Abstract
Innledning
Bruk av 5-alfa reduktase hemmere (5-Aris) finasterid og dutasterid for forebygging prostatakreft er fortsatt under debatt. FDA har nylig konkludert med at den økte utbredelsen av høyverdig svulster blant 5-ARI-behandlede pasienter ikke skal bli neglisjert, og de bestemte seg for å forby bruk av 5-Aris for forebygging prostatakreft. Denne studien ble gjennomført for å verifisere effekten av finasterid på prostata celle migrasjon og invasjon og de relaterte enzymer /proteiner i normal menneskelig og tumorprostatacellelinjer.
Materialer og metoder
RWPE-en, LNCaP, PC3 og DU145 cellene ble dyrket til 60% konfluens og utsatt for ulike perioder til enten 10 mm eller 50 M finasterid som ble fortynnet i dyrkingsmedium. De kondisjonerte medier ble oppsamlet og konsentrert, og MMP2 og MMP9 aktiviteter og TIMP-1 og TIMP-2-proteinekspresjon ble bestemt. Celleviabilitet, migrering og invasjon ble analysert, og de gjenværende celleekstrakter ble sendt til androgen reseptor (AR) deteksjon ved Western blotting-teknikker. Forsøkene ble utført i tre eksemplarer.
Resultater
Celleviabilitet ble ikke signifikant påvirket av finasterid eksponering. Finasteride betydelig nedregulert MMP2 og MMP9 aktiviteter i RWPE-en og PC3 celler og MMP2 i DU145 cellene. TIMP-2-ekspresjon i RWPE-1-celler ble oppregulert etter eksponering. Den celle invasjon av alle fire testede cellelinjer ble hemmet ved eksponering av 50 uM av finasterid, og migrering hemming bare skjedd for RWPE-1 og LNCaP-celler. AR ble uttrykt av LNCaP, RWPE-en og PC3 cellene.
Konklusjoner
Selv om debatten om høyere forekomst av høyverdig prostatakreft blant 5-ARI-behandlede pasienter gjenstår, våre funn indikerer at finasterid kan dempe tumor aggressivitet og invasjon, som kan variere avhengig av androgen respons av pasientens prostata celler
Citation. Moroz A, Delella FK, Almeida R, LaCorte LM, Favaro WJ, Deffune E, et al. (2013) Finasterid hemmer Menneskelig Prostate Cancer Cell Invasion gjennom MMP2 og MMP9 Nedregulering. PLoS ONE 8 (12): e84757. doi: 10,1371 /journal.pone.0084757
Redaktør: Lucia R. Languino, Thomas Jefferson University, USA
mottatt: 25 januar 2013; Godkjent: 27 november 2013; Publisert: 30.12.2013
Copyright: © 2013 Moroz et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av en FAPESP (Forskningsrådet for staten São Paulo) finansiering (prosess n. 2010 /16671-3) og en CAPES Ph.D. stipend. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft er den vanligste kreftformen hos menn og står for $ 8000 millioner og en gjennomsnittlig pris på $ 81 658 per pasient, fra diagnose til død, i USA [1]. Et antall midler er for tiden under undersøkt for forebygging av prostatacancer [2]. Finasterid, en type 2 5-alfa-reduktase-inhibitor (5-ARI) som blokkerer omdannelsen av testosteron (T) til dihydrotestosteron (DHT) [3], er et velkjent stoff som brukes til behandling av benign prostatahyperplasi [ ,,,0],4] og har vært foreslått å virke som en Kjemopreventivt middel for prostatacancer. The Prostate Cancer Prevention Trial (PCPT) viste en 24,8% reduksjon i samlet og lav grad av prostatakreft risikoen med administrasjon av finasterid. Men høy grad av kreft ble registrert hos 6,4% av finasterid-behandlede pasienter, sammenlignet med 5,1% av mennene som fikk placebo [5], [6]. Dette funnet førte til et viktig spørsmål: fikk finasterid indusere høyverdig kreft eller øke sin oppdagelse? Dette spørsmålet ble etterfulgt av en intens debatt om faktiske eller kunstig overvurdering av høy grad av saker i finasterid behandlede pasienter [3], [7], som delt urologer og prostata forskere. Mer nylig REDUSERE rettssaken rapporterte lignende resultater etter fem-ARI dutasterid behandling. Som erkjenner betydningen av dette problemet, har Food and Drug Administration (FDA) har nylig reanalysert data fra PCPT og redusere studier og konkluderte med at finasterid og dutasterid behandlinger kan øke risikoen for en mer alvorlig form for prostatakreft. Derfor bestemte de seg for å forby bruken av disse midlene for å forebygge prostatakreft [8]. I tillegg er en nylig publisert eksperimentell studie viste lignende resultater til PCPT og redusere forsøk [9]. Forfatterne demonstrerte at forekomsten av dårlig differensiert karsinom ble øket i C57BL /6 x TRAMP FVB mus foret med en diett supplert finasterid, og betraktes dette som en bivirkning av finasterid behandling, i stedet for en kunstig effekt [9].
Høy grad av prostatakreft tilfeller, for eksempel de som ble observert i de fem-ARI-behandlede pasienter, er ofte forbundet med økt uttrykk av matrix metalloproteinaser (MMP), en familie av sink og kalsium avhengige endopeptidaser som er ansvarlig for ekstracellulært matriks (ECM) remodeling, noe som bidrar til invasive og metastatiske fenotyper av prostatacancerceller [10] – [13], og redusert ekspresjon av tissue inhibitor of matrix metalloproteinases (TIMPs) [13], en klasse av naturlig forekommende inhibitorer av MMP’er som tett regulere deres aktivitet og uttrykkes i en rekke celletyper [11].
Fordi ECM degradering er kjent for å være et viktig skritt i løpet av kreft progresjon [10], [12], [13], vår gruppe har undersøkt effekten av finasterid på MMP og TIMP modulasjon i et forsøk på å forklare hvorfor finasterid-behandlede pasienter hadde høyere grad av prostatakreft. Vi har tidligere demonstrert at finasterid behandling økte ekspresjon av MMP9 og redusert ekspresjon av MMP2 i rotte ventrale prostata [14], [15], og at det downregulated mRNA nivåene av TIMP-1 og TIMP-2 i rotte ventral prostata [ ,,,0],15]. Dessuten har vi nylig demonstrert at finasterid reduserer også MMP2 gelatinolytisk aktivitet i en rekke menneskelige prostata cellelinjer [16]. Vi har utført den foreliggende undersøkelse for å fastslå om finasterid behandling forstyrrer overføringen og invasiv potensialet av den normale humane prostatacellelinje RWPE-1 og de tumorale epiteliale cellelinjer LnCap, PC3 og DU145, som har forskjellig androgenreseptoren (AR) profiler.
Materialer og metoder
cellekulturer
Ett hetteglass hver av de RWPE-en (ikke-tumor, vill type AR
+), LNCaP (tumor, mutert AR
+) og PC3 (tumor, AR
-) cellelinjer ble kjøpt fra American Type Culture Collection (ATCC ™). DU145 (tumor, AR
-) celler var velvillig donert av Dr. Heloisa Sobreiro Selistre de Araújo fra Institutt for fysiologi – UFSCar, Brasil (opprinnelig kjøpt fra ATCC ™). Selv om det ikke er isogene, ble disse cellelinjene er valgt for å være representative for 3 forskjellige vivo finasterid eksponeringssituasjoner i: en pasient med en normal prostata (representert in vitro ved RWPE-1-cellelinje), en pasient med androgen-sensitive prostatacancer (representert in vitro ved LNCaP-cellelinjen) og en pasient med kastrering resistent prostatakreft (representert in vitro ved PC3 og DU145 cellelinjer). Forsøkene ble utført to måneder etter oppkjøpet av cellelinjene. De RWPE-1-celler ble dyrket ved bruk av keratinocytt Serum Free Medium (Invitrogen ™) supplert med 0,05 mg /ml bovint hypofyseekstrakt, 5 ng /ml rekombinant, human epidermal vekstfaktor (EGF) og 1% antibiotisk /antimykotisk oppløsning (Invitrogen ™). De LNCaP, PC3 og DU145-celler ble dyrket ved bruk av RPMI-medium (Invitrogen ™) supplert med 10% føtalt bovint serum (SFB) (Invitrogen ™) og 1% antibiotisk /antimykotisk oppløsning (Invitrogen ™). Alle cellekultur prosedyrer ble utført under strenge sterile forhold og holdt inne i en 5% CO
2 inkubator (Thermo Scientific ™). Den innledende ampulle hver cellelinje ble utvidet til 10 ampuller og individuelt oppbevart i de respektive cellekulturmedium supplert med 20% FBS og 10% dimetylsulfoksyd (DMSO) (Sigma-Aldrich ™) for å utgjøre den cellebanken.
Finasteride eksponering og celleviabilitet
Alle cellelinjer ble så tint og individuelt sådd ved 2 × 10
4 celler /cm
2 i seks-brønns kulturplater (TPP ™). Forsøk ble utført i tre eksemplarer. Finasteride konsentrasjoner ble valgt på grunnlag av en tidligere studie, hvor 10 mikrometer og 50 mikrometer indusert betydelig metabolske modulasjon på prostata tumorceller [17]. Ved å nå 60% konfluens ble cellene vasket tre ganger med sterilt D-PBS (GIBCO /Invitrogen ™), og den anbefalte kulturmedium (FBS fri) ble tilsatt som følger: 1) kontrollbehandling – supplert med 0,1% DMSO; 2) finasterid behandling lavdose – supplert med 0,1% DMSO pluss 10 uM finasterid (Sigma ™); og 3) finasterid behandling med høy dose – supplert med 0,1% DMSO pluss 50 M finasterid (Sigma ™). Finasterid ble fortynnet i DMSO og DMSO /finasterid oppløsning ble fortynnet i kulturmedium. Under alle finasterid eksponerings behandlinger, ble cellene observert under et fasekontrast invertert mikroskop (Zeiss ™) for generell morfologi og bakterie- og soppforurensning. Etter 24, 48 og 72 timer etter eksponering, ble det kondisjonerte medium (CM) oppsamlet og individuelt lagret ved -80 ° C. De gjenværende festede celler ble individuelt hentes ut med trypsin fordøyelse, og en prøve ble bedømt for levedyktighet ved Trypan blå farging. De gjenværende celler ble individuelt sentrifugert ved 1200 rpm i 10 minutter for å oppnå en celle-pellet for å produsere proteinekstrakter. FBS ble fjernet under finasterid eksponering fordi den er kjent for å inneholde høye nivåer av MMP, noe som ville forstyrre de påfølgende gelatinolytisk analyser.
Betinget Medium og Cell Extract Processing
CM ble konsentrert 10X bruker
Centriprep® 10 000 MWCO (Millipore ™) rør ved sentrifugering ved 4900 RPM i 30 minutter. De respektive cellepelletene ble sendt til protein ekstraksjon ved hjelp av en in-house-produsert 50 mM Tris-HCl, 0,2 M NaCl, 10 mM CaCl
2, 0.1% Triton X-100 proteinekstraksjon buffer supplementert med 1% protease inhibitor cocktail (Sigma-Aldrich ™) for å oppnå celleekstrakter. Proteinet ekstraksjonsbuffer ble valgt etter sammenligning med et kommersielt tilgjengelig buffer (RIPA-buffer, Thermo Scientific ™), som viste bedre bevart MMP gelatinolytisk aktivitet ved zymografi (data ikke vist). Protein ekstraksjon ble foretatt ved gjentatt pipettering og virvling, etterfulgt av en times hvile på is, og en endelig sentrifugering ved 5000 RPM i 20 minutter ved 4 ° C. Til slutt ble cm og proteinekstrakter sendes til protein kvantifisering ved hjelp av et Nanodrop 2000 (Thermo Scientific ™) spektrofotometer, og Protein A 280/260-protokollen. Det er viktig å understreke at CM var FBS gratis; Derfor ble alle proteiner i CM produsert av cellene.
MMP2 og MMP9 aktivitetsanalyser
Den totale (pro-skjema + aktiv form) MMP2 og MMP9 aktiviteter i CM og celleekstrakter ble målt ved hjelp av Biotrak® aktivitetsanalyser (GE Healthcare Lifesciences ™) i henhold til produsentens retningslinjer. Kort beskrevet ble like mengder (100 ug) av oppsamlet CM eller celleekstrakt (per triplo behandling) pipetteres inn i en 96-brønners mikroplate belagt med anti-human-MMP2 eller anti-human-MMP9 antistoffer. Standarder for humant rekombinant pro-MM2 eller pro-MMP9 ble pipettert inn i de respektive brønner, med verdier fra 0,19 til 3 ng /ml (for MMP2) og 0,125 til 4 ng /ml (for MMP9) som instruert av produsenten. Etter en inkubering over natten ved 4 ° C og vasking, 50 ul av en 0,5 mM p-aminophenylmercuric acetat (APMA) oppløsningen ble pipettert inn i alle brønner for å aktivere pro-formene av MMP2 og MMP9. Deretter ble 50 ul av en deteksjonsreagensen (modifisert urokinase + S-2444 ™ peptid-substrat) ble tilsatt til alle brønner. Platene ble inkubert ved 37 ° C i 6 (for MMP2) eller 2 timer (for MMP9), og integrert optisk tetthet (IOD) ble målt ved 405 nm ved anvendelse av en spektrofotometrisk plateleser. Til slutt ble en fold-endring grafisk laget ved å dividere de oppnådde IODs fra de behandlede CM /ekstrakter ved deres respektive kontrollverdier. Alternativt ble MMP2 og MMP9 aktivitet vurdert ved anvendelse av standard gelatin zymografi, som tidligere beskrevet [16].
TIMP-1 og TIMP-2 Protein Kvantifisering
TIMP-1 og TIMP-2- proteinnivåer i CM ble målt ved anvendelse av fastfase-ELISA Biotrak® Humant Assays (GE Healthcare Lifesciences ™) i henhold til produsentens retningslinjer. Kort beskrevet ble like mengder (100 ug) av oppsamlet CM (per triplo behandling) pipetteres inn i en 96-brønners mikroplate belagt med anti-human-TIMP-1 eller anti-human-TIMP-2-antistoffer. Standarder for human rekombinant TIMP-1 og TIMP-2, ble pipettert inn i de respektive platebrønnene, med verdier i området fra 3,13 til 50 ng /ml (for TIMP-1) og 8 til 128 ng /ml (for TIMP-2). Etter en 2 timers inkubasjon ved 25 ° C og vasking ble 100 ul av en peroksidase konjugat løsning pipettert inn i alle brønnene, og platene ble ytterligere inkubert i 2 timer ved 25 ° C. Deretter ble 100 ul av en tetrametylbenzidin (TMB) /hydrogenperoksyd-løsning tilsatt til alle brønner. Platene ble inkubert ved romtemperatur i 30 minutter, og den IOD ble målt ved 630 nm ved anvendelse av en spektrofotometrisk plateleser. Til slutt ble en fold-endring grafisk gjort ved å dele de oppnådde IODs fra de behandlede behandlinger av sine respektive kontrollverdier.
Migrasjon analysen
migrasjon potensialet i alle cellelinjer ble undersøkt ved hjelp av BD BioCoat ™ Migration Sett (BD Biosciences ™). Den porøse membran (8 um porestørrelse) ble hydratisert med 500 ul serumfritt bikarbonat basert medium i 2 timer. Etter hydrering, 500 ul av RPMI 1640 medium med 5% FBS (for LNCaP, PC3 og DU145-celler) ble eller 500 pl av keratinocytt-medium med 5% FBS (for RWPE-1 celler) tilsettes til det nedre kammer i den 24-brønners tallerken. Disse prostata cellelinjer ble tidligere dyrket i 50 pM finasterid medium eller kontrollmedium i 72 timer, høstet og individuelt dyrket i 200 ul serumfritt medium (med eller uten 50 uM finasterid) i innsatsen i en tetthet på 1 x 10
5 totalt celler. Platene ble inkubert med 5% CO
2 ved 37 ° C i 22 timer i henhold til produsentens retningslinjer. Cellene som ikke vandrer, som ble plassert på toppen av innsatsen membranen, ble skrapt av med en bomullspinne. Cellene som migrerte gjennom membranporene, som ble tiltrukket av FBS, ble fiksert i 100% metanol og farget med 0,1% toluidinblått løsning i 2 minutter. De migrerte celler ble digitalt fotografert etter 200X forstørrelse ved hjelp av et lysmikroskop (Nikon ™). Forsøkene ble utført in triplo, og 5 tilfeldige feltene ble fotografert og underkastet celle telling ved hjelp av ImageJ® fri programvare. Migrasjonen indeksen ble beregnet som gjennomsnittet ± SD av celler telles per-felt, og kontrollceller ble sammenlignet med finasterid-behandlede celler. Menneskelig hud fibroblaster (WS1- ATCC) ble ansatt som positive kontroller og ble utsatt for de samme analyse vilkår som prostataceller.
Wound Healing analysen
Cell migrasjon ble videre undersøkt med en annen migrasjon analyse for PC3 og DU145 cellelinjer som ble dyrket i 6-brønners plater på 4 x 10
4 celler /cm
2 til 100% konfluens ble oppnådd. Monolagene ble såret (riper) i en rett linje tvers over brønnen med en 200 ul pipettespiss med en steril, 6-brønners kulturplate lokk som en linjal, for å oppnå en vanlig ripe. De sårede monolagene ble deretter vasket to ganger med D-PBS (GIBCO /Invitrogen ™) for å fjerne celleavfall. Kulturmedium med eller uten 50 uM av finasterid ble tilsatt til kontroll- og behandlingsbrønnene. Sårområdet ble deretter inspisert etter 24, 48, 72 og 96 timer ved bruk av et invertert fasekontrastmikroskop med digitalt kamera. Den sårtilheling hastighet ble beregnet som prosent av det opprinnelige såret inntil total lukking av sår på forskjellige tidspunkter med ImageJ® fri programvare.
Matrigel invasjonen Analyse
invasive potensialer av alle fire cellelinjer ble undersøkt ved hjelp av BD BioCoat ™ Matrigel ™ Invasion Setter (BD Biosciences ™). Matrigel-belagte porøs membran (8 um porestørrelse) ble hydratisert med 500 ul serumfritt bikarbonat basert medium i 2 timer. Etter hydrering, 500 ul av RPMI 1640 medium med 5% FBS (for LNCaP, PC3 og DU145-celler) ble eller 500 pl av keratinocytt-medium med 5% FBS (for RWPE-1 celler) tilsettes til det nedre kammer i den 24-brønners tallerken. Disse prostata cellelinjer ble tidligere dyrket i 50 pM finasterid medium eller kontrollmedium i 72 timer, høstet og individuelt dyrket i 200 ul serumfritt medium (med eller uten 50 uM finasterid) i innsatsen i en tetthet på 1 x 10
5 totalt celler. Platene ble inkubert i en inkubator med 5% CO
2 ved 37 ° C i 22 timer, i henhold til produsentens retningslinjer. De uninvaded celler på toppen av innsatsen membranen ble skrapt av med en bomullspinne. Cellene som invaderte Matrigel matrise og overført til den motsatte side av membranen, som var tiltrukket av FBS, ble fiksert i 100% metanol og farget med 0,1% toluidinblått løsning i 2 minutter. Den invaderte Cellene ble fotografert digitalt i henhold til 200X forstørrelse ved hjelp av et lysmikroskop (Nikon ™). Forsøkene ble utført in triplo, og 5 tilfeldige feltene ble fotografert og underkastet celle telling ved hjelp av ImageJ® fri programvare. Invasjonen indeksen ble beregnet som gjennomsnittet ± SD av celler telles per-felt, og kontrollceller ble sammenlignet med finasterid-behandlede celler.
Western blotting
De gjenværende celleekstrakter ble anvendt for å bestemme AR uttrykk nivåer. Denne bestemmelse ble utført på grunn av den avvikende litteratur på ekspresjonen av disse reseptorene fra disse cellelinjene. I korthet ble en proteinprøve (70 ug) som tidligere var blitt kvantifisert ved hjelp av Nanodrop 2000 (Thermo Scientific ™) spektrofotometer applisert på en 10% SDS-PAGE-gel under reduserende betingelser. Proteinene ble overført på en nitrocellulosemembran (Sigma Co. ™), som deretter ble blokkert med 5% bovint serumalbumin (BSA) i 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl og 0,1% Tween-20 (TBS- T) i 1 time. Membranene ble deretter inkubert ved 4 ° C over natten med AR (Genetex ™) antistoff. Membranene ble vasket 5 ganger i 5 minutter i TBS-T og inkubert i 2 timer ved romtemperatur, med de riktige, peroksydase-konjugerte sekundære antistoffer (Abcam ™). Etter vasking i TBS-T ble membranene visualisert ved hjelp av 3,3′-diaminobenzidin og fotograferte.
Statistical Analysis
De oppnådde data ble analysert ved hjelp av INSTAT ™ programvaren ved hjelp av to-tailed student T-test (P 0,05) å sammenligne de ulike behandlinger og deres respektive kontroller (levedyktighet, migrasjon, invasjon), eller ved hjelp av ANOVA og Dunnet innlegg hoc test (MMP og TIMPs analyser)
Resultater
.
Finasteride eksponering og celleviabilitet
Celleviabilitet ble ikke signifikant påvirket av noen av de finasterid doser som var ansatt i denne undersøkelsen. Celler ikke presentere aspekter av celledød eller tap av levedyktighet, selv etter 72 timer med 50 M finasterid eksponering (figur S1).
MMP2 og MMP9 aktivitetsanalyser
I kontrollforhold, var det observert at PC3-celler utskilt dobbelt så mye MMP2 og MMP9 inn i deres CM som RWPE-1 celler (IOD verdier – data ikke vist). LNCaP-celler ikke utskiller påvisbare nivåer av MMP2 eller MMP9 inn i deres CM (IOD verdier data – ikke vist). Imidlertid DU145 cellene utskilte store mengder av MMP2 og MMP9 (Figur 1a). For celleekstrakter, ga ikke noe cellelinje detekterbare MMP2 eller MMP9 aktiviteter, noe som viser at disse cellelinjene ikke holder MMP’er ved sin membran (data ikke vist).
a) Kondisjonert medium (CM) av ubehandlet (kontroll ) og finasterid-behandlede DU145-celler ble oppsamlet, konsentrert og analysert for MMP2 og MMP9 aktiviteter ved bruk av en gelatin zymografi assay. (S) Standarder, (P) Tissue ekstrakt av en magesår som ble anvendt som en positiv kontroll. Disse cellene utskilte store mengder av MMP2 og MMP9 inn i deres CM, som vist ved de lyse bånd på mørk bakgrunn. b) Høy dose finasterid (50 mm) downregulated MMP2 aktivitet opp til 43% etter 72 timers eksponering, som kvantifiseres ved hjelp av ImageJ ™. Data er uttrykt som en fold-endring grafisk av IOD verdiene som ble hentet fra band i (a) tall for finasterid-behandlede celler enn kontrollceller. (**) Statistisk signifikante verdier med p 0,01. Forsøk ble utført i tre eksemplarer.
Ved finasterid eksponering, ble det observert at, for RWPE-1-celler ved den anvendte lave dosen (10 uM), 72 timers eksponering var tilstrekkelig til å indusere betydelig nedregulering av både aktiviteten av både MMP i CM (figur 2a); Disse verdiene ble redusert med 25% og 30% for MMP2 og MMP9, henholdsvis, i forhold til kontrollverdiene. På den annen side, for den anvendte finasterid høy dose (50 uM), den MMP2 og MMP9 aktiviteter ble signifikant nedregulert ved alle tidspunkter som ble testet, opptil 90% og 55% etter 72 timers eksponering, henholdsvis (figur 2a) .
a) Kondisjonert medium av ubehandlet (kontroll) og finasterid behandlet RWPE-1 celler ble samlet, konsentrert og analysert for MMP2 og MMP9 aktiviteter ved hjelp av sine respektive Biotrak® aktivitetsanalyser. Lavdose finasterid (10 uM) i 72 timer med eksponering downregulated MMP2 og MMP9 aktiviteten med 25% og 30%, respektivt, sammenlignet med kontrollverdier. Høy dose finasterid (50 uM) downregulated MMP2 og MMP9 virksomhet ved alle testede tidspunkter, opptil 90% og 55% etter 72 timers eksponering, henholdsvis. b) Kondisjonert medium av ubehandlet (kontroll) og finasterid-behandlede RWPE-1-celler ble samlet opp, konsentrert og analysert for TIMP-1 og TIMP-2-protein ekspresjon ved hjelp av sine respektive Biotrak® Assays. Finasteride eksponering, ved begge doser, indusert oppregulering av TIMP-2 uttrykk ved 72-timers tidspunkt, opp til 150% mer uttrykk enn kontrollnivåer. Data er uttrykt som en fold-endring grafisk av IOD verdiene som ble oppnådd for finasterid-behandlede celler enn de for kontrollcellene. (*) Statistisk signifikante verdier med p. 0,05
I PC3 cellelinje, lav dose finasterid eksponering indusert betydelig nedregulering av MMP2 og MMP9 aktiviteter på bare 24 timers tidspunkt (Figur 3a ). På den annen side, høydose finasterid betydelig indusert nedregulering av MMP2 på 48 timers og 72 timers tidspunkter og MMP9 på alle tidspunkter som ble vurdert, med opp til 70% reduksjon (figur 3a).
a) Kondisjonert medium av ubehandlede og finasterid behandlet PC3 cellene ble samlet, konsentrert og analysert for MMP2 og MMP9 aktiviteter ved hjelp av sine respektive Biotrak® aktivitetsanalyser. Low-dose finasterid eksponering (10 mm) induserte ikke den nedregulering av MMP2 eller MMP9 aktiviteter, bortsett fra på 24-timers tidspunkt. Høy dose finasterid indusert nedregulering av MMP2 på 48 timers og 72 timers tidspunkter og MMP9 i det hele tatt vurderes tidspunkter, opp til 70% reduksjon. b) Kondisjonert medium av ubehandlet (kontroll) og finasterid-behandlede PC3-celler ble oppsamlet, konsentrert og analysert for TIMP-1 og TIMP-2-protein ekspresjon ved hjelp av sine respektive Biotrak® Assays. Finasterid eksponering fremkalte ikke noen vesentlig modulering av TIMP-1 og TIMP-2-ekspresjon, bortsett fra 10 pM finasterid dose etter 24 timers eksponering. Data er uttrykt som en fold-endring av IOD verdiene oppnådd for finasterid behandlede celler enn kontrollceller. (*) Statistisk signifikante verdier med p. 0,05
Gitt at resultatene fra de andre cellelinjer viste at bare high-dose finasterid utøves effekter på MMP aktivitet, bare den høye dosen på 72 timer ble undersøkt for DU145 cellelinje. For DU145 cellelinje, høydose finasterid induserte en betydelig nedregulering av MMP2 aktiviteter på ca 43% (Figur 1b) (p 0,01). Men MMP9 aktiviteter ble ikke signifikant modulert av finasterid eksponering (Figur 1b).
TIMP-1 og TIMP-2 Protein Kvantifisering
Når cellelinjene ble dyrket uten finasterid, PC3 celler produseres to ganger mer TIMP-1 enn de RWPE-1 celler; imidlertid, mengden av TIMP-2 var de samme (IOD verdier). LNCaP-celler produserte lave nivåer av TIMP-1 og TIMP-2 som nærmer seg nedre påvisningsgrensen for analysen (IOD verdier). DU145-celler produserte store mengder av TIMP-1 (IOD verdier – data ikke vist)
Ved finasterid eksponering av de testede RWPE-1 cellelinjen, begge dosene betraktelig indusert oppregulering av TIMP-2-ekspresjon i 72 timer. tidspunktet, som var opp til 150% mer uttrykk enn kontrollbehandling (figur 2b). Som for PC3-celler, TIMP-1 og TIMP-2 ekspresjon viste ingen signifikant modulasjon, med unntak av 10 pM finasterid dose etter 24 timers eksponering (figur 3b). Finasteride fremkalte ikke noen vesentlige endringer i uttrykket av TIMP-1 eller TIMP-2 i LNCaP eller DU145 cellelinjer (data ikke vist).
Migrasjon analysen
I vanlig kulturmedium, testede cellelinjer utstilt forskjellige migrasjons potensialer. RWPE-1 celler migrert mer (middelverdi av 32 celler /felt) enn PC3-celler (gjennomsnitt av 24 celler /felt), som, i sin tur, migrerte mer enn LNCaP-celler (gjennomsnitt av 8 celler /felt). DU145 var den mest migrerende cellelinje undersøkt (gjennomsnitt av 85 celler /felt) (figur 4). Etter 72 timer med finasterid eksponering (50 mm), ble migrasjon hemmet betydelig i RWPE-1 celler (p 0,01) og LNCaP celler (p 0,05). PC3 og DU145 cellemigrasjon ble litt hemmet; men inhiberingen var ikke signifikant (p 0,05) (figur 4). Menneskelig WS1 fibroblaster (positiv kontroll) migrert raskt gjennom membraner (figur 4).
prostatacellelinjer ble tidligere dyrket i 50 M finasterid eller kontrollere medium i 72 timer og individuelt dyrket i 200 ul serumfritt medium (med eller uten 50 uM finasterid) i migrasjons innsatsen ved en tetthet på 1 x 10
5 totale celler. Etter 22 timer ble cellene som migrerte inn i 8 um porøse membranen fiksert, farget og tellet i løpet av fem tilfeldige felt ved hjelp av et lysmikroskop. Forsøk ble utført in triplo. Representative mikrofotografier av ubehandlede og finasterid-behandlede celler er vist på venstre side. Humane fibroblaster (WS1 cellelinje) ble ansatt som migrasjons positive kontrollceller, og en representant bildet vises nederst til venstre. Scale bar = 40 mikrometer. Finasteride vesentlig hemmet cellemigrering av de RWPE-1 og LNCaP-cellelinjer, men ikke i den PC3 og DU145 cellelinjer. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SD av de migrerende celler. (*) Statistisk signifikante verdier med p 0,05. (**) Statistisk signifikante verdier med p. 0,01
Wound Healing analysen
For å bekrefte at PC3 og DU145 cellelinje migrasjon potensialer ikke ble påvirket av finasterid eksponering, en annen migrering analysen ble utført for disse cellelinjene. Etter sårområdet ble påført monolagene, var det mulig å observere at for begge cellelinjer, finasterid svakt hemmet cellemigrering (figur 5a og 5c); men denne forskjellen var ikke signifikant (figur 5b og 5d), noe som bekreftet de resultater som ble oppnådd fra den foregående migreringsinnsatsen analysen (figur 4).
Celler ble dyrket i 6-brønners plater på 4 x 10
4 celler /cm
2 til 100% samløpet ble oppnådd. Monolagene ble skrapet i en rett linje, og de sårede monolagene ble deretter gitt kulturmedium med eller uten 50 uM finasterid. Såret området ble inspisert etter 24, 48, 72 og 96 timer ved hjelp av en omvendt fase kontrast mikroskop med et digitalt kamera. a) Representative bilder som viser den til lukking av sår av finasterid-behandlede og kontroll PC3-celler ved 0 til 72 timer. Red uthevet områder representerer åpne sår området. Scale bar = 50 mikrometer. b) Den opprinnelige røde uthevede områder ble målt ved anvendelse av ImageJ ™ -programvare, og de resterende områdene ble beregnet som en prosent av det opprinnelige sårområdet. Et sår-lukke grafisk ble fremstilt ved å dividere arealverdier som ble oppnådd ved de angitte tidspunkter for kontroll og finasterid-behandlede celler. Finasteride litt hemmet celle migrasjon; men denne forskjellen var ikke statistisk signifikant (p 0,05). c) Representative bilder som viser den til lukking av sår av finasterid-behandlede og kontroll DU145-celler ved 0 til 72 timer. Red uthevet områder representerer det åpne såret området. Scale bar = 50 mikrometer. d) Som observert for PC3 cellene, finasterid litt hemmet celle migrasjon (p . 0,05)
Matrigel invasjonen analysen
I vanlig dyrkingsmedium, cellelinjene utstilt forskjellige invasjon potensialer . DU145 og PC3-celler var de mest invasive cellelinjer, med et middel på 97 celler /felt og 75 celler /felt, henholdsvis (figur 6). Den LNCaP-cellelinjen, som også var tumoral, merkelig oppviste en lav invasiv potensial, med et gjennomsnitt på 5 celler /felt (figur 6). Den ikke-tumorcellelinje RWPE-en også utstilt lav invasiv potensial, som forventet, med et gjennomsnitt på 9 celler /felt (figur 6).
prostatacellelinjer ble tidligere dyrket i 50 M finasterid eller kontroll medium i 72 timer og individuelt dyrket i 200 ul serumfritt medium (med eller uten 50 uM finasterid) i Matrigel® invasjon innsatsen ved en tetthet på 1 x 10
5 totale celler. Etter 22 timer ble cellene som invaderte gjennom matrigel matriksen og porøs membran fiksert, farget og tellet i løpet av fem tilfeldige felt ved hjelp av et lysmikroskop. Forsøk ble utført in triplo. Representative bilder av ubehandlede og finasterid-behandlede celler er vist på venstre side. Scale bar = 40 mikrometer. Finasteride vesentlig hemmet celle invasjon av alle de testede cellelinjer. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SD av invaderende celler. (*) Statistisk signifikante verdier, med p 0,05. (**) Statistisk signifikante verdier, med p 0,01. (***) Statistisk signifikante verdier, med p. 0,001
Finasteride hemmet celle invasjon i alle de testede cellelinjer. DU145 og PC3 celle invasjonen var signifikant redusert (p 0,001) etterfulgt av RWPE-1 (p 0,01) og LNCaP (p 0,05). (Figur 6)
Western blotting
AR Forsøk ble utført i tre eksemplarer.
