Abstract
Bakgrunn
De doseavhengige toksisitet av doxorubicin (DOX) begrenser dens kliniske applikasjoner, spesielt i resistente kreftformer, som leverkreft. I denne studien undersøkte vi rollen som quercetin på antitumor effekter av DOX på leveren kreft celler og dens evne til å gi beskyttelse mot DOX-mediert leverskade hos mus.
Metode og resultater
MTT og Annexin V /PI farging analysen viste at quercetin selektivt sensibilisert DOX-indusert cytotoksisitet mot leverkreftceller samtidig beskytte normale leverceller. Økningen i DOX-mediert apoptose i hepatomceller av quercetin var p53-avhengig og forekom ved downregulating Bcl-xl uttrykk. Z-VAD-FMK (kaspase-inhibitor), pifithrin-α (p53-inhibitor), eller overuttrykt Bcl-xl minsket effekten av quercetin på DOX-mediert apoptose. Den kombinerte behandling av quercetin og DOX signifikant reduksjon i vekst av leverkrefttransplantater i mus. Videre redusert quercetin serumnivåene av ALAT og ASAT som ble øket i DOX-behandlede mus. Quercetin også reversert DOX-induserte patologiske forandringer i mus lever.
Konklusjon og betydning
Disse resultatene indikerer at quercetin forsterkes antitumor effektene av DOX på leveren kreft celler samtidig beskytte normale leverceller. Derfor kan utviklingen av quercetin være gunstig i en kombinert behandling med DOX for økt terapeutisk effekt mot leverkreft
Citation. Wang G, Zhang J, Liu L, Sharma S, Dong Q (2012) quercetin forsterker doxorubicin mediert Antitumor effekter mot leverkreft gjennom p53 /BCL-XL. PLoS ONE 7 (12): e51764. doi: 10,1371 /journal.pone.0051764
Redaktør: Ashraf B. Abdel-Naim, Ain Shams universitet, Egypt
mottatt: 25. juli 2012; Godkjent: 07.11.2012; Publisert: 11.12.2012
Copyright: © 2012 Wang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Natural Science Foundation National of China (No .: 30400521), Science Technology Department of Zhejiang-provinsen (No .: 2012R10047 til QD og No .: 2012C33116 til GW) og undervisningsdepartementet i Zhejiang-provinsen (No .: Y201224108). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
leverkreft (HCC) er en av de vanligste typene av leverkreft og den fjerde største årsaken til kreft dødsfall på verdensbasis [1]. Mangelen av biomarkører som gjenkjenner kirurgisk resectable tidlig stadium av en sykdom forårsaket manifestasjonen av fremskredne stadier i de fleste pasienter når kirurgisk reseksjon ikke lenger er mulig [2]. Derfor kjemoterapi forblir levedyktig alternativ til behandling av ubrukelige HCC pasienter.
I løpet av årene, doxorubicin (DOX) er blitt en rutinemessig og utbredt middel i HCC behandling. Undersøkelser har imidlertid vist at noen kreftceller, inkludert hepatoma, er resistente overfor de apoptotiske virkninger av DOX [3]. Videre er DOX-kjemoterapi assosiert med alvorlige bivirkninger som til ikke-tumorøse vev, slik som hjerte, lever, nyre og, i stor grad begrenser dens kliniske anvendelser [4], [5]. Benjamin beskrevet åtte pasienter med nedsatt leverfunksjon som utviklet alvorlig pancytopeni og mukositt mens du mottar DOX, spørre eksperter for å redusere dosen på grunn av endret leverfunksjon [6]. Dermed er forbedrede terapeutiske regimer som potensierer DOX effekter, noe som gjør det mulig å redusere dosen og beskyttelse av ikke-tumorøse vev, for å forbedre behandlingen av leverkreftpasienter.
Mekanismene for DOX-mediert cytotoksisitet i kreftceller og normale vev er forskjellig [7]. DOX toksisitet i kreftceller skjer primært gjennom DNA-innskyting og skader [8], mens DOX-kardiotoksisitet eller levertoksisitet forekommer hovedsakelig ved generering av frie oksygenradikaler, som hemmes av fri radikalutvaskere [9]. Denne forskjellen i DOX-formidlet toksisitet hos kreft og normale celler kan undersøkes for å forbedre antitumor virkningene av DOX med kombinatoriske fremgangsmåter som gjør det mulig å redusere dosen av DOX samtidig som de beskytter normale celler.
quercetin (3, 3 «, 4 «, 5, 7-Pentahydroxyflavone), et viktig kosttilskudd flavonoid stede i flere frukter og grønnsaker, utstillinger antioksidant, anti-inflammatorisk og kreft egenskaper [10]. Quercetin har fått økende oppmerksomhet som en pro-apoptotiske flavonoid med bestemt og nesten eksklusive aktivitet på kreftceller i stedet for vanlig, ikke-transformerte celler [11], [12]. Imidlertid er mekanismene som quercetin utøver sin anti-proliferative og apoptotiske aktivitet forblir uklar. Flere
in vitro Hotell og
in vivo
studier har evaluert quercetin kombinert med DOX for brystkreft og leukemi behandlinger, avslører synergieffekter [13] – [15]. I murine brystcancermodeller, en kombinasjon av diett quercetin og intratumoral injeksjon av DOX reduserer tumorvolumet og metastatisk spredning [13]. Selv quercetin reverserer DOX-indusert multiresistens i humane myelogen leukemi celler [14], [16], ingen studier på effekten av quercetin med DOX mot leverkreft har blitt rapportert ennå.
Antioksidanter ha gunstige effekter mot DOX -indusert toksisitet i mus og rotter [17]. Quercetin har en beskyttende effekt mot DOX-kardiotoksisitet hos mus, men de mekanismer er uklare [18]. Quercetin viser også en beskyttende effekt mot AFB1-mediert leverskader
in vivo
ved å fremme antioksidative forsvarssystemer og hemme lipidperoksidasjon [19]. Videre reduserer quercetin cytokrom P450 innhold og øker lever glutation S-transferase (GST) aktiviteten involvert i aktivering /avgiftning av kjemiske mutagener /karsinogener [20] – [22]. Disse funnene antyder at quercetin kan gi beskyttelse mot DOX-mediert leverskade.
Den foreliggende studien tar sikte på å evaluere effekten av kombinasjonen av DOX kjemoterapeutisk middel med den naturlige forbindelsen quercetin på human leverkreft og normale celler. Potensialet funksjon av quercetin som en leverbeskyttende middel i løpet av behandlingen DOX i mus ble også undersøkt.
Våre resultater viser at det quercetin-forbedret DOX-mediert apoptose i hepatomceller er p53-avhengig og skjer ved downregulating Bcl- xl. Videre quercetin viser en beskyttende effekt mot DOX-indusert levertoksisitet hos mus.
Resultater
quercetin selektivt potensierer DOX cytotoksisitet i leverkreftceller, men ikke i normale leverceller
kulturer ble utsatt for quercetin ved doser på 0 uM til 150 uM for å bestemme effekten av quercetin på leverkreftceller og normale celler. Dimetylsulfoksyd (DMSO; 0,1%) ble anvendt som den negative kontroll. Etter 48 timer, en doseavhengig reduksjon i kreftcelle levedyktighet (IC
50 verdi SMMC7721 celler = 133 um og QGY7701 celler = 142 uM) ble observert (Fig. 1A). Quercetin ikke påvirker normale leverceller (L02) vekst, selv ved høye konsentrasjoner (mer enn 100 uM). Tatt i betraktning at 12 mikrometer av quercetin serumkonsentrasjonen ikke overtale eventuelle tilknyttede bivirkninger på mennesker og dens cytotoksisitet på flere kreftcellelinjer [23], [24], valgte vi 20 mikrometer av quercetin for narkotika kombinasjonsstudier. Quercetin (20 mm) økte DOX-indusert leverkreft celledød og redusert IC
50 Verdien av DOX mot hepatoma SMMC7721 celler (5,1 mikrometer til 2,2 mikrometer, Fig. 1B) og QGY7701 celler (6,2 mikrometer til 2,7 mikrometer; Fig . 1C). I motsetning til forbehandling med 20 pM av quercetin redusert DOX-mediert cytotoksisitet i normal lever L02 celler (Fig. 1D). I humant plasma, toppen og steady-state-konsentrasjon av DOX er 5 uM og 25 nM til 500 nM, respektivt [25]; derfor valgte vi en mikrometer av DOX for narkotika kombinasjonsstudier for å representere relevante plasmanivåer i DOX-behandlede pasienter. Annexin V /PI farging ble utført for å undersøke hvorvidt eller ikke DOX-indusert celledød i hepatomceller skjer gjennom apoptose. DOX (1 mm) behandling indusert apoptose i 13% av SMMC7721 celler; ko-behandling med quercetin øket andelen av apoptotiske celler til 42% (fig. 1E). Prosentandelen av DOX-indusert apoptose alene eller ko-behandling med quercetin i L02-celler var omtrent 22% og 18%, henholdsvis, noe som tyder på at quercetin ikke sensitivisere normale leverceller til DOX-indusert apoptose. Lignende resultater ble bekreftet ved Hoechst farving (data ikke vist). Disse resultatene antydet en preferensiell virkning potensiering av quercetin på DOX-mediert cytotoksisitet i leverkreftceller, men ikke i normale leverceller.
(A) Virkning av quercetin på proliferasjonen av SMMC7721 og QGY7701 leverkreftceller, og L02 normale leverceller. Cellene ble inkubert med quercetin (0 uM til 150 uM) i 48 timer og underkastet en MTT analyse for å bestemme proliferasjons- hastighet. (B) quercetin sensibilisert SMMC7721 celler til DOX. (C) quercetin sensibilisert QGY7701 celler til DOX. (D) quercetin partielt reduserte DOX-indusert veksthemming i L02-celler. Cellene ble inkubert med DOX (1 uM) og /eller quercetin (20 pM) (B, C og D) i 24 timer, og deretter underkastet en MTT analyse. Data er presentert som gjennomsnitt ± S.D. av tre uavhengige eksperimenter. (E) SMMC7721 og L02-celler ble inkubert med DOX (1 uM) og /eller quercetin (20 uM) i 24 timer, og deretter analysert ved hjelp av strømningscytometri ved bruk av Annexin V /PI farging for å diskriminere de levende celler (Annexin V /PI -), tidlig apoptotiske celler (Annexin V + /PI-), nekrose eller sent apoptotiske celler (Annexin V + /PI +), og døde celler (Annexin V- /PI +). *
P
0,05 vs. celler samtidig behandling med quercetin
quercetin forbedrer DOX-indusert caspaseaktivering i leverkreftceller
caspaseaktivering har en. viktig funksjon i både indre og ytre apoptotiske veier. Således vi undersøkte også effekten av quercetin på DOX-induserte endringer i caspaser. Quercetin ikke direkte aktivere kaspaser, men sterkt forbedret DOX-indusert caspase-9 aktivering, ikke caspase-8-aktivering, i SMMC7721 celler (Fig. 2A). Aktivert kaspase-3, den store effektor av kaspaser, og PARP, den viktigste substrat av kaspaser, ble også evaluert. Quercetin alene ikke overtale noen kløyving av caspase-3 i SMMC7721 celler; DOX induserte en 20 kDa cleavage formasjon. Imidlertid, ko-behandling av quercetin og DOX indusert spaltning av procaspase-3 inn i en p20 mellomprodukt, som deretter spaltes til den aktive P17-subenheten. Flere PARP-proteiner ble spaltet i 85 kDa-formene etter at kombinasjonsbehandlingen ble administrert sammenlignet med DOX behandling alene. Lignende aktiverings mønstre av kaspaser og spaltning av PARP ble observert i QGY7701-celler (data ikke vist). Caspase-3 aktivitet analyse bekreftet at quercetin økte DOX-indusert caspase-3 aktivitet i betydelig grad i SMMC7721 celler (fig. 2B). Effektene av bredspektret kaspaseinhibitor Z-VAD-FMK på leverkreft celle apoptose ble bestemt ved PI farging for å bekrefte at virkningen av quercetin på DOX var caspase avhengig. Den ko-behandling-fremkalt akkumulering av sub-G1 fasecellepopulasjoner i QGY7701 celler ble signifikant redusert (26% til 7%) ved forbehandling med Z-VAD-FMK (Fig. 2C). Den sub-G1 fasecellepopulasjon i SMMC7721 celler også redusert fra 39% til 8% (data ikke vist). Disse resultatene indikerte at quercetin forsterkes DOX-indusert apoptose i leverkreftceller ved å aktivere kaspaser-9 og -3 i det indre vei.
(A) spaltet caspaser-3, -8 og -9 og PARP uttrykk ble vurdert ved western blotting i SMMC7721 celler behandlet med DOX (1 uM) og /eller quercetin (20 uM) i 24 timer. β-aktin ble benyttet som en intern kontroll. (B) Caspase-3-aktivitetsanalyse av DOX- (1 uM) og /eller quercetin- (20 uM) ble behandlet SMMC7721-celler i 24 timer. Cellelysatene ble inkubert med fluorogene caspase-3 substrat i 1 time ved 37 ° C. Caspase-3-aktivitet ble normalisert til cellelysat protein og uttrykt som ganger aktivering sammenlignet med kontrollen. *
P
0,05 vs. DOX-behandlede celler. (C) Caspase-inhibitor Z-VAD-FMK reduserte effekten av quercetin på DOX-indusert apoptose i QGY7701 celler ble undersøkt ved PI farging. Kontroll: 0,5% dimetylsulfoksid; quercetin: 20 mikrometer; DOX: 1 mikrometer; DOX + quercetin: DOX 1fiM pluss quercetin 20 mikrometer; Z-VAD-FMK + DOX + quercetin:-celler ble forbehandlet med 25 pM Z-VAD-FMK i 1,5 timer og ytterligere behandlet med DOX pluss quercetin i 24 timer. Data er presentert som gjennomsnitt ± S.D. av tre uavhengige eksperimenter. *
P
0,05 vs. DOX-behandlede celler. **
P
. 0,01 vs. DOX + quercetin-behandlede celler
quercetin forsterker DOX-indusert apoptose i leveren kreftceller gjennom BCL-XL /Bax-mediert mitokondrie vei
Forsøkene ble utført ved bruk av JC-1 for å undersøke potensialet involvering av mitokondrie membran avbrudd. Kvantitative målinger viser at SMMC7721 celler behandlet med quercetin alene ikke viser noen endring i forhold til kontrollen. DOX behandling induserte en moderat reduksjon av rød fluorescens, noe som indikerer en reduksjon i den mitokondrielle membranpotensiale, mens samtidig behandlingen av quercetin og DOX induserte en kraftig, betydelig reduksjon (fig. 3A og B). I samsvar med tap av mitokondrie membran, co-behandling av SMMC7721 celler med quercetin og DOX utgitt mer cytokrom
c
fra mitokondriene til cytosol sammenlignet med den DOX behandling alene (Fig. 3C).
(A, B) Effekt av DOX og /eller quercetin på mitokondriemembranpotensialet sammenbrudd i SMMC7721 celler behandlet med DOX (1 uM) og /eller quercetin (20 uM) i 24 timer. JC-1 er observert som grønne fluorescerende monomerer i cytosol eller som røde fluorescerende aggregater i intakte mitokondriene. Reduksjonen av rød fluorescens-intensiteten indikerer mitokondriell nedbryting med intakte membranpotensialet. *
P
0,01 vs. DOX-behandlede celler. (C) Western blot-analyse av den totale ekspresjon av bud, Bcl-2 og Bcl-xl, samt mitokondrie fordeling av Bax og cytosol fordeling av cytokrom
c
i SMMC7721 celler behandlet med DOX ( 1 uM) og /eller quercetin (20 uM) i 24 timer. β-aktin ble benyttet som en intern kontroll for det totale protein og cytosol-protein. Hsp60 ble anvendt som en intern kontroll for mitokondrie protein. (D) Western blot analyse av mitokondriell fordeling av Bax og den totale ekspresjon av Bcl-xl i SMMC7721 celler transfektert med Bcl-xl ekspresjonsvektor og behandlet med DOX (1 uM) og /eller quercetin (20 uM) i 24 timer. (E) Effekt av DOX og /eller quercetin på apoptose av SMMC7721 /Bcl-xl og SMMC7721 /neo-celler analysert ved PI-farging etter DOX (1 uM) og /eller quercetin (20 uM) ble administrert i 24 timer. *
P
0,01, SMMC7721 /neo vs SMMC7721 /BCL-xl celler. Data er presentert som gjennomsnitt ± S.D. av tre uavhengige eksperimenter.
Vi undersøkte Bcl-2 familien proteiner uttrykk nivå for å undersøke potensielle molekylære mål oppstrøms caspase-9 veier. BCL-2 uttrykk nivå ikke endre seg etter ulike behandlinger ble utført. Den ko-behandling av DOX og quercetin ikke påvirke DOX-induserte reduksjon i Bid ekspresjonsnivå. Overraskende, forårsaket co-behandling en kraftig reduksjon i BCL-xl uttrykk, mens DOX eller quercetin behandling alene ikke påvirker BCL-xl uttrykk (Fig. 3C). Følgelig co-behandling av SMMC7721 celler med quercetin og DOX kraftig økt Bax trans fra cytosol inn i mitokondriene, sammenlignet med DOX behandling alene, som bare forårsaket en moderat økning i Bax trans.
SMMC7721 celler var stabilt transdusert ved hjelp av Bcl-xl ekspresjonsvektor for å bekrefte den viktige funksjon av Bcl-xl protein i virkningene av quercetin på DOX-indusert apoptose. Overekspresjon av Bcl-xl i SMMC7721 celler inhiberte signifikant Bax trans til mitokondriene som ble indusert ved samtidig behandling av DOX og quercetin (fig. 3D), og reduserte potensiering effekten av quercetin på DOX-indusert apoptose (Fig. 3E ). Disse resultatene antydet at quercetin forsterker DOX-indusert apoptose i hepatomceller gjennom mitokondrie sti ved downregulating BCL-XL protein og deretter øke Bax trans inn i mitokondriene.
Quercetin forbedring av DOX-indusert apoptose i leveren kreftceller er p53-avhengig
aktivert p53-mediert fremming av apoptose i tumorceller er en viktig mekanisme for antitumormedikamenter, såsom DOX [26]. Derfor, undersøkte vi hvorvidt p53 protein er involvert i potensiering av virkningen quercetin på DOX-indusert apoptose i leverkreftceller. Ingen påvisbar p53-protein-ekspresjon ble observert i kontrollgruppen eller quercetin-behandlede celler, mens de samtidig behandling av quercetin og DOX betydelig økt ekspresjon nivå av p53-protein indusert av DOX i SMMC7721 celler (Fig. 4A). p53 oppregulert modulator av apoptose (PUMA), et pro-apoptotiske BH3-bare protein, er et direkte mål transkripsjonen av p53. Quercetin senere økte DOX-indusert PUMA uttrykk nivåer. SMMC7721 celler ble transient transfektert med p53-luciferase plasmid og utsatt for forskjellige behandlinger for å klargjøre funksjonen av p53 i potensiering av virkningen quercetin på DOX-indusert apoptose. Quercetin alene ikke forbedre p53 aktivitet. I motsetning til den kombinerte behandling med DOX DOX og behandling alene forbedret i betydelig grad p53 aktivitet av 15- og 6-ganger, sammenlignet med kontrollgruppen. Videre pifithrin-α, en spesifikk p53 inhibitor, ikke påvirker celleoverlevelse, men i betydelig grad hemmet p53-aktivitet (2,4 ganger), som ble forsterket av den kombin quercetin og DOX-behandling (fig. 4B), og reduserte potense effekten av quercetin på DOX-indusert apoptose (fig. 4C). Disse resultatene antydet at den forbedrede p53 aktivitet er nødvendig for å stimulere potensiering effekten av quercetin på DOX-indusert apoptose.
(A) og p53 Puma uttrykk ble undersøkt ved western blot i SMMC7721 celler behandlet med DOX (1 uM ) og /eller quercetin (20 uM) i 24 timer. β-aktin ble benyttet som en intern kontroll. (B) Den luciferase assay av DOX- og quercetin-indusert p53-aktivering. SMMC7721 celler ble forbehandlet i 1 time med 2 uM av pifithrin-α, og deretter behandlet med DOX (1 uM) eller quercetin (20 uM) i 12 timer. p53-aktivitet ble bestemt ved luciferase aktivitetsanalyse. Data er presentert som gjennomsnitt ± S.D. av tre uavhengige eksperimenter. *
P
0,01 vs. DOX-behandlede celler. **
P
0,001 vs. DOX + quercetin-behandlede celler. (C) SMMC7721-celler ble forbehandlet med 2 uM av pfithrin-α i 1 time, og deretter behandlet med DOX (1 uM) og /eller quercetin (20 uM) i 24 timer. Apoptose rater ble analysert ved Annexin V /PI farging. Data er presentert som gjennomsnitt ± S.D. av tre uavhengige eksperimenter. *
P
0,001 vs. DOX-behandlede celler. **
P
0,01 vs. DOX-behandlede celler. ***
P
. 0,001 vs. DOX + quercetin-behandlede celler
Quercetin øker DOX-indusert veksthemming av SMMC7721 transplantater i mus
effekter av quercetin på DOX i våre cellekultur modell
in vitro
ble validert i denne studien. Derfor vurderte vi om quercetin kan forsterke antitumor effekt av DOX i SMMC7721 tumorxenotransplantater i nakne mus. SMMC7721 enkeltcellesuspensjoner ble injisert s.c. inn i flankene til seks uker gamle immun-manglende mus, ble musene deretter inndelt i fire grupper 10 dager etter svulst inokulering når tumorene var følbar: 1) normalt saltvann kontrollgruppen (i.p., 3 x /uke); 2) quercetin (100 mg /kg, i.p., 3 x /uke); 3) DOX (4 mg /kg, i.p., 1 x /uke); og 4) DOX (4 mg /kg, i.p., 1 x /uke) pluss quercetin (100 mg /kg, i.p., 3 x /uke). For DOX gruppe, ble behandlinger administrert til en kumulativ dose på 12 mg /kg ble nådd. Quercetin alene ikke hemme tumorvekst; i stedet, quercetin fremmet tumorvekst for de første 14 dager, og deretter bremset tumorvekst for de neste 7 dager sammenlignet med kontrollgruppen. Ved slutten av forsøket, det gjennomsnittlige tumorvolumet quercetin behandling var 531,3 mm
3, lik den til kontrollgruppen. DOX behandling signifikant reduserte tumorvolumer (334,7 mm
3) sammenlignet med kontrollgruppen. En signifikant reduksjon i tumorvolum av co-behandlede xenotransplantater ble observert fra dag fire av post-behandling og til slutten av forsøket (Fig. 5A). Etter co-behandling ble administrert, svulstene vokste til redusert pris med start og slutt gjennomsnittlig tumorvolum av 76,5 og 118,1 mm
3, henholdsvis.
SMMC7721 celle-stammer svulster ble utviklet i hårløse mus og behandlet med saltoppløsning, quercetin, DOX, og DOX + quercetin. (A) Tumorveksten ble overvåket ved å måle tumorvolumet i tre uker. (
n
= 5 mus per gruppe). *
P
0,01 vs. kontroll og quercetin-behandlede grupper. **
P
0,01 vs. DOX-behandlede gruppen. (B) Ved slutten av tre uker, ble tumorene oppsamlet og veiet. DOX redusert svulststørrelsen sammenlignet med kontrollen og quercetin-behandlede grupper (*
P
0,05). Co-behandling betydelig redusert tumorstørrelse sammenlignet med andre behandlingsgrupper (**
P
0,001). (C) Tumor-prøver ble underkastet hematoxylin og eosin-farging og immunhistokjemisk analyse ved hjelp av Ki67, Bcl-xl, og p53-antistoffer. Co-behandlede svulster viste en signifikant reduksjon i Ki67 og BCL-XL uttrykk, samt en økning i p53 uttrykk sammenlignet med andre behandlede tumorer (
P
0,05).
den gjennomsnittlige tumorvekt av kontrollgruppen nådde 163 mg, mens den quercetin-behandlede gruppen fremkalte ingen virkning på SMMC7721 tumorvekst. DOX behandling resulterte i omtrent 50% tumorvekst-inhibering sammenlignet med kontrollgruppen; gjennomsnittlig tumorvekten redusert til 87 mg. Den ko-behandling av DOX og quercetin fremkalte den mest effektive tumorvekst-inhibering og resulterte i en gjennomsnittlig tumorvekt av 20 mg (Fig. 5B). Dataene indikerte at quercetin øker antitumor aktivitet av DOX
in vivo
.
Histologisk svulstene var betydelig mindre mobil og består hovedsakelig av acellulær materiale i co-behandlet xenografter. I motsetning til dette, ble tumorcellene fra mus som mottok bæremiddelkontroll og quercetin behandling anordnet som reir atskilt av bunter av ekstracellulær matriks (fig. 5C). Et lavt antall tumorer ble funnet i DOX-behandlede mus. Tumorsnitt fra nakne mus ble undersøkt for Ki67 uttrykk for å undersøke effekten av den kombinerte behandling på tumorcelleformering (fig. 5C). Etter tre uker med behandling, 24%, 62%, 91% og 92% av Ki67 + tumorceller ble funnet i co-, DOX-, og bærerkontrollen eller quercetin-behandlede mus, respektivt. Andre immunhistokjemiske analyser ble utført for å bekrefte
in vitro
funn på de mekanismer som quercetin utstillinger potense effekt med DOX
in vivo
. Quercetin og DOX co-behandlede svulster exhibitd økt p53 nivåer og redusert BCL-XL nivåer sammenlignet med kontrollgruppen (Fig. 5C), i samsvar med våre
in vitro
funn.
quercetin demper DOX indusert levertoksisitet
in vivo
Vurderer våre
in vitro
observasjoner som quercetin kan redusere DOX cytotoksisitet i normale leverceller (fig. 1D), vi undersøkt effekten videre DOX-indusert levertoksisitet
in vivo
. C57BL /6-mus ble behandlet med DOX 20 mg /kg (i.p.), en dose som forårsaker akutt toksisitet [27]. Den akutte levertoksisitet av DOX ble tydelig avslørt av økningen i serum biokjemiske markører, særlig alaninaminotransferase (ALAT) og aspartataminotransferase (AST). DOX behandling resulterte i en betydelig økning av 765% og 378% i ALAT og ASAT, sammenlignet med kontrollgruppen (tabell 1). Quercetin tilskudd alene ikke vise vesentlige endringer i de biokjemiske markører. Derimot er co-behandling av DOX og quercetin resulterte i en delvis reversering av DOX-indusert serum økning i ALAT og ASAT (
p
0,05).
mikroskopisk undersøkelse avslørte at kontroll og quercetin-behandlede hepatiske vev har store normale polygonale celler med fremtredende runde kjerner og eosinofilt cytoplasma, samt et par innbyrdes adskilte hepatiske sinus anordnet i mellom de hepatiske ledninger (fig. 6A). I motsetning musene som fikk 20 mg /kg av DOX viste massiv levertoksisitet, med oppløsningen av involverte lever ledninger, som dukket opp som tomme vakuoler justert av tråder av nekrotiske hepatocytter og kupffer- celler proliferated i et diffust måte mellom fett utartet hepatocytter. Histopatologisk bevis viste at leverskade etter DOX behandling ble signifikant redusert ved samtidig behandling med quercetin.
(A) C57BL /6-mus ble behandlet med quercetin (100 mg /kg /dag, po) fire dager før ip administrering av DOX (20 mg /kg). Livers ble fjernet fem dager etter DOX behandling, og seksjonene ble farget med hematoxylin og eosin (H E; forstørrelse 200 ×). (B) SMMC7721-celle-avledede tumorer ble utviklet i nakne mus og behandlet med saltoppløsning, quercetin, DOX, og DOX + quercetin. Ved slutten av tre uker, ble lever oppsamlet og farget med H E. (C) En modell av effekten av quercetion på DOX i leverceller. I denne modellen øker quercetin DOX-indusert p53-ekspresjon i leverkreftceller og reduserer Bcl-xl uttrykk, for derved å øke caspase -3 /-9-aktivitet og potensierer DOX-indusert celledød i leverkreftceller. Quercetin reduserer DOX-indusert oksidativt stress og øker celle overlevelse i normale leverceller.
Vi undersøkte DOX-indusert subkronisk leverskader hos mus ved hjelp SMMC7721 xenografter. Den DOX-behandlede gruppen fikk DOX gang i uken (4 mg /kg, i.p.) inntil en kumulativ dose på 12 mg /kg ble nådd. Den hepatiske vev i DOX-behandlede gruppe viste patologiske forandringer som ligner de for akutt DOX-behandlede C57BL /6 mus (Fig. 6B). Quercetin reversert DOX-indusert leverskade i hårløse mus med SMMC7721 tumorxenotransplantater.
Diskusjoner
Selv om DOX er en potent kreft narkotika, klinisk bruk er begrenset av sin giftighet for normalt vev, slik som hjertet og leveren. En annen begrensning av dens effektivitet er utviklingen av multimedikamentresistens av cancerceller. Noen flavonoider oppviser økt anti-tumoreffekter med kjemoterapeutiske midler, så som quercetin [28]. I
in vitro Hotell og brystkreft dyremodeller, forbedrer quercetin den terapeutiske indeks av DOX i brystkreftceller ved å forstyrre celle metabolisme, GST aktivitet, og cytoskjelettet. I motsetning til dette, reduserer quercetin DOX cytotoksisitet i ikke-tumor mammary celler [13] – [15]. Selv om ko-behandling av quercetin og DOX kan utvikles til en ny kjemoterapeutisk kombinasjon for brystcancer terapi, uansett om quercetin fremkaller samme virkning på DOX i andre typer av kreft, hvori DOX anvendes som førstelinjebehandling, f.eks som leverkreft, er ukjent. Denne studien undersøkte effekten av quercetin med DOX på leverkreftceller og dens beskyttende effekt mot DOX-indusert levertoksisitet hos mus.
Flere studier har vist at IC
50 for quercetin i forskjellige tumorer varierer 7 nM til 100 mikrometer. I motsetning til andre typer av humane kreftceller, oppviser quercetin anti-proliferativ og pro-apoptotiske virkninger ved lave konsentrasjoner, [23], eksempel 21 uM for MDA-MB-468 humane brystcancerceller [24]. Flere rapporter og resultatene viste at humane hepatomceller anses resistente mot quercetin fordi IC
50 verdi er 100 uM. Humane hepatomceller er også resistente overfor DOX (IC
50 verdi 5 uM) og toppen DOX-konsentrasjonen i humant plasma er 5 uM. Våre resultater viser også at samtidig behandling av quercetin (20 uM) og DOX (1 uM) forsterker antitumoreffekter av DOX i humane leverkreftceller i betydelig grad. Kreftceller vise sin motstand mot kjemoterapi ved å utvise den intracellulære anti-kreft narkotika ut av cellene gjennom P-gp og andre legemiddel pumper. Quercetin kan hemme P-gp pumpe effluks aktivitet på doseavhengig måte og indusere apoptose i resistente humane myelogen leukemi og brystkreftceller [29] – [31]; Dermed blir tilrettelagt DOX-indusert apoptose kanskje et resultat av quercetin-indusert P-gp-hemming, etterfulgt av en økning i intracellulær DOX, og en følgelig forbedret apoptose [32]. Imidlertid kan lave doser av DOX forsiktig øke MDR1 mRNA, men ikke protein uttrykk [33]. For MRP1 ble ingen påviselig MRP1 mRNA i DOX-behandlede SMMC7721 celler funnet [34]. Med konfokale mikroskopiske teknologi, har vi observert at den intracellulære fordelingen av DOX i disse hepatomceller ikke ble påvirket av quercetin (data ikke vist). Dermed sannsynligvis forsterker quercetin DOX-indusert apoptose, men ikke gjennom sin handling på narkotika oppbevaring og utstrømming. Videre studier er nødvendig for å avgjøre hvorvidt quercetin sensitizes DOX-resistente lever kreftceller ved å påvirke mdr relaterte genekspresjon
DOX-indusert apoptose er assosiert med to forskjellige apoptose trasé. Død reseptor veien ved å aktivere caspase -8 og mitokondrielle veien ved aktivering av kaspase-9 [35]. Den mitokondrielle veien er den viktigste mekanisme for DOX-indusert apoptose [36], i hvilket den sentrale prosessen involverer permeabiliseringen av den ytre mitokondriemembranen med den etterfølgende frigjøring av flere pro-apoptotiske faktorer i cytosol [37]. Cytokrom
c
, en av de pro-apoptotiske faktorer, CARD adapter protein APAF-en, og pro-caspase-9 montere i cytosol å danne apoptosome. Pro-kaspase-9 blir deretter behandlet autoproteolytically og utløser aktivering av effektorceller kaspaser, og dermed føre til spalting av flere substrater. Vi fant at quercetin betydelig økt DOX-indusert tap av mitokondriemembranen potensialet, noe som indikerer økningen i mitokondrie sammenbrudd. Vesentlig øket frigjøring av cytokrom
c
og spaltning av pro-kaspase-9 deretter inntraff, som fører til økning av caspase-3 aktivitet og PARP degradering. Z-VAD-FMK blokkerte quercetin forbedret, DOX-indusert apoptose, noe som tyder på at quercetin sensitizes DOX-indusert apoptose i leverkreftceller hovedsakelig gjennom mitokondrie vei.
Mange rapporter tydet på at p53 tumor suppressor protein regulerer mitokondriene -rettet apoptose [38]. p53, som en transkripsjonsfaktor, kan stimulere uttrykk for pro-apoptotiske målgener, for eksempel PUMA, Bax, og Bud [39].
