Abstract
Heri presenterer vi en ny bilde plattform for å studere biologiske effekter av ikke-invasiv radiofrekvens (RF) elektrisk felt kreft hypertermi. Dette systemet gjør det mulig for
sanntid in vivo
intramikroskopi (IVM) avbildning av radiofrekvente-indusert biologiske endringer som endringer i fartøyets struktur og narkotika perfusjon. Våre resultater tyder på at IVM-systemet er i stand til å håndtere eksponering for høy effekt elektriske-felt uten å indusere betydelige maskinvare skader eller bilde gjenstander. Videre korte perioder med lavt strømforbruk ( 200 W) radiofrekvent eksponering økt transport og perfusjon av fluorescerende sporstoff i svulstene ved temperaturer under 41 ° C. Fartøy deformasjoner og blodkoagulering ble sett for kreft temperaturer rundt 44 ° C. Disse resultatene markere bruken av vår integrerte IVM-RF bildebehandling plattform som et kraftig nytt verktøy for å visualisere dynamikken og samspillet mellom radiofrekvens energi og biologisk vev, organer og svulster
Citation. Corr SJ, Shamsudeen S, Vergara LA, Ho JC-S, Ware MJ, Keshishian V, et al. (2015) En ny Imaging Platform for å visualisere biologiske effekter av ikke-invasiv Radiofrekvens Electric-Field Cancer hypertermi. PLoS ONE 10 (8): e0136382. doi: 10,1371 /journal.pone.0136382
Redaktør: Arrate Muñoz-Barrutia, Universidad Carlos III de Madrid; Instituto de INVESTIGACION Sanitaria Gregorio Marañon, SPANIA
mottatt: 03.06.2014; Godkjent: 03.08.2015; Publisert: 26 august 2015
Copyright: © 2015 Corr et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Forskning rapportert i denne publikasjonen ble støttet av NIH Physical Science in Oncology Program (U54CA143837), NIH MD Anderson kreftsenter tilskudd (CA016672), The Welch Foundation (C-0627, 616 LJW), en ubegrenset forskningsstipend fra Kanzius 617 Research Foundation (SAC, Erie, PA) og Nasjonalt Senter for Advancing Translasjonsforskerne Sciences av National Institutes of Health i henhold Award tall TL1TR000369 og UL1TR000371. Innholdet er utelukkende ansvaret til forfatterne og ikke nødvendigvis representerer den offisielle visninger av National Institutes of Health. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Samhandling av høyfrekvente radiobølger (13,56 MHz) med vev og nanomaterialer i biologisk vev blir nå etterforsket som en terapeutisk plattform for non-invasiv kreft hypertermi terapi. De unike dielektriske egenskaper cancervev favorisere radiofrekvensenergi (RF-energi) absorbsjon og omforming til varme, og er antatt å være ytterligere akselerert ved anvendelse av RF-energiabsorberende nanomaterialer som for eksempel gull nanopartikler og enkelt-vegger karbon nanorør. Forbedret tumor oppvarming er på grunn av større dielektriske tap i tumorvev sammenlignet med normalt vev [1] og har funnet anvendelser innen klinisk hypertermi [2]. Mye arbeid har vært fokusert på å måle og tolke temperaturfordelingen [3] og dielektriske egenskaper av forskjellige friske og cancerøse animalsk vev på tvers av radio- og mikrobølgefrekvenser [4-6]. Sammenlignet med andre nano-basert fototermiske hypertermi nærmer RF terapi gir fordelen av større vev penetreringsdybde (~ 5-30 cm), som er på grunn av de relativt lange bølgelengder (RF ~ 22 m ved 13,56 MHz), sammenlignet med den underjordiske millimeter penetrasjon dypet av infrarøde (IR) og nær-infrarødt (NIR) lys.
i et forsøk på å ytterligere øke differensial-oppvarming priser og RF-indusert kreft cytotoksisitet, flere studier har vist varmeegenskaper [7- 12]; biologiske toksisitet [13-20]; elektriske interaksjoner [11, 21-24]; og gjennomførbarheten av nanomaterial interaksjoner med RF-energi, og deres anvendelse som en potensiell medisinsk hypertermi adjuvans. Til tross for den pågående utviklingen av de ulike rollene som nanomaterialer spille i lokaliserte varmeutvikling og cytotoksisitet, både innenfor forenklede vannløsninger og biologisk materiale, har mye arbeid blitt oppnådd mot å forstå den grunnleggende vitenskapen bak RF interaksjoner med biologisk vev med potensial for synergi å eksistere med klinisk godkjente kjemoterapi agenter som Abraxane, cetuximab, og gemcitabin [25]. De refererte artikler av Collins
et al
. og Liu
et al
. tilbyr et omfattende og konsis oversikt over feltet [26, 27].
En måte å direkte visualisere samspillet mellom biologiske vev og RF elektriske-felt, slik innsikt i de grunnleggende prosesser og grunnleggende vitenskapen bak dette terapi, har vært mangler. Som foreløpig har det ikke vært design for å fange disse dynamiske hendelser, særlig på grunn av vanskeligheter med å integrere en høyeffekts elektrisk felt generator i ulike bildediagnostikk. Heri presenterer vi en integrerende system som kombinerer RF eksponering med høy oppløsning intramikroskopi (IVM) (RF-IVM) for å tillate
sanntid in vivo
fluorescerende avbildning av RF-induserte biologiske effekter. IVM, ved hjelp av konfokal og eller multiphoton eksitasjon teknologi, er en kraftfull teknikk for avbildnings levende dyr med høy oppløsning med evne til å nå vevet dybder på flere hundre mikrometer. Med denne teknikken, søkere er i stand til å vurdere vev og cellulære responser over tid og i det tredimensjonale rom i levende vev under naturlige fysiologiske betingelser [28]. Dataene som presenteres i denne studien viser at (i) en høyeffekts RF generator system (200 W, ~ 15 kV /m) kan med hell være retro-montert inn i en Nikon A1R IVM system uten hardware skade eller bilde gjenstander; og (ii) den integrerte IVM-RF systemet tillater avbildning av mild hypertermi-indusert dynamiske hendelser ( 41 ° C), som økt svulst perfusjon av systemisk administrerte fluorescerende sporstoff (albumin og FITC-dekstran) samt fartøy deformasjon og koagulasjon observert i temperaturområdet 44-49 ° C. Gitt disse resultatene, forventer vi at IVM-RF-systemet vil gjøre oss i stand til bilde RF-indusert biologiske hendelser som for eksempel endringer i vaskulær permeabilitet, endringer i vev integritet, innflytelse på nanopartikkel og akkumulering av legemidlet, penetrasjon vev og celle migrasjon hendelser.
Materialer og metoder
bærbar-RF system
et fotografi av den bærbare-RF system (p-RF) system sammen med en skjematisk fremstilling av p-RF eksperimentelle oppsettet er illustrert i figur 1A og 1B. Full dimensjoner kan bli funnet i S1 Fig Enheten drives av en 200 W fast frekvens (13,56 MHz) vannkjølte strømforsyning (Seren, RX01 /LX01 Series, Industrial Power Systems, Inc.), som er forbundet via en høy -Gjeldende bæreevne 50 Ω koaksial kabel. Prøven som skal utsettes for RF er plassert mellom de sendende og mottak hoder (TX og RX, henholdsvis). Økning i temperatur registreres ved hjelp av enten en 1 mm ytre diameter fiberoptisk teflonbelagte termiske følere (Photon Kontroll, Canada), med en temperatur nøyaktighet på ± 0,5 ° C, eller en infrarød (IR) kamera (FLIR SC 6000, FLIR Systems, Inc., Boston, MA), med en temperatur nøyaktighet på ± 2 ° C (640 x 512 oppløsning InSb detektor med en mid-IR-bølgelengde spektralområdet fra 3,0 til 5,0 um). Termisk sonde Data registreres ved hjelp av en spesialbygget LabVIEW Virtual Instrument (National Instruments, Austin, TX). Den genererte elektriske RF-felt ble karakterisert ved anvendelse av en teflonbelagt elektrisk felt sonden (TherMed, LLC, Erie, PA) som er festet til en justerbar x, y, z trinn (Thorlabs, Inc.) for justerbar posisjonering, slik som vist i fig 1C og 1D. Alle detaljer for elektrisk-målinger kan bli funnet i S2 Fig Som man kan se i figur 1D, er den «aktive» område av RF elektrisk felt eksponering sentrert ~ 6 cm rundt midtpunktet av TX hodet og strekker ~ 1 -2 cm tvers over x-aksen, noe som forårsaket en oppvarming profil som er gradvis redusert som prøven er plassert lenger vekk fra TX hode.
(A) Bærbart RF-system består av sendeenheten (TX) og å motta den første (RX) som genererer en høyeffekts elektrisk felt over prøven (f.eks mus). Systemet er drevet av en variabel strøm fast RF-forsterker (0-200 W, 13,56 MHz) som kjøles under drift av en vannkjøler. Varmeproduksjon overvåkes ved hjelp av en infrarød (IR) kamera eller direkte innsetting av fiber optiske sonder. (B) krets representasjon av det bærbare RF-system. (C) Oppsett for å utvinne elektrisk feltstyrker. En elektrisk-feltsonden (EFP) er plassert på bestemte steder langs x- og z-aksen mellom TX og RX hoder og måler spenningen ved hvert punkt i 20 W RF-strøm. (D) Det elektriske felt er avledet fra spenningsdataene og er plottet som en intensitet konturplott.
p-RF-systemet i seg selv er forholdsvis liten (lengde ~ 60 cm) sammenlignet med våre større RF modeller [1, 7, 14]. I likhet med våre tidligere RF-generatorer leverer design et sterkt vekslende (13,56 MHz) elektriske feltet over TX og RX hoder [29] med en kaskade LC nettverk. Imidlertid, i motsetning til våre tidligere systemer, dette systemet er ikke kapasitivt koplet og ikke modellere en ideell parallell-platekondensator konfigurasjon hvor den elektriske felt vil være tilnærmet ensartet på tvers av TX og RX hoder. I stedet, dette systemet sender et elektrisk felt som gradvis avtar over TX-RX hoder og er derfor klassifisert som en «end-sparken overføring konfigurasjon».
IVM-RF system
Et bilde av p-RF-systemet ettermonteres til et Nikon A1R
+ IVM er vist i figur 2A. Nikon A1R
+ er en laser scanning confocal mikroskop utstyrt med to skanning mekanismer, et vanlig galvano drevet system og en resonant skanner. Den A1R
+ er utstyrt med 4 solid-state laser (405, 488, 561 og 640 nm) og 4 fluorescens detektorer, inkludert to Gaasp PMTs. Den A1R
+ er også utstyrt med en stor plattform motorisert stadium (Før Scientific ZDeck) og en samling av lang arbeidsavstand mål spenner fra lav forstørrelse, stort synsfelt (4x 0.2NA og 10x 0,4 NA), opp til høy oppløsning, nedsenking i vann (16x 0,8 NA og 25x 1.2NA) linser. Systemdrift og bilde oppkjøpet er kontrollert av Nikon NIS Elements programvare (v 4.0). Når RF-instrumentet ble montert på IVM, vår innledende evaluering av det integrerte system som er involvert gradvis økning av p-RF-effekt (uten et eksempel), mens overvåke spenningen som induseres over IVM chassiset ved å koble et oscilloskop sonde til elektrode bakken pinnene plassert bak objektiv på IVM-systemet. På alle effektnivåer, inkludert den høyeste effekt på 200 W RF, spenning indusert på kabinettet var mindre enn 500 mV, noe som anses ubetydelig, og ble ikke spådd å forstyrre maskinvare. Denne testprosedyren ble utført for å sørge for at RF-energi ble ikke direkte kopling til IVM mikroskop, som ville mest sannsynlig føre til irreversible elektroniske og strukturelle skader på IVM-systemet. Mindre forstyrrelser inkludert programvare funksjonsfeil i form av tilfeldig åpnet nettleservinduer og tekst skinn-vi betegnet denne effekten «ghost writer «og oppdaget opprinnelsen til denne effekten å skyldes RF-felt kobling til datamaskinens tastatur. Innpakning tastaturkabelen rundt en ferrittkjerne balun for å redusere RF forstyrrelser løst dette problemet. Vi har også observert forstyrrelser med motorisert scenen, som ble løst ved å isolere joystick controller boks med aluminiumsfolie.
(A) RF system integrert i intra mikroskop (IVM) for sanntids bilde etter RF-stråling . (B) Mouse manipulasjon for bildebehandling-en innsnitt er gjort for å avdekke og forsiktig manipulere 4T1 svulst for IVM bildebehandling. (C) 4T1 svulst etter IVM belysning med en x4 objektiv.
Dyremodeller
Nude mus (4-6 wk gamle) ble hentet fra Charles River Laboratories, Inc. ( Wilmington, MA). Brystsvulster ble etablert ved hjelp av fluorescerende 4T1 td-Tomato Bioware Ultra Red musebrystkreftceller som er kjøpt fra Caliper Life Sciences (Hopkinton, MA). Mus ble behandlet og avbildes når tumorene nådde en størrelse ~ 8 til 10 mm i diameter. Ved avslutning av bildebehandling økten ble dyrene avlivet via CO
2 eksponering følges ved halshugging. Alle prosedyrer ble utført i henhold til protokoller godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved Houston Methodist Research Institute og i henhold til NIH Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr.
RF-IVM dyr manipulasjoner
Mus bærende 4T1 svulster ble avslørt av en liten midtlinjen snitt der fascia mellom huden og muskelen ble avbrutt med en bomullspinne. En invertert hud klaff ble hevet ved hjelp rullet bomull gasbind. Bilder fra musene blir manipulert for RF-IVM er vist i figur 2B og 2C. Mus ble bedøvet ved hjelp av 2-3% isofluran (Aerrane, Baxter Healthcare, Deerfield, IL, USA) administreres gjennom en isofluran vaporizer system (E-Z Systems, Palmer, PA, USA). Musene ble holdt på en oppvarming pad under kirurgiske forberedelse og bildebehandling eksperimenter for å opprettholde kroppens kjernetemperatur. I løpet av de billedopptak tumoren ble kontinuerlig fuktet med saltvann og temperaturen ble overvåket ved hjelp av teflonbelagt fiberoptiske prober og /eller et IR-kamera. For bildebehandling med vann nedsenking linser, ble en dekkglass forsiktig plassert på toppen av fuktet bildebehandling området ved hjelp av en manuell micromanipulator (Kite, WPI). Time-lapse opptak ble tatt til fange på utvalgte felt av syn på bildefrekvens på 10-30 fps.
Fluorescent markører
De fluorescerende sporstoff som brukes i denne forsøkene var Albumin-Alexa Fluor 647 (MW ~ 66kDa) og fluoresceinisotiocyanat-dekstran (FITC-dekstran, MW ~ 70 kDa). Begge ble hentet fra Life Technologies, Grand Island, NY. Mus ble gitt 50 ul retro-orbital injeksjoner av enten Alexa 647 eller FITC-dekstran (eller begge deler) ved konsentrasjoner på 10 mg /kg (suspendert i fosfatbufret saltoppløsning, PBS). Musene ble deretter utsatt for RF-stråling med eller uten samtidig IVM avbildning. Fluoriserende sporstoff ble anvendt i denne studien til kontrast tumorblodkarene og til å undersøke ekstravasasjon, på grunn av økt vaskulær permeabilitet, og diffusjon av sporstoff inn i tumorene. Kreftceller ble identifisert ved deres uttrykk for tdTomato-fluorescerende protein. FITC-dekstran, Td-Tomat og Albumin-647 fluorescens signaler ble oppdaget sekvensielt ved hjelp av laser eksitasjon linjer på 488, 561 og 640 nm, mens utslipp ble tatt opp med smalbåndpassfiltre (30-50 nm båndbredde) på 520, 600 og lengre enn 640 nm, respektivt. Tre-kanal bildene ble tatt en 512×512 rammestørrelser med pinhole diameter satt på en Airy enhet (AU) beregnet til 561 nm.
Immunofluorescent bildebehandling
Den komplette makro-perfusjon og opptak av fluorescerende sporstoff i hele svulsten i RF og ikke-RF behandlede mus ble analysert
ex vivo
hjelp immunfluorescens bildebehandling. Tumor blodkar ble visualisert ved hjelp av antistoffer for CD31 å vurdere vevspenetrasjon av ekstravasert albumin eller FITC-dekstran. Frosne tumorsnitt ble fiksert med 4% para-formaldehyd, blokkert med 5% normalt hesteserum og 1% normalt geiteserum i PBS, og immunofluorescently farges ved hjelp av antistoffer mot CD31 (BD Biosciences, San Jose, CA). Seksjonene ble deretter inkubert med geite-anti-rotte-IgG Alexa Fluor 488-antistoff (Jackson Immunoresearch, West Groove, PA) [30]. Bildene ble tatt med vår Nikon A1R
+ konfokalmikroskop og analysert ved hjelp av Nikon NIS-Elements AR programvare (v3.2). Forholdet av bildeelementer i det hele bilde som har høyere fluorescens intensitet enn terskelen (bakgrunn) ble vist som positive område fraksjon [31, 32]. Dataene ble vist som gjennomsnitt ± SD fra representative deler av mer enn 5 bilder av svulster.
Algoritmer for kvantifisering av fluoriserende spor perfusjon
For å kvantifisere den fluorescerende tracer opphopning i svulsten og bloduttredelse fra blodårene, brukte vi en enkel algoritme basert på global terskel segmentering og binære maskering teknikker som brukes på bildene ervervet i levende dyr. Ved terskel den Td-tomat fluorescens komponent, vi først lage et binært bilde, som brukes til å generere en maske for svulsten. Utvid og eroderer operasjoner brukes til å fjerne hullene og glatte ut kantene på denne masken. En lignende metode benyttes til å lage en vaskulatur maske på grunnlag av de høye intensitetsverdiene av FITC-dekstran eller albumin-647 signaler. De to masker blir deretter kombinert for å finne den ekstravaskulære komponent i tumorområdet, og dette resulterer masken blir brukt til å kvantifisere mengden av tracer fargestoff, som har migrert inn i tumoren.
Diskusjon
Resultater og
tumor temperatur module
Første testing av RF-IVM system inkludert eksponering av et 4T1 tumorbærende mus for RF-energi, uten bildebehandling, å bekrefte svulst oppvarming. Fig 3A viser eksperimentelle oppsettet. Musen ble plassert på en spesialdesignet Teflon trinn dekket med en tynn film av kobber tape for elektrisk å jorde dyr: å hindre overflate elektrisk ladning opphopning som kan forårsake termisk skade. Dyret lastet scenen var plassert mellom TX og RX hodene på p-RF system. Tre fiberoptiske termiske prober ble direkte innført i mus ved forskjellige posisjoner rundt svulsten og ved spesielle avstander fra TX hodet. Probe # 1 (nærmest hodet TX) ble innsatt under huden, men over tumormasse; probe # 2 ble innført under huden på mellom området hvor svulsten projiseres fra hoveddelen av mus; og probe # 3 ble satt inn over den eksponerte intraperitoneal hulrom. Gitt at vevet i nærheten probe # 1 vil sannsynligvis varme størst på grunn av sin nærhet til TX hodet, vi brukte dette som en referanse i å slå på og av RF-systemet på ulike temperaturpunkter: 45 ° C, 43 ° C og 41 ° C. vev Temperaturen ble kjølt ned til rundt ~ 30 ° C (på grunn av aircondition operasjonsstuen) mellom hver RF-stråling. Den totale kraften som trengs for å generere disse varme profilene var 90 W. Som vist i figur 3B, tumor temperatur innledningsvis øket fra 30 ° C til 45 ° C i ~ 250 s, tar ~ 375 s for å kjøle ned til 30 ° C. På dette punktet RF ble slått tilbake på og svulsten ble oppvarmet til 43 ° C før den ble slått av igjen. Dette ble gjentatt til en endelig tumor temperatur på 41 ° C. Temperatur data fra sonder # 1 # 3 viste en reduksjon i vev oppvarming på grunn av fall av i elektrisk feltstyrke fra TX hodet. Hvis det elektriske feltet skulle være konstant på tvers av TX og RX hoder, slik som den som nærmer seg tilstanden til en ideell parallell platekondensator modell, da eventuelle fluktuasjoner og variasjoner i temperatur vil mest sannsynlig tilskrives forskjeller i permittivitet og konduktivitet mellom vevene orgler, og tumorer i mus, slik det vil bli diskutert.
(A) Termisk fiberoptisk sonde plassering. Probes # 1-3 er plassert (i) under huden, men over tumoren; (Ii) under huden på mellom tumoren og hovedlegemet; og (iii) under huden ved siden av det intraperitoneale hulrom. (B) Hentet termisk sonde data. Den registrerte temperaturen av sondene ble modulert ved å slå på og av RF system (+ RF og-RF). Systemet ble slått av når svulsten temperatur (probe # 1) nådde 45 ° C, 43 ° C, og 41 ° C, henholdsvis, og ble slått på når alle probene hadde verdier i området ~ 29-31 ° C. (C) Et IR-kamera samtidig målte overflatetemperaturen til de punktene hvor de termiske prober ble plassert.
Den elektriske feltstyrke rundt tumoren samt tumorer «dielektriske egenskaper er kanskje de to mest viktige fysiske parametere som styrer oppvarming prisene i enkelte svulster. Dielektrisk i dette tilfellet refererer til hvor mye elektrisk energi et materiale vil absorbere og omdanne til varme, og er frekvensavhengig. En fersk publikasjon demonstrert anti-tumor effekter som følge av ikke-invasiv RF [1]. I sin studie, Raoof
et al
. utsatt mus med orthotopic-implantert human hepatocellulær og bukspyttkjertelen xenografter til ukentlige RF eksponeringer. Resultatene indikerte at RF-alene var tilstrekkelig til å forårsake en anti-tumor effekt i hepatocellulært karsinom og kunne forklares utelukkende på prinsippet av svulstene «dielektriske egenskaper er større enn normale, friske vev. Muligheten for et materiale til å lagre og spre elektrisk energi som varme kan beskrives ved den virkelige (
ε «
) og imaginære (
ε «
) deler av den komplekse permittiviteten funksjon (ε * ). Dette forholdet er gitt ved likning 1: (1) der
ω
er radial frekvens (
2πf
). Den virkelige Uttrykket i ligning 1 gir informasjon med hensyn til hvor mye elektrisk energi kan lagres i et materiale, mens den imaginære uttrykket angir hvor stor del av denne energi omdannes til varme.
I en ideell rent klinisk situasjon, den imaginære verdiene for tumorvev ville være betydelig høyere enn den til normale, friske vev, hvorved svulsten skulle varmes hurtig opp til temperaturen som induserer enten hypertermi (som fører til naturlige programmert celledød mekanismer) eller fullstendig ablasjon og nekrose. De dielektriske egenskaper av både kreft og normale vev ble målt ved Raoof
et al
. (Ved hjelp av en analysator permittivitet), og ble vist å være større for tumorer enn normale celler. Forholdet mellom materialets permitivitet og dens effekt på varmeproduksjonen når de utsettes for en tidsvarierende elektrisk felt er gitt ved den følgende ligning: (2) der
ε
0
er vakuum permittiviteten,
ε «
er den imaginære delen av komplekset permittiviteten,
E
er den elektriske feltstyrken i prøven,
ρ
er tettheten, og
c
p
den spesifikke varmekapasitet. I denne grunnleggende styrende ligningen, er alle de relevante fysiske variabler inneholdt som beskriver hvordan en prøve vil svare på eksponering for et elektrisk felt. Denne ligningen, særlig den sterke avhengighet av elektrisk feltstyrke, kan bidra til ytterligere å forklare den reduksjon i varmeproduksjonen.: De temperaturfølere er plassert lenger bort fra TX hode med den elektriske feltstyrken gradvis avtagende
I denne studie, overflatetemperaturen på de stedene hvor de termiske sondene befinner ble også tatt ved hjelp av et IR-kamera, som vist i fig 3C. Som man kan se, er det betydelige likheter og forskjeller i forhold til de termiske sondedata. IR-data indikerer en reduksjon i endelig temperaturen på vevet i forhold til sonden 1 måling av ~ 5 ° C, og en nedgang i temperatur på ~ 3 ° C for probe # 2. Temperaturene er lik for probe # 3. For å teste forskjeller og feilmargin mellom IR-kameraet og termiske sondedata ytterligere, ble alle tre sonder nedsenket i 1,3 ml PBS som inneholdes i en kvartskuvette og utsatt for RF-feltet. Temperaturen data er vist i figur 4. Det er en nær sammenheng mellom det innspilte IR-kamera og termiske sonden data med en feilmargin mellom 0,2-0,5 ° C. Denne likheten var ventet som kvarts kyvetten er nesten optisk transparent over IR bølgelengdeområdet 3,0 til 5,0 mikrometer den. Gitt de nære likheter mellom IR-kamera og termisk sonde data, forskjellene i mus oppvarming vist i figur 3 er mest sannsynlig på grunn av manglende samsvar mellom sonden plassering og IR markørposisjonen. For eksempel er posisjonen til sonden 1 er faktisk dypere under huden på mus enn probe # 3 (så vel som å være nærmere til tumor), så vil sannsynligvis vise større varmeproduksjonen på grunn av oppvarming av tumoren sammenlignet med den overflate IR kamera målinger. Også overflatemålinger er generelt sannsynlig å være lavere enn inter-vev temperaturer på grunn av den avkjølende effekt fra romtemperaturen miljø. Til slutt, optiske tap og absorpsjon av energi som forplanter seg IR gjennom huden vil sannsynligvis redusere intensiteten av IR fotoner på overflaten av musen, som blir detektert ved hjelp av IR-kameraet.
(A) Tre termiske prober var steder i en kvartskuvette fylt med fosfatbufret saltløsning (PBS) og utsatt for 200 W av RF. IR-kamera fanget overflatetemperatur på markøren poeng ligger ved term prober for RF-eksponeringstiden 0 s-380 s (B og C, henholdsvis). (D) Sammenligning av termisk sonde og IR-kamera oppvarming data.
Multi-kanal IVM-RF bildebehandling og høy temperatur fartøy degradering
Figur 5 viser real-time multi-kanal IVM-RF bildebehandling på en utsatt 4T1 svulst. Tre separate kanaler ble fotografert: FITC (fartøy med dekstran), Texas Red (4T1 transfektert svulst), og Cy5 (røde blodceller, røde blodceller). Fig 5A viser de fusjonerte kanaler, mens de enkelte kanalene er vist i figur 5B-5D. Fig 5E-5H viser endringer i fartøyets arkitekturen for fire forskjellige tidspunkter, er vist som tiden punkt 1 til og med 5 i fig 5I (NB: tidspunkt nummer 1 tilsvarer avbildning før tilsetningen av RF-eksponering). Også vist i fig 5I er det grafisk fremstilling av tumor temperatur og RF-effekt som funksjon av tiden. Tumor temperatur i dette tilfellet ble overvåket ved bruk av en temperaturføler plassert i tumoren. En tidspresset film av disse fusjonerte og individuelle kanaler kan bli funnet i S1 Movie.
(A) Overlegg av de uavhengige IVM kanaler (FITC, Texas Red, og Cy5). (B) Tumor fartøy fremheves ved hjelp av FITC-dekstran fluorescerende sporstoff, (C) Fluorescent utslipp fra transfekterte 4T1 tumorcellelinje, (D) Cy5 utslipp fra DID-farget røde blodlegemer. Figur (A) – (D) ble tatt ved tid = 78 s. Figur (E) – (H) skildrer FITC kanal (fartøy) på ulike tidspunkter: 762, 1650, 2382 og 2742 s, henholdsvis. Figur I viser tumor temperaturen med hensyn på tid og anvendt RF-effekt. Tallene 1-5 vises nederst på venstre side av hver figur tilsvarer de 5 forskjellige tidspunkter uthevet i Figur I.
Som det fremgår av disse resultatene, svulsten fartøy begynner å smal og innsnevre en gang tumoren temperaturen heves over 41 ° C. På et endelig svulst temperatur på 44 ° C, den intravaskulære cellene er helt stillestående og karene har sluttet å fungere. Dette kan også sees i S1-film med hensyn til strømningen av røde blodceller. Når temperaturen er hevet over 41 ° C strømningen av RBC blir uregelmessig, og det er noen fartøyet avdelinger hvor blodstrømmen har opphørt fullstendig. Legg merke til, med hensyn til de tidspunkter hvor RF-effekten ble intermittent avsluttet for å hindre overoppheting av tumoren. Bruken av en rampeoppvarmingsprofil gjør det mulig å skreddersy av strømmen når den angitte temperatur er nådd, slik at en nøyaktig innstilte temperaturen kan opprettholdes. Dette kan sees fra tidspunktene 2 og 3, hvor kraften raskt reduseres deretter gradvis øket for å tillate en mer skånsom varmeprofil.
En gjentagelse av dette forsøk (men uten RBC-farging) er vist i figur 6. virkningen av fartøyet degradering er mer uttalt i disse bildene. Ved å se på de fire forskjellige tidspunkter kan det ses at noen lavt nivå av fartøyet degradering er innlysende for temperaturer mellom 41,5 til 41,8 ° C (vi holdt dette temperaturområdet i ~ 10 minutter). Etter dette, ved anvendelse av flere RF-effekt, den økning i tumorvarmeproduksjonen (opp til ~ 49 ° C) resulterte i en alvorlig degradering og fullstendig stans av tumorkarene. En full film av disse effektene kan sees i S2 Movie. Resultatene er vist i figurene 5 og 6 illustrerer virkningen av høye temperaturer på fartøyet arkitektur og RBC strømningsdynamikken. Selv om det er velkjent at fartøyet kan det oppstå skade for temperaturer høyere enn 41 ° C, har det blitt demonstrert at forbedret kar permeabilitet og perfusjon av sirkulerende makromolekyler, kjemoterapeutika og narkotika kan forventes for temperaturer over området 39 ° C-41 ° C (det henvises til oversiktsartikkel av Roussakow tilbyr en omfattende og konsis oversikt over feltet [33])
(A) – (D) Effekt av RF eksponering på fartøy arkitektur på fire forskjellige tidspunkter. 0 : 22, 6:53, 16:18, og 20:31 minutter, henholdsvis. Tumor temperaturer og RF-effekt på disse tidspunktene er vist i de øvre-midtre og øvre høyre seksjoner, henholdsvis. Figur (E) illustrerer forandringen i temperatur og effekt med hensyn til tid. Vessel degradering kan sees for temperaturer 41 ° C. En fullstendig sammenbrudd av fartøyet arkitektur kan ses for temperaturer 47 ° C.
RF-indusert fluorescens tracer transport og perfusjon i 4T1 svulster
Mus med 4T1 tumorer ble kirurgisk forberedt for RF-IVM som beskrevet i metodedelen. Mus mottok intravenøse injeksjoner av 50 ul albumin-Alexa-fluor 647 fargestoff (10 mg /kg) via retro-orbital injeksjon og avbildes med og uten RF (som en kontroll). For alle forsøkene RF ble slått av når tumoren temperaturen nådde 41 ° C (med mindre annet er angitt) som antydet med IR-kamera. Figur 7A-7D viser perfusjon av albumin tracer ut av blodkarene og inn i tumoren i løpet av en RF-behandlingsperiode på 4,5 minutter. Forbedret svulst perfusjon er spesielt tydelig når man sammenligner figur 7A og 7B for start- og sluttpunktene (0 og 4,5 minutter, henholdsvis) for albumin bare (blå) kanal. Den komplette videofiler (redigert for å fjerne bildet jitter på grunn av mus respirasjon) er i S3 og S4 filmer. For en kontroll ble det samme eksperiment avbildes uten RF-eksponering (figur 7E) i 30 minutter. Nedsatt perfusjon barrieren er tydelig som ikke albumin å trenge inn i tumoren i løpet av avbildnings sesjon (30 min, figur 7E). Dette nedsatt perfusjon er karakteristisk for tumorer på grunn av høyt trykk, kaotisk vaskulaturen, og den resulterende tumor fartøyet kompresjon [34, 35]. Begrenset vaskulær perfusjon ble observert i flere mus under bildebehandling økter som varer opp til en time.
RF eksponering viser transport av fluorescens bundet albumin over perfusjon barriere i tumor regionen. Figur (A) og (B) viser den blå bildekanalen (albumin) før og etter (4,5 min) RF-eksponering. Disse dataene er vist overlagret med tumor (rød) kanalen i Figur (C) og (D). Figur (E) Kontroll mus (ingen RF) ble fotografert i 30 minutter på begge kanaler. Det er ingen transport av albumin inn i tumoren på tvers av perfusjon barriere. (F) Forløpt tid bilder av dataene vist i figur (A) og (B).
