Abstract
Exosomes er nanometer store ekstracellulære vesikler som antas å fungere som inter kommunikatører. Her rapporterer vi at exosomes er i stand til å endre strålingen responsen i hode og nakke kreft cellelinjer BHY og Fadu. Exosomes ble isolert fra det kondisjonerte medium av utstrålte, så vel som ikke-bestrålte hode- og nakkekreftceller ved seriesentrifugering. Kvantifisering ved hjelp NanoSight teknologi indikerte en økt exosome utgivelse fra bestrålt sammenlignet med ikke-bestrålt celler 24 timer etter behandling. For å teste om de frigitte exosomes påvirker strålingsresponsen til andre celler i exosomes ble overført til ikke-bestrålte og bestrålte mottakercellene. Vi fant en forbedret opptak av exosomes isolert fra både bestrålte og ikke-bestrålte celler ved bestrålte mottakerceller sammenlignet med ikke-bestrålt mottakercellene. Funksjonelle analyser av exosome overføring indikerte at alle exosomes (fra ikke-bestrålte og bestrålte donorceller) øke spredning av ikke-bestrålte mottakercellene og overlevelse av bestrålte mottakercellene. Overlevelsesbringende effekt er mer uttalt når exosomes isolert fra bestrålt i forhold til ikke-bestrålte donorceller blir overført. En mulig mekanisme for den økede overlevelse etter bestråling kan være økningen i DNA dobbel tråd pause reparasjon overvåket ved 6, 8 og 10 timer etter tilførsel av exosomes isolert fra bestrålte celler. Dette er opphevet ved destabilisering av exosomes. Våre resultater viser at stråling påvirker både overflod og handling av exosomes på mottakercellene. Exosomes overføre prosurvival effekter ved å fremme spredning og radioresistance av hode og nakke kreft celler. Til sammen viser denne studien en funksjonell rolle exosomes i responsen av kreftceller til stråling innenfor et terapeutisk doseringsområde og oppfordrer at exosomes er nyttige studieobjekter for en bedre forståelse av svulst stråling respons.
Citation : Mutschelknaus L, Peters C, Winkler K, Yentrapalli R, Heider T, Atkinson MJ, et al. (2016) Exosomes Avledet fra Squamous Head and Neck Cancer fremme celle overlevelse etter ioniserende stråling. PLoS ONE 11 (3): e0152213. doi: 10,1371 /journal.pone.0152213
Redaktør: Pierre Busson, Gustave Roussy, FRANCE
mottatt: 16 november 2015; Godkjent: 10 mars 2016; Publisert: 23 mars 2016
Copyright: © 2016 Mutschelknaus et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
finansiering:.. forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Forkortelser: DMEM, Dulbecco modifiserte Eagles medium; DSB, dobbel tråd pause; EXO, exosomes; HNSCC, hode og nakke plateepitelkarsinom
1 Innledning
Exosomes er en underklasse av ekstracellulære mikrovesikler som skilles ut av de fleste celletyper, inkludert kreftceller. De er endocytic opprinnelse og slippes ut i ekstracellulære miljøet gjennom fusjon av cytosoliske muitivesikulære organer med plasmamembranen. Exosome last inkluderer et bredt spekter av proteiner, mRNA, microRNAs og lange ikke-kodende RNA [1-4]. Funksjonelle studier viser at exosomes fungere som ekstracellulære kommunikatører ved å levere sitt innhold til et mål celle via membranfusjon, eller alternativt ved endocytose [5]. I 2007 Valadi et al. vist at exosomes er i stand til å shuttle RNA mellom cellene. Overføringen av murine mast celle exosomes til humane mastceller resultater i oversettelsen av murine mRNA, som beviser at de leverte RNA-molekyler er funksjonelle i mottakercellene [3].
Absorbert exosomes er i stand til å endre biologiske funksjoner av mottakercellene, hvor de kan gi en ny fenotype, for eksempel metastaser [6], angiogenese [7] og migrasjon [8]. Den exosomal Sammensetningen av den ekstracellulære miljø er modifisert av cellulære stressfaktorer, noe som fører til endret, for det meste beskyttende effekter på mottakercellene. Dermed exosomes avledet fra celler som utsettes for oksidativt stress gi motstand mot oksidativt stress til ikke-eksponerte mottakercellene [9]. I brystkreftcellelinjer, hypoksi øker også utgivelsen av exosomes bærer økte mengder MIR-210. Dette forbedrer overlevelse og invasjonen av mottakerens celler [10]. I sammenheng med ioniserende stråling exosomes avledet fra bestrålte gliomceller øke migreringen av mottakeren glioma-celler [11]. Exosomes kan dermed påvirke kommunikasjon av strålingseffekter mellom ikke-målrettede og målrettede celler (tilskuer-lignende signal), for eksempel genomisk ustabilitet [12-14].
plateepitelkarsinom er vanligste kreftformen i hode og nakkeregionen . Radiochemotherapy eller strålebehandling er den vanligste behandlingen for HNSCC (hode og hals plateepitelkarsinom) pasienter med lokalavansert og unresectable svulster [15]. Men terapi motstand og tumorresidiv utgjøre en stor utfordring og deres mekanismer er ikke godt forstått. Siden exosomes dukker aktører i legemiddelresistens vi tar sikte på å vurdere om exosomes kan påvirke strålingsresponsen til hode og nakke plateepitel karsinom celler [16-19]. For dette formålet vi bestemt virkningen av ioniserende stråling innenfor et moderat doseområde på exosome frigjøring og opptak i HNSCC. For å analysere en antatt funksjonell rolle exosomes tilsatt vi exosomes isolert fra differensielt bestrålte donorceller, og analysert resulterende virkning på proliferasjon, overlevelse og DNA-reparasjon av mottaker HNSCC etter en behandling med ioniserende stråling.
2 Materialer og metoder
2,1 cellekultur og bestrålings
hode- og halskreft cellelinjer BHY (DSMZ nr .: ACC 404) og Fadu (ATCC
®HTB43
™) ble inkubert ved 37 ° C og en relativ luftfuktighet på 95%. BHY-celler ble dyrket i høy glukose DMEM kulturmedium (Dulbeccos modifiserte Eagles medium, Gibco) pluss 10% føtalt kalveserum (Bio 0,05].
2.3 Elektronmikroskopi av exosomes
ufortynnet prøve (isolert fra 3 ml klimaanlegg medium) ble absorbert inn glød utladet karbon belagt nett (G2400C fra Plano) i 2 minutter. Oppløsningen ble blottet over og negativt farget med 4% ammoniummolybdat (Sigma-Aldrich) løsning i 30 sekunder. Mikrobilder ble registrert med en Jeol JEM 100CX elektronmikroskop på 100 kV på Kodak SO163 film. Negativer var digitalisert med et Hasselblad Flextight X5 skanner på 3000 dpi, noe som resulterer i en pikselstørrelse på 0,25 nm /px. For visualisering bilder ble binned til en nm /px.
2,4 Exosome kvantifisering og bestemmelse av exosomal størrelsesfordeling
Exosome mengde og størrelsesfordeling ble analysert ved hjelp av NanoSight LM10 (Malvern) mikroskop. Exosome preparater (isolert fra 5 ml kondisjonert medium) ble fortynnet 1: 100 til 1: 2000 med H
2O for å oppnå 15 til 50 partikler per ramme for sporing. Prøvene ble hver analysert tre ganger i 30 sekunder.
2,5 Exosome opptak
Exosomes (isolert fra 15 ml kondisjonert medium) ble farget med grønn fluorescerende fargestoff PKH67 (MINI67-1KT, Sigma-Aldrich Chemie). For dette formål 50 ul av exosome oppløsning ble resuspendert i 250 pl av fortynningsmidlet C pluss 1,5 ul av fargestoff (1 mM). Etter 10 minutters inkubasjon ved romtemperatur overdreven fargestoff ble fjernet ved hjelp av Exosome sentrifugekolonner (Invitrogen) i henhold til produsentens protokoll. Som styre en lik mengde fargestoff i fortynningsmiddel C pluss 50 mL PBS ble behandlet likt exosomes (exosome negativ kontroll, -ekso).
For å måle opptaket av exosomes 50.000 celler i 200 mL medium ble sådd i 48 brønners plater. Etter 24 timer like mengder PKH67-farget exosomes ble lagt til bestrålte og ikke-bestrålte mottakercellene. Etter ytterligere 3, 6, 8, 10 og 24 timer ble cellene vasket tre ganger med PBS, trypsinisert og resuspendert i 500 ul PBS. Opptaket ble målt på et FACSCAN LSRII (Becton-Dickinson, eksitasjon = 490 nm, emisjon = 502 nm). For fluorescens mikroskopi ble cellene vasket tre ganger med PBS fiksert med 4% paraformaldehyd vasket på ny med PBS og dekket med Vectashield
® inkludert Hoechst 33342 for kjerner farging. Bildene ble tatt med fluorescens mikroskop BZ-9000 fra Keyence.
2,6 Inkubasjon av mottakercellene med exosomes
For å bestemme den biologiske aktiviteten av exosomes (spredning, overlevelse og DSB reparasjon) vi inkuberes den mottakercellene med exosomes isolert fra identiske numre av donorceller. De exosomes ble gjenfunnet i volum for å gi en tredobling konsentrasjon av exosomes i forhold til de opprinnelige betingelsene.
2,7 spredning og klonogene overlevelse etter overføring av exosomes
Effekten av exosomes på spredning var fastsatt med Presto blå
™ celleviabilitet Reagens Protocol (Life Technologies). 500 eller 1500 celler pr brønn ble sådd på 96 brønners plater i 100 ul exosome fritt medium. Etter 24 timer exosomes (isolert fra 300 ul kondisjonert medium) ble tilsatt, og cellene ble inkubert i ytterligere 72 timer. For måling av celleproliferasjon 10 pl Presto blå-reagens ble tilsatt per brønn, inkubert i 40 minutter ved 37 ° C og fluorescens ble bestemt (Excitation 560 nm; Emisjon: 590 nm). På en plateavleser (Tecan)
For å overleve besluttsomhet, ble en klonogene overlevelse analyse utført. Celler ble sådd ut i 12 brønners plater og simulert behandlet eller bestrålt med 1, 2, 3, 6 og 10 Gy. Umiddelbart etterpå, exosomes (fra 2,5 ml kondisjonert medium) ble overført på cellene som deretter ble inkubert i 5 dager for å tillate kolonidannelse fra enkeltceller. Deretter ble cellene vasket to ganger med PBS, fiksert med 100% etanol (30 minutter) og til slutt farget med Giemsa-løsning (Boehringer Ingelheim, 1:20 i PBS, 30 minutter). Overdreven fargestoff ble fjernet og kolonier med mer enn 30 celler ble talt opp.
2.8 Påvisning av DNA dobbelttrådbrudd etter overføring av exosomes
1000 til 6000 celler ble sådd i 96 brønners plater. Etter å ha nådd en sammenfletting av 50-70% ble mediet erstattet med 100 ul av exosome-fritt medium ble cellene straks bestrålt med 2 Gy og exosomes isolert fra 300 ul kondisjonert medium ble tilsatt. Etter en inkubasjonstid på 1, 6, 8 eller 10 timer ved 37 ° C antall DNA DSB ble bestemt ved 53BP1 farging. En fiksering takt med 4% paraformaldehyd ble etterfulgt av en permeabiliseringen med 0,2% Triton X-100. Deretter ble cellene blokkert med PBS + (1% bovint serumalbumin, 0,15% glysin) i 60 minutter og inkubert over natten med det primære antistoff 53BP1 (fortynning 1: 500, NB100-305, Novus Biologicals) ved 4 ° C. På den påfølgende dag ble cellene inkubert med sekundære antistoffer geit anti-kanin Alexa-488 (fortynning 1: 200, A-11034, Life Technologies) og sau anti-mus Cy-3 (fortynning 1: 500, 016-160- 084, Jackson Lab) i 1 time. Kjerner ble farget med Hoechst 33342 (Sigma-Aldrich Chemie) og cellene ble dekket med Vectashield
® monteringsmedium (Linaris). Analysene ble utført med fluorescens mikroskop Biorevo BZ-9000 (Keyence). For alle eksperimentelle forhold eksponeringstidene ble vedlikeholdt og foci antall 60 celler per tilstand ble bestemt.
2.9 Validering av exosomal stabilitet
For å teste stabiliteten, exosomes ble inkubert i 30 minutter ved 37 ° C, enten med RNase A fra Qiagen (5 ug /ul eller 400 ug /ul) eller en detergent-peptidase-blanding (0,2% Triton X-100 /Trypsin, 2: 1). Deretter exosomes ble benyttet i DNA-reparasjon assays som beskrevet ovenfor.
2,10 Proteinanalyse
Cellene ble lysert i lyseringsbuffer II (25 mM Tris pH 7,5, 120 mM NaCl, 1% Triton X -100, 1% PSMF, 1 mM november, 1 mM Leupeptin) i 1 time på is. Etter sentrifugering ble proteinkonsentrasjonen av de oppsamlede supernatantene ble bestemt ved anvendelse av BCA-analyse ved bruk av bovint serumalbumin som standard (Pierce
™ BCA Protein Assay Kit, Thermo Fisher Scientific).
Western blot-analyse ble utført i henhold til standard prosedyrer ved anvendelse av 10 ug av celleprotein og et volum på 12 pl exosome lysat som svarer til den exosome beløp i 30 ml kondisjonert medium for SDS-polyakrylamid gelelektroforese. Separerte proteiner ble blottet på nitrocellulosemembraner og inkubert med primære antistoffer rettet mot CD63 (sc15363, Santacruz), HSP70 (MA3-007, Affinity BioReagents), aktin (SAB1305567, Sigma-Aldrich Chemie) og calnexin (sc11397, Santacruz). Pepperrot peroksidase-konjugerte anti-kanin og anti-mus antistoffer (sc2004 og sc2005, Santacruz) ble brukt til å påvise antigen antistoff binding via kemoluminescens (Amersham ECL deteksjon kit, GE Healthcare).
2.11 Statistisk analyse
data representerer gjennomsnittet av uavhengige, biologiske replikater ± standardavvik (SD). Betydningen av n-fold endringer ble beregnet ved hjelp av paret t-test. Å sammenligne hjelp av tre eller flere variabler tosidig ANOVA ble brukt. For all statistisk analyse p 0,05 ble ansett som statistisk signifikant og p 0,01 og p 0.001 ble ansett som svært viktig.
3 resultater
3.1 Stråling øker exosome utgivelsen fra hode og nakke kreft celler
Exosomes utgitt av hode og nakke tumorcellelinje BHY ble isolert av differensialultrasentrifugering. For å validere isolasjonsmetoden exosomes ble visualisert ved transmisjonselektronmikroskopi. Den representative mikrograf viste runde, koppformede strukturer med en diameter på 30-100 nm (figur 1B). For ytterligere bekreftelse av identiteten exosome den exosomal markørproteiner HSP70, aktin og CD63 ble påvist ved western blot i BHY exosomes så vel som i lysater av BHY celler. Ingen påviselige proteiner var til stede i ubrukt kulturmedium, i ubrukt medium supplert med exosome-utarmet føtalt kalveserum eller i supernatanten av kondisjonert medium etter ultrasentrifugering. Fraværet av calnexin i exosome lysatene viser at exosome forberedelsene ikke var forurenset med cellemembraner avledet fra apoptotiske legemer eller døde celler (fig 1c). Videre størrelsesfordeling og antall isolerte exosomes ble kvantifisert i seks uavhengige preparater for hver behandling ved hjelp av NanoSight teknologi. Denne tilnærmingen bekreftet en homogen exosome preparat med en gjennomsnittlig størrelse på 111-124 nm (n = 6) for de exosomes isolert fra enten bestrålte og ikke-bestrålte celler (figur 1D). Den NanoSight måling viste også en økning i antall exosomes gjenvunnet fra bestrålte (EXO 3 Gy, EXO 6 Gy) sammenlignet med ikke-bestrålt (exo 0 Gy) celler 24 timer etter bestråling (figur 1E).
3.2 Stråling øker opptaket av exosomes av mottakercellene
Vi sammenlignet opptak kinetikk exosomes isolert fra bestrålte og ikke-bestrålte donorceller samt deres opptak av bestrålt og ikke-bestrålt mottakercellene. Derfor celler ble ko-dyrket med PKH67-merkede exosomes og exosome opptak ble fulgt ved fluorescens mikroskopi og strømningscytometri.
fluorescens-mikroskopi viste en tidsavhengig opptak av exosomes. Etter 3 timer klynger av merkede exosomes begynte å samle seg langs cellemembraner. Økende antall exosomes festet over tid og forårsaket diffuse cytoplasma merking, noe som innebar en internalisering og oppløsningen av exosomes (fig 2a).
PKH67-merket exosomes isolert fra bestrålte og ikke-bestrålte BHY cellene ble dyrket sammen med BHY celler. (A) Representative fluorescens mikroskopi bilder for exosome opptak etter tre, seks og 24 timer inkubasjon. Exosomes var farget i grønt og kjerner ble farget blå med Hoechst 33342. (B) Opptak av exosomes isolert fra 6 Gy-bestrålt (EXO 6 Gy) og ikke-bestrålt BHY celler (EXO 0 Gy) etter 3, 6, 8, 10 og 24 timers inkubasjon. Bety fluorescens av ubehandlede celler og celler etter inkubasjon med farget exosomes eller en exosome-negativ kontroll (-ekso) får (n = 3). (C) Avhengighet av exosomal opptak ble bestemt etter 24 timer ved hjelp av en seriell fortynning av en exosome preparat. (D) opptak av merkede exosomes av 0, 2 og 4 Gy-bestrålte mottakercellene etter 24 timer. I alle forsøkene et minimum på 10.000 celler ble analysert for hver prøve [n ≥ 3, ± SD, p-verdi 0,05].
Vi har også kvantifisert exosome opptak av flowcytometri. De oppnådde resultater bekrefter de tidligere observasjoner mikroskopi og viste at opptaket av exosomes var tidsavhengig (figur 2B) og lineært med den ekstra antall exosomes (figur 2C). Effekten av stråling på opptaket av exosomes av mottakercellene ble undersøkt ved å sammenligne opptak kinetikken til exosomes isolert fra ikke-bestrålte celler til disse exosomes isolert fra bestrålte celler. Figur 2B viser at det var ingen signifikant forskjell i kinetikken mellom opptaket av exosomes avledet fra bestrålte og ikke-bestrålte donorceller. Det var imidlertid en doseavhengig økning av opptaket av exosomes av bestrålte mottakercellene sammenlignet med det ved hjelp av ikke-bestrålte celler. Således exosomal opptaket ble signifikant øket 1,3 ganger etter exosomes avledet fra ikke-bestrålte celler og 1,4 ganger for exosomes fra bestrålte donorceller hvis de ble inkubert i 24 timer med bestrålte mottakercellene (4 Gy) i forhold til opptak av ikke-bestrålt mottakercellene (figur 2D). Til sammen disse resultatene viste at exosome opptak av mottakercellene var på tide og konsentrasjonsavhengig og at bestråling av mottakercellene økt sin evne til å ta opp exosomes.
3,3 Exosomes fra enten ikke-bestrålt eller bestrålte celler øke overlevelsen av mottakeren celler
Vi var interessert om exosomes fra bestrålte celler viser samme biologiske effekter i mottakercellene som exosomes fra ikke-bestrålt celler. For å løse dette spørsmålet vi tilsatt exosomes isolert fra donorceller bestrålt med 0, 3, 6 og 9 Gy til ikke-bestrålte mottakercellene og målt celleproliferasjon. BHY celler behandlet med exosomes viste større spredning enn celler dyrket uten exosomes (fig 3A). Følgelig plating effektivitet i kolonidannelsesbestemmelsen er større for celler dyrket med exosomes enn for celler dyrket uten exosomes (figur 3B). Imidlertid, ingen signifikant forskjell ble funnet mellom behandlingene med exosomes isolert fra 0, 3, 6 eller 9 Gy-bestrålte celler (figur 3A).
(A) proliferasjon av celler dyrket i 3 dager i medium inneholdende exosomes isolerte fra bestrålte eller ikke-bestrålte celler. Som en kontroll ble en lik mengde av PBS uten exosomes ble tilsatt til mottakercellene. (B) Plating effektivitet av celler dyrket i 5 dager i medium inneholdende exosomes isolert fra bestrålte og ikke-bestrålte celler. Som en kontroll ble en lik mengde av PBS uten exosomes ble tilsatt til mottakercellene. (C) klonogene overlevelses av BHY celler ko-dyrket med exosomes isolert fra bestrålte eller ikke-bestrålte celler og kontrollceller (BHY + PBS) ble inkubert i 5 dager etter bestråling med de angitte doser [n = 3, ± SD, p- verdi: * hvis p 0,05, ** hvis p 0,01 og **** hvis p 0,0001].
Neste påvirkning av exosomes på stråling følsomheten BHY celler ble analysert. Celler ble inkubert med exosomes, deretter bestrålt med doser på opptil 10 Gy og inkubert i 5 dager. Deretter ble den klonogene overlevelses bestemt. I samsvar med den observerte spredning stimulerende effekt av exosomes på ikke-bestrålte mottakercellene (figur 3A og 3B) overlevelse av bestrålte mottakercellene ble økt ved tilsetning av exosomes (figur 3C og S3 Table). Her blir exosomes isolert fra cellene bestrålt med 6 Gy indusert en større grad av stråling motstand enn exosomes fra ikke-bestrålte celler (figur 3B). Disse resultatene tyder på at exosomes fra BHY celler generelt støtte spredning og stråling motstand.
3,4 Exosomes påvirke utbredelsen av DNA dobbel tråd pause reparasjon
Siden Dutta et al. viste at exosomes frigjøres fra brystcancerceller kan endre fosforylering status av DNA-skade reparasjons proteiner [21], analyserte vi frekvensen av DNA dobbel tråd pause (DSB) reparasjon i bestrålte mottakercellene for å belyse mekanismen for den økte overlevelse av cellene etter tilsetning av exosomes. Exosomes fra bestrålte og ikke-bestrålte BHY celler ble overført til bestrålt BHY celler (2 Gy) og antall av DNA DSB foci ble analysert etter 1 og 6 timer. Kvantifisering av DNA DSB reparasjon foci 1 time etter bestråling viste ingen forskjell i antallet induserte foci mellom kontrollceller og celler inkubert med exosomes enten fra ikke-bestrålt eller fra bestrålte donorceller (figur 4A). Seks timer etter behandling fant vi redusert antall reparasjons foci i BHY celler inkubert med exosomes isolert 24 timer etter bestråling av BHY celler sammenlignet med celler inkubert med exosomes fra ikke-bestrålt BHY celler, noe som tyder på en raskere hastighet på reparasjon (fig 4B og 4C). Lignende effekter ble sett etter 6 timer for exosomes isolert 48 timer etter bestråling (fig 4C). Også analyse av fordelingen av foci tall per-celler etter inkubasjon med exosomes reflektert den økte reparasjon i celler behandlet med exosomes fra bestrålte donorceller. Spesielt antall celler med høy brennpunktene nummer ( 12) er redusert etter inkubasjon med EXO 6 Gy (S1A Fig). Videre de observerte effektene var også til stede 8 og 10 timer etter bestråling (S1B fig). Hvis cellene ble pre-inkubert i 24 timer med de exosomes, deretter bestrålt med 2 Gy og fast etter 6 timer, desto raskere reparasjon indusert av bestrålte exosomes fra donorceller var fremdeles observeres (fig S1B). En tilsetning av exosomes fra ikke-bestrålte BHY celler så ut til å øke noe den foci antall i forhold til kontrollen (PBS) i mottakercellene 6 timer etter bestråling (figur 4B og 4C). Denne effekten var ikke til stede etter pre-inkubering av cellene med exosomes og påfølgende bestråling (S1C figur).
(A) Antall 53BP1 foci i BHY cellene 1 time etter bestråling med 0 og 2 Gy og overføring av BHY exosomes isolert 24 timer etter bestråling med 0 og 6 Gy [n = 5]. (B) Representative bilder av 53BP1 foci i BHY celler 6 timer etter 2 Gy og overføring av BHY exosomes isolert 24 timer etter bestråling med 0, 3, 6 eller 9 Gy (53BP1 foci grønn, atomkjerner blå). (C) Antall 53BP1 foci i BHY cellene 6 timer etter 2 Gy og overføring av BHY exosomes isolert 24 og 48 timer etter bestråling [n
1 (kontroll; ekso 0 Gy 24 timer; EXO 6 Gy 24 t) = 6 , n
2 (EXO 0 Gy 48 timer, EXO 3 Gy, Exo 6 Gy 48 timer, Exo 9 Gy) = 3]. (D) Antall 53BP1 foci i Fadu celler 6 timer etter 2 Gy og overføring av Fadu exosomes [n = 3]. (E) Antall 53BP1 foci i Fadu celler 6 timer etter 2 Gy og overføring av BHY exosomes [n = 3]. (F) Antall 53BP1 i BHY celler etter 2 Gy og overføring av destabilisert BHY exosomes. Exosomes fra BHY celler isolert 24 timer etter bestråling med 0 og 6 Gy ble behandlet med RNase A eller en blanding av Triton og Trypsin [n
1 (kontroll; intakt) = 6; n
2 (RNase A 5 ug /ul) = 2; n
3 (RNase A 400 ug /ul Triton + Trypsin) = 3]. For alle forsøkene på ± SD ble vist og p-verdier beregnet på kontroll ble ansett som vesentlig dersom * p 0,05 og svært signifikant ** hvis p 0,01, mens
▲ p 0,05 og
▲▲ p 0,01 indikerer signifikante forskjeller til Exo 0 Gy.
Exosome stimulert DNA-reparasjon ble bekreftet ved hjelp av en andre hode- og halskreft cellelinje Fadu. Igjen inkubering av Fadu mottakercellene med exosomes isolert fra bestrålte Fadu celler redusert mengden av DNA-reparasjon foci (figur 4D). For å teste celletype spesifisitet exosome-induserte effekter vi lagt exosomes isolert fra BHY celler til bestrålt Fadu celler. Exosomes fra BHY cellene er i stand til å utføre tilsvarende radiobeskyttende effekt på Fadu celler (figur 4E).
Til slutt vi destabilisert exosomes gjennom høy konsentrasjon RNase En behandling eller ved å legge til et vaskemiddel-peptidase-blanding. Destabilisert 0 Gy og 6 Gy exosomes ikke var i stand til å endre antall reparasjon foci i forhold til ubehandlede exosomes indikerer et tap av funksjon på grunn av behandlingen (Fig 4F). Sammenfatter disse resultatene, exosomes påvirke reparasjon av DNA DSB på en doseavhengig, celletype uspesifikk måte.
4 Diskusjon
Cell kommunikasjon via exosomes er i stand til å påvirke skjebnen til cellene i stress-situasjoner [9, 10, 22, 23]. Vi viser nå et bidrag på exosomes til økt overlevelse av hode- og nakkekreftceller etter bestråling. Exosomes utskilt innen 24 timer etter bestråling ha en innvirkning på spredning, celleoverlevelse, og DNA-reparasjon effektivitet. Som en konsekvens, kan cellekommunikasjon via exosomes i løpet av anti-tumor stråling fremme motstand av kreftceller og forbedre overlevelse av hode- og nakkekreftceller både i og utenfor strålefeltet. Derfor vil en bedre forståelse av de underliggende mekanismene for exosomes i strålerespons være nødvendig for å forbedre strategier for strålebehandling.
4,1 Exosomes øke overlevelse og spredning av hode og nakke plateepitel karsinom celler
Vi viser at exosomes påvirke skjebnen til bestrålt og ikke-bestrålt BHY og Fadu hode- og nakkekreftceller. Exosomes øke overlevelse av bestrålte mottakercellene. De prosurvival effekter av exosomes fra bestrålte donorceller var mer tydelige enn de indusert av exosomes fra ikke-bestrålte donorceller. I samsvar Hazawa et al. viste at overføringen av exosomes fra ikke-bestrålte celler til 8 Gy-bestrålte stamceller fører til økt overlevelse [24].
Tilsvarende exosomes indusere proliferasjon i ikke-bestrålte mottakercellene. Denne virkning er uavhengig av strålings-behandling av de exosome donorcellene. I nyere litteratur effektene av exosomes på spredning drøftes kontroversielt. I likhet med våre resultater, exosomes avledet fra blæren kreftceller, kronisk myelogen leukemi celler eller mastceller øke spredning av mottakercellene etter exosome overføring [8, 25-27]. Imidlertid jella et al. viste redusert levedyktighet av keratinocytter etter inkubasjon i exosome holdig dyrkingsmedium [14].
4,2 Exosomes påvirke DNA dobbel tråd pause reparasjon etter ioniserende stråling i hode og nakke plateepitel karsinom celler
hypotese om at exosomes kan fremme overlevelse ved å utløse DNA-reparasjon som det ble vist at fosforylering av kritiske DNA-reparasjons proteiner er påvirket av exosomes [21]. Våre resultater viste at DNA-reparasjon ikke ble påvirket av exosomes på et tidlig tidspunkt etter bestråling (1 time), mens økt DNA-reparasjon ble funnet etter inkubering med exosomes fra bestrålte donorceller ved senere tidspunkter (6-10 h). Som den økte DNA-reparasjon er like detektert for en 6 timers inkubering ved hvilken bare et begrenset antall exosomes er knyttet til cellene, og etter en pre-inkubering med exosomes antar vi at en liten mengde av exosomes er tilstrekkelig til å indusere de observerte effekter. Forskjellige aspekter ved virkningen av exosomes på DNA-reparasjon ble analysert i to nyere studier. Viste det ble observert en øket antall DNA-reparasjons foci etter overføring av exosomes fra ikke-bestrålte brystcancerceller til normale humane primære mammary epitelceller [21]. Ved hjelp av kometen-analysen, Al-Mayah et al. På den annen side viste at exosomes øke DNA-skade av bryst epiteliale kreftceller [12].
