer som er involvert i ulike cellulære prosesser, inkludert mRNA spleising, redigering, stabilitet og oversettelse [23]. Ett av medlemmene, CUGBP2 (også kjent som CELF2, ETR3, BRUNOL2, Napor2) uttrykkes overalt, om enn på høyere nivåer i muskelceller [24], [25]. I tidligere studier har vi vist at når CUGBP2 blir overuttrykt, cellene gjennomgå mitotisk katastrofe [26], [27]. Vi har også vist at CUGBP2 kan binde seg til AU-rike sekvenser i 3’untranslated region av COX-2-mRNA og øke stabiliteten av mRNA, mens inhibering av dets oversettelse [28]. Hur, er et beslektet RNA-bindende protein med strukturell likhet med CUGBP2 på den annen side involvert i å øke COX-2-mRNA-stabilitet og styrke sin oversettelse ved å binde seg til de samme AU-rik sekvens elementer [29]. En tredje RNA-bindende protein som virker som et post-transkripsjonell regulator av genekspresjon ved å gjenkjenne U-rik sekvens i RNA er TIA-1 (T-celle-begrenset intracellulært antigen-1). TIA-1 har blitt vist å inhibere mRNA translasjon i betingelser miljøstress [30], [31]. I denne artikkelen har vi fastslått effekten av curcumin på uttrykk for RNA bindende proteiner i kreft i bukspyttkjertelen celler.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Alle dyrene ble håndtert i henhold til god dyr praksis som definert av de relevante nasjonale og /eller lokale dyrevern organer, og alle dyr arbeidet ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) (Protocol # 07-009) fra University of Oklahoma Health Sciences Center.
Cells og reagenser
ASPC-en, MiaPaCa-2, Panc-1, BxPC-tre mennesker og Pan02 muse bukspyttkjertelen kreft celler (alle fra American Type Culture Collection, Manassas, VA) ble dyrket i RPMI 1640 inneholdende 10% varmeinaktivert føtalt bovint serum (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) og 1% antibiotisk-antimykotisk oppløsning (Mediatech Inc, Herndon, VA) ved 37 ° C i en fuktet atmosfære av 5% CO
2. Curcumin ble kjøpt fra LKT Laboratories, St Paul, MN.
spredning og apoptose analyser
For å vurdere spredning, celler ble sådd på 96 brønners plater og dyrket over natten. Cellene ble deretter behandlet med økende doser av curcumin i RPMI 1640-media inneholdende 10% FBS. Analyse av celleformering ble utført ved enzymatisk analyse [32]. For apoptose, ble caspase 3/7 aktivitet målt ved hjelp av Apo-en homogen Caspase-3/7 Assay kit (Promega, Madison, WI).
Colony formasjon analysen
Kort, 6 godt rettene ble sådd med 500 levedyktige celler og fikk vokse i 24 timer. Cellene ble deretter inkubert i nærvær eller fravær av forskjellige konsentrasjoner av curcumin i opptil 48 timer. Curcumin-holdige medium ble deretter fjernet, og cellene ble vasket i PBS og inkubert i ytterligere 10 d i fullstendig medium. Hver behandling ble utført i triplikat. De oppnådde koloniene ble vasket med PBS og fiksert i 10% formalin i 10 min ved romtemperatur og deretter vasket med PBS etterfulgt av farging med hematoksylin. Koloniene ble tellet og sammenlignet med ubehandlede celler.
Cell syklusanalyse
Celler ble behandlet med curcumin i 12 timer og 24 timer, og deretter trypsinert og suspendert i fosfatbufret saltvann (PBS). Enkeltcellesuspensjoner ble fiksert med 70% etanol i 2 timer, og deretter permeabilisert med PBS inneholdende 1 mg /ml propidiumjodid (Sigma-Aldrich), 0,1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich) og 2 pg DNase-fri RNase (Sigma-Aldrich) ved romtemperatur. Flowcytometri ble gjort med en FACSCalibur analysator (Becton Dickinson, Mountain, View, CA), fange 50.000 hendelser for hver prøve. Resultatene ble analysert med ModFit LT ™ programvare (Verity Software House, Topsham, ME).
Real Time Reverse-transkripsjon Polymerase Chain Reaction Analyse
Total RNA isolert fra MiaPaCa-2, Pan02 celler og tumorxenografter ved hjelp av TRIZOL-reagens ble reverstranskribert med Superscript II revers transkriptase i nærvær av tilfeldige primere hexanucleotide (alle fra Invitrogen, Carlsbad, CA). Komplementære DNA ble deretter anvendt for real-time PCR ved bruk av Jump Taq DNA-polymerase (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) og SYBR grønn flekk nukleinsyre (Molecular Probes, Eugene, OR). Som krysser terskelverdiene for de enkelte gener ble normalisert til p-aktin. Endringer i mRNA uttrykk ble uttrykt som ganger endring i forhold til kontroll. Primerne anvendt i denne undersøkelsen var som følger: β-Actin: 5′-GCTGATCCACATCTGCTGG-3 «og 5′-ATCATTGCTCCTCCTCAGCG-3′; COX-2: 5»-GAATCATTCACCAGGCAAATTG-3 «og 5′-TCTGTACTGCGGGTGGAACA-3′; VEGF: 5»-AGCGCAAGAAATCCCGGTA-3 «og 5′-TGCTTTCTCCGCTCTGAGC-3′; Hur: 5′-GTGAACTACGTGACCGCGAA-3’and 5»-GACTGGAGCCTCAAGCCG-3 «; CUGBP2: 5»-TGCTTCAACCCCCAACTCC-3 «og 5′-GTCCTTGCAGAGTCCCGAGA-3′; TIA-1: 5»-ACCCATCTGTTGAATGGCGT-3’and 5’GGCAACAGGAAAGTCTAAGGGAT-3 «; Cyclin D1: 5»-AATGACCCCGCACGATTTC-3 «og 5′-TCAGGTTCAGGCCTTGCAC-3»
RNA stabilitetsanalyse
Celler ble behandlet med curcumin i 2 timer.. Actinomycin-D (10 ug /ml endelig konsentrasjon), er en potent inhibitor for mRNA-syntese ble tilsatt til cellene og total mRNA ble ekstrahert ved 0-8 timer. RNA ble underkastet Sanntids PCR som beskrevet ovenfor. Dataene er presentert som i forhold til kontrollceller, ved tidspunktet for tilsetningen av actinomycin D.
Western Blot analyse
Cellelysater ble underkastet polyakrylamidgel-elektroforese og blottet på Immobilin polyvinylidendifluorid-membraner (Millipore , Bedford, MA). Antistoffer ble kjøpt fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA), Abcam Inc (Cambridge, MA) og Santa Cruz Biotechnology Inc (Santa Cruz, California) og spesifikke proteiner ble oppdaget av den forbedrede kjemiluminescens system (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) .
Immunpresipitasjon
For immunoprecipitation, ble cellene fiksert med 1% formalin. Lysater ble fremstilt og immunoutfelt med anti-CUGBP2 antistoff. Pelleten og supernatanten ble deretter inkubert ved 70 ° C i 1 time for å reversere kryssbindinger, og RNA ble renset og underkastet RT-PCR for å bestemme COX-2 og VEGF mRNA-nivåer.
siRNA
Sekvens rettet mot CUGBP2 mRNA 5′-GCAAACCUUACUGAUCCUA-3 «(Tiltredelse mumber ns. NM_001025076) og en egge kontroll siRNA ikke samsvarer med noen av de menneskelige gener ble hentet fra Ambion Inc, Texas, USA og transfektert med SIPORT transfeksjon reagens (Ambion).
Pan02 xenografttumorer
Fem uker gamle hann atymiske hårløse mus kjøpt fra Jackson Laboratories ble benyttet for
in vivo
eksperimenter. Musene ble opprettholdt med vann og vanlig mus chow
annonse libidum Hotell som brukes i protokoller godkjent av universitetets Animal Studies Committee. Dyrene ble injisert med 1 x 10
6 Pan02 celler i venstre og høyre flanke og tillates å danne xenografter. En uke etter planting cellene og etter å observere nærværet av en følbar tumor, curcumin (200 ug /kg kroppsvekt) i 5% Na
2 HCO
3-buffer alene ble administrert intraperitonealt daglig i 23 d. Tumorstørrelse ble målt ukentlig. Ved slutten av behandlingen ble dyrene avlivet, og tumorene ble fjernet, veiet og klargjort for bruk i histologi (hematoxylin 0,05). (B) Curcumin behandlingen resulterte i signifikant lavere tumorvekt sammenlignet med kontroller (* p 0,05). (C) Tumor snitt ble farget for CD31, en endotelcelle spesifikk overflatemarkør og med hematoksylin og eosin (H E). En representativ Figuren er presentert som viser signifikant reduksjon i mikrokar. (D) Antallet av mikrokar i tumorvev ble tellet i 12 høy strømfelt og i gjennomsnitt. Dataene viser at microvessel tetthet ble betydelig redusert i xenografter av curcumin behandlet dyr (* p 0,05)
Curcumin hemmer kreft i bukspyttkjertelen cellevekst
For å bestemme mekanisme curcumin-. mediert veksthemming, studerte vi kreft i bukspyttkjertelen celler
in vitro
. For dette har vi brukt fem forskjellige kultiverte cellelinjer MiaPaCa-2, Panc-1, ASPC-en, BxPC-3 og Pan02. Curcumin undertrykte betydelig spredning av kreft i bukspyttkjertelen cellelinjer MiaPaCa-2, Pan02, ASPC-1, BxPC-3 og Panc-1 i en dose og tidsavhengig måte. Denne anti-spredning effekt på tumorceller ble observert i løpet av en 24 timers periode, som fortsatte å øke i løpet av de neste 72 timer (fig. 2A). For å bestemme langtidsvirkningen av curcumin behandling, ble cellene behandlet med 30 pm curcumin i 24 timer, hvoretter cellene ble tillatt å vokse i normal media. Curcumin behandling trykt kolonidannelse i alle bukspyttkjertelkreft cellelinjer (Fig. 2B), noe som tyder på at curcumin er effekter på tumorceller var irreversible. Cyclin D1 er en cellecyklus regulatorisk protein som regulerer G1 til S-fase overgang av cellesyklusen, og fungerer som en kofaktor for flere transkripsjonsfaktorer [33]. Cyclin D1 overekspresjon har vært knyttet til utvikling og progresjon av kreft [34]. I begge MiaPaCa-2 og Pan02 celler, curcumin behandlingen resulterte i redusert cyklin D1 ekspresjon ved 24 timer (fig. 2C, D). Videre cyclin A2, som regulerer S /G2 progresjon, ble nedregulert potensielt langsom progresjon av celler ut av S-fase (data ikke vist).
(A) Curcumin inhiberer proliferasjon av kreft i bukspyttkjertelen celler. MiaPaCa-2, Pan02, ASPC-1 og BxPC-3-celler ble inkubert med curcumin (1-50 uM) i opptil 72 timer. Celleformering ble analysert ved hjelp av heksosaminidase enzymaktivitet. Curcumin behandling resulterte i en signifikant dose-og tidsavhengig reduksjon i celleformering i alle celler sammenlignet med ubehandlede kontroller. (B) Curcumin hemmer kolonidannelse. MiaPaCa-2 og Pan02 celler ble inkubert med 30 pM av curcumin i 24 timer og kolonier ble tillatt å dannes ved inkubering i vanlige medier inneholdende 10% FBS i ytterligere 10 d. Behandling med curcumin hemmet kolonidannelse. En representant for tre uavhengige eksperimenter er vist. (C) Ekspresjon av cyclin D1 blir undertrykt ved 24 timer. RNA fra MiaPaCa-2 og Pan02 celler inkubert med 30 mikrometer curcumin ble utsatt for Real time PCR for cyclin D1 mRNA uttrykk. Det var signifikant suppresjon av mRNA ved 24 timer, men ikke ved 12 h (* p 0,05). (D) Lysater fra MiaPaCa-2 eller Pan02 inkubert med 30 pM curcumin ble analysert ved western blotting for cyklin D1-ekspresjonsnivåer. Curcumin behandling hemmer cyclin D1 mRNA og protein uttrykk.
Curcumin induserer G2-M cellesyklus arrest før mitotisk katastrofe
Vi neste fastslått om curcumin påvirker cellesyklusprogresjon og konsekvensen av dette effekt. Curcumin indusert vekst arrestasjonen av MiaPaCa-2 i løpet av 24 timer på G
2M scenen (fig. 3A). Lignende resultater ble observert i PANC-1 og Pan02-celler (data ikke vist). Curcumin er kjent for å indusere apoptose i forskjellige kreftceller. Caspase-3 og 7 er viktige effektor molekyler som er kjent for å indusere apoptose i forskjellige kreftceller ved å forsterke signalet fra initiator kaspaser, som kaspase 8 eller caspase 10 [35], [36]. Capsase 3 og 7 ble øket i løpet av 24 timer i MiaPaCa-2-celler linje behandlet med curcumin tyder på induksjonen av apoptose (Fig. 3B). Western blot analyser av MiaPaCa-2 og Pan02 cellelysater viser en signifikant økning i den aktiverte caspase-3 i curcumin behandlede celler (fig. 3B) innfelt. Disse dataene tyder på at curcumin behandlede tumorceller ble gjennomgår apoptose. For å avgjøre om en arrestasjon på G2 fase eller manglende progresjon til mitose bidrar til høyere nivå av celler sett i G
2 M fase, vurdert vi uttrykket, og lokalisering av cyclin B1 og serin /thereonine kinase Cdc- 2. Cyklin B1 /CDC-2-komplekset spiller en betydelig rolle i G
2M faseomvandling av cellesyklus. For å indusere mitose, cyklin B1 og CDC-2 heterodimerize og lokalisere til kjernen, som i sin tur aktiverer enzymer som regulerer kromatin kondensasjon, kjernemembranen sammenbrudd og mitose spesifikk mikrotubulus reorganisering [37], [27]. Immunocytokjemisk analyse viste signifikant høyere atom nivåer av både cyclin B1 og CDC-2 i curcumin behandlede celler som tyder på at curcumin behandlede celler var under mitotisk katastrofe (Fig. 3C). I tillegg til dette, western blot analyse viste økt ekspresjon av både cyclin B1 og CDC-2 i behandlede celler curcumin og fosforylering av Chk2 kinase i begge MiaPaCa-2-celler i kultur, og de Pan02 tumor xenograft vev (Fig. 3D). Gitt at cellene ble gjennomgår apoptose på samme tid som de var i G2-M arrest, antyder at curcumin induserer cellene å gjennomgå mitotisk katastrofe.
A) Celle syklus profiler av MiaPaCa-2-celler som ble behandlet med curcumin i 12 timer og 24 timer, og ble bestemt ved hjelp av strømningscytometri propidiumjodidfarging for DNA-innhold. Curcumin behandling betydelig økt celler i S og G
2M fasen av cellesyklusen i 12 timer. (B) Curcumin behandling induserer apoptose. MiaPaCa-2 og Pan02 celler inkubert med 30 pM av curcumin ble analysert for apoptose av caspase 3/7 aktivering. Curcumin behandling økt antall celler som gjennomgår apoptose sammenlignet med ubehandlede kontroller (* p 0,05). (Innfelt) Curcumin induserer caspase 3, en apoptose mekler. Lysater fra MiaPaCa-2 eller Pan02 celler inkubert med 30 um curcumin ble analysert ved western blotting for caspase 3 protein. Curcumin behandlede celler viser spaltet (aktivert) caspase 3 mens ubehandlede celler har ingen kløyvde caspase-3. (C) Curcumin behandling økte nivåene av cyklin B1, CDC-2 og fosforylerte sjekkpunktet kinase Chk2. Lysates fra curcumin behandlet MiaPaCa-2 celler (til venstre) og Pan02 tumorxenotransplantater (til høyre) ble analysert ved Western blotting for fosfor Chk2, og cyclin B1 og CDC-2 protein expression nivåer. Curcumin behandling phosphorylates sjekkpunkt kinaser og økte nivåer av cyclin B1 og CDC-2 i begge MiaPaCa-2 celler og Pan02 tumorxenotransplantater. (D) Curcumin behandling resulterer i kjernefysiske lokalisering av cyclin B1 og CDC-2. Immunocytochemistry av curcumin behandlet med MiaPaCa-2 celler både cyclinB1 og CDC-2 protein nivåer var hovedsakelig i kjernen forhold enn ubehandlede celler. Fosforylering av Chk2, kombinert med økt uttrykk og kjernefysisk translokasjon av cyclin B1 og CDC-2 viser mitotisk progresjon av celler.
Curcumin hemmer COX-2 og VEGF uttrykk mens indusere CUGBP2 og TIA-en
COX-2 spiller en betydelig rolle i kreftutvikling, blant annet økt invasivitet, fremming av angiogenese og motstand mot apoptose [38]. Vi bestemte derfor sitt uttrykk i tumorxenotransplantater. Sanntids PCR-analyser viste at COX-2-mRNA-ekspresjon var signifikant lavere i curcumin behandlet tumorxenografter når sammenlignet med kontrolltumorer (Fig. 4A). Dette ble ytterligere bekreftet ved western blot og immunhistokjemi analyser, hvor ble observert lavere nivåer av COX-2-protein i curcumin-behandlede vev (fig. 4B, C). Prostaglandiner og de andre tumorpromotorer er kjent for å indusere ekspresjon av VEGF i epitelceller som fremmer angiogenese og derved tumorvekst [39]. VEGF mRNA og protein ekspresjon ble analysert og ble også funnet å være signifikant lavere i curcumin behandlet tumorxenografter når sammenlignet med kontrolltumorer (fig. 4A, B). Immunhistokjemi også vist at curcumin behandling reduserte betydelig VEGF farging når sammenlignet med kontroll tumor (fig. 4C). Cyclin D1 er en cellecyklus regulatorisk protein som regulerer G1 til S-fase overgang og virker som en kofaktor for flere transkripsjonsfaktorer [40]. Cyclin D1 overekspresjon har også vært knyttet til utvikling og progresjon av kreft [34]. Curcumin behandling inhiberte cyklin D1 ekspresjon i tumorxenografter tyder på at det hemmer kreftcelle proliferasjon (fig. 4A, B). En rekke RNA-bindende proteiner er blitt identifisert til å gjenkjenne ARE-inneholdende sekvenser og regulere mRNA-stabilitet. Medlemmer av CELF (CUGBP2) og ELAV (Hur) familie av RNA bindende proteiner er involvert i ulike cellulære prosesser, inkludert mRNA spleising, redigering, stabilitet og oversettelse [23], [41]. Vi har tidligere vist at CUGBP2 induseres i celler som gjennomgår apoptose og fungerer ved å hemme COX-2-mRNA oversettelse [28], [42]. T-celle- begrenset intracellulært antigen-1 (TIA-1) er også et RNA-bindende protein som fungerer som en translatorisk demper, særlig under betingelser med stress [43]. Her observerte vi at curcumin behandling resulterte i en betydelig økning i både CUGBP2 og TIA-1 mRNA og protein ekspresjon i tumorxenografter (fig. 4A, B, D). På den annen side var det ingen signifikant endring ble observert i både Hur mRNA og proteinnivåene i respons til curcumin (Fig. 3A, B, D).
(A) Total RNA fra Pan02 tumorxenografter ble underkastet real time PCR. Curcumin behandling resulterte i redusert COX-2, VEGF og cyklin D1 mRNA-nivåer sammenlignet med kontroller. På den annen side ble CUGBP2 og TIA-1-mRNA-ekspresjon økes (* p 0,05). Data er et gjennomsnitt fra transplantater i 5 mus. (B) Western blot-analyse viste at vevet lysater fra de curcumin behandlede dyrene har signifikant lavere nivåer av COX-2, VEGF, og cyklin D1-proteiner, men økte nivåer av CUGBP2 og TIA-1-proteiner. (C) Immunhistokjemi viser at curcumin behandling signifikant redusert ekspresjon av COX-2 og VEGF. (D) Immunohistochemistry viser økt uttrykk av CUGBP2 og TIA-en i tumorxenotransplantater.
Curcumin hemmer COX-2 og VEGF mRNA oversettelse i kreft i bukspyttkjertelen celler
Tidligere studier har vist økte nivåer av COX-2 mRNA og protein uttrykk i bukspyttkjertelen adenokarsinomer [38]. Derfor vi neste fastsatte effektene av curcumin behandling på COX-2 uttrykk. Curcumin behandling betydelig økt COX-2-mRNA-nivåer i MiaPaCa-2-celler (Fig. 5A). Imidlertid, var det en signifikant reduksjon i COX-2-proteinnivåer (Fig. 5B). Lignende resultater ble observert på Pan02-celler (data ikke vist). Vi har også bestemt effekt av curcumin på VEGF genekspresjon i cellene. Curcumin behandling betydelig økt VEGF mRNA mens inhibering av proteinnivåene i MiaPaCa-2-celler (Fig. 5A, B). Lignende resultater ble observert i Pan02-celler (data ikke vist). På den annen side, curcumin betydelig økt både CUGBP2 og TIA-1 mRNA og protein ekspresjon (Fig. 5A, B). Det var imidlertid ingen signifikant endring ble observert med Hur ekspresjon (Fig. 5A, B). I tidligere studier har vi vist at CUGBP2 bindes til COX-2 3’UTR å inhibere oversettelsen [28]. Gitt at COX-2 mRNA nivåene er høyere, men protein nivåene er lavere i respons til curcumin behandling, bestemt vi om curcumin øker bindingen av CUGBP2 til COX-2 mRNA. Immunoutfelling koplet RT-PCR viste at det var en høyere grad av CUGBP2 binding til COX-2 og VEGF mRNA sammenlignet med kontroll, ubehandlede celler (fig. 5C). Videre, aktinomycin D eksperimenter demonstrerte at curcumin behandlingen resulterte i signifikant høyere nivåer av COX-2-mRNA-stabilitet, er halveringstiden øker fra 30 min i ubehandlede celler for å ~8 h (fig. 5D). Lignende resultater ble observert med VEGF; Halveringstiden av VEGF mRNA økte også fra 30 min til (Fig. 5D). 8 h i curcumin behandlede celler
(A) mRNA-ekspresjon. MiaPaCa-2-celler ble behandlet med curcumin i 2 timer. Curcumin behandling økte nivåer av COX-2, VEGF, CUGBP2 og TIA-1-mRNA. Det var ingen signifikant endring av Hur mRNA uttrykket (* p 0,05). Data fra tre uavhengige forsøk. (B) Western blot analyser viser at lysatene med curcumin behandlet MiaPaCa-2 celler har lavere nivåer av COX-2 og VEGF proteiner og økende nivåer av CUGBP2 og TIA-en. Representant for tre uavhengige eksperimenter. (C) (venstre panel), økt binding av CUGBP2 binding til COX-2 eller VEGF mRNA følgende curcumin behandling. Hele celleekstrakt (T) fra curcumin-behandlede celler ble immunopresipitert med anti-CUGBP2 antistoff, og RNA fra immunopresipitatene (P) og supernatant (S) ble isolert og underkastet RT-PCR for COX-2 og VEGF mRNA. Dataene viser økt COX-2 eller VEGF mRNA i pelleten av curcumin-behandlede celler. (Høyre panel) Data ble kvantifisert og det var en klar økning i COX-2 og VEGF mRNA i pelleten av curcumin behandlede celler. (D) MiaPaCa-2-celler ble behandlet med curcumin i 2 timer og stabiliteten av COX-2 og VEGF-mRNA ble bestemt etter tilsetning av actinomycin D (sluttkonsentrasjon: 10 ug /ml). Curcumin øker halveringstiden av COX-2 mRNA fra 30 minutter til 8 timer. Tilsvarende curcumin økte halveringstiden av VEGF mRNA fra 30 minutter til 8 timer. Dataene viser curcumin behandling betydelig økt stabilitet av COX-2 eller VEGF mRNA.
Curcumin mediert COX-2 og VEGF mRNA stabilitet krever CUGBP2
Vi har tidligere vist at CUGBP2 binding til COX -2 3’UTR øker stabiliteten av COX-2-mRNA, mens inhibering av oversettelsen [28]. Vi har fastslått derfor effekten av CUGBP2 knockdown på curcumin-mediert oversettelse undertrykkelse av COX-2 og VEGF mRNA. Real Time PCR-målinger viste at curcumin behandlingen resulterte i signifikant høyere nivåer av COX-2 og VEGF mRNA, som ble redusert til kontrollnivåer når CUGBP2 ekspresjon ble knockdown (Fig. 6A). Vi neste fastslått om det var noen effekt på protein uttrykk. Curcumin behandling signifikant redusert nivåene av både COX-2 og VEGF-protein. Men når CUGBP2 ble slått ned med en bestemt siRNA, COX-2 og VEGF proteiner nivåer ble ikke påvirket av curcumin behandling (Fig. 6B). Vi har også bestemt om curcumin-mediert effekter på COX-2 og VEGF mRNA stabilitet påvirkes av CUGBP2 knockdown. Mens økt curcumin behandling stabiliteten av COX-2 og VEGF mRNA, var det en mindre effekt når CUGBP2 ble også slått ned ved hjelp av spesifikke siRNA. Halveringstiden av COX-2-mRNA ble øket fra 30 minutter til ~8 time etter curcumin behandling, som ble redusert til ~ 2 h når CUGBP2 ekspresjon ble inhibert (Fig. 6C). Lignende resultater ble oppnådd for VEGF hvor knockdown av CUGBP2 redusert curcumin-mediert stabilitet fra 8 timer til 1 time (fig. 6C). Disse data tyder på at curcumin mediert økning av COX-2 og VEGF mRNA stabilitet skjer dels ved CUGBP2.
(A) CUGBP2 er nødvendig for curcumin-indusert COX-2 og VEGF mRNA-nivåer.
