Abstract
Bakgrunn
Prostatakreft (PCA) er den hyppigst diagnostisert kreft i nordamerikanske menn. Androgen-deprivasjon terapi (ADT) fremhever infiltrasjon av immunceller i prostata. Imidlertid er de immunsuppressive trasé som reguleres av androgener i PCa ikke godt karakterisert. Arginase 2 (ARG2) ekspresjon av PCA-celler fører til en redusert aktivering av tumorspesifikke T-celler. Vår hypotese var at androgener kan regulere uttrykk for ARG2 av PCA celler.
metodikk /hovedfunnene
I denne rapporten viser vi at både ARG1 og ARG2 uttrykkes ved hormon-sensitive (HS ) og hormon ildfast (HR) PCa-cellelinjer, med LNCaP-celler som har den høyeste aktiviteten arginase. I prostata vevsprøver ble ARG2 mer uttrykt i normale og ikke-maligne prostatavevet sammenlignet med tumorvev. Etter androgen stimulering av LNCaP celler med 10 nM R1881, både ARG1 og ARG2 ble overexpressed. Reguleringen av arginase uttrykket etter androgen stimulering var avhengig av androgen reseptor (AR), som siRNA behandling rettet mot AR hemmet både ARG1 og ARG2 overekspresjon. Denne observasjonen ble korrelert
in vivo
hos pasienter med immunhistokjemi. Pasienter som behandles av ADT før operasjonen hadde lavere ARG2 uttrykk i både godartede og ondartede vev. Videre ARG1 og ARG2 ble enzymatisk aktivt og deres redusert ekspresjon av siRNA resulterte i redusert total arginase aktivitet og L-arginin metabolisme. Den reduserte ARG1 og ARG2 uttrykk også oversatt med forminskede LNCaP celler cellevekst og økt PBMC aktivering etter eksponering for LNCaP celler klimaanlegg medier. Til slutt fant vi at interleukin-8 (IL-8) ble også oppregulert etter androgen stimulering og at det direkte økt uttrykk for ARG1 og ARG2 i fravær av androgener.
Konklusjon /Betydning
Våre data gir den første detaljerte
in vitro Hotell og
in vivo
beretning om en androgen-regulert immunsuppressive sti i menneskelig PCa gjennom uttrykket av ARG1, ARG2 og IL-8.
Citation: Gannon PO, Godin-Ethier J, Hassler M, Delvoye N, Aversa M, Poisson AO, et al. (2010) Androgen-regulert Expression of Arginase 1, Arginase 2 og interleukin-8 i Human prostatakreft. PLoS ONE 5 (8): e12107. doi: 10,1371 /journal.pone.0012107
Redaktør: Chad Creighton, Baylor College of Medicine, USA
mottatt: 17 mars 2010; Godkjent: 06.07.2010; Publisert: 11 august 2010
Copyright: © 2010 Gannon et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forskningen ble støttet av en Sanofi Aventis forskningsstipend (FS), av en kanadisk Uro-Oncology Group /Astrazeneca forskningspris (FS) og av en bevilgning fra Prostate Cancer Research Foundation of Canada (RL). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, datadeling, beslutningen om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. Videre F.S. holder University of Montreal Chair i prostatakreft. R.L. er støttet av et fellesskap fra Fonds de recherche en Santé du Québec (FRSQ). P.O.G. er en mottaker av en Ph.D. student fra FRSQ og fikk ekstra støtte fra Institut du kreft de Montréal /Canderel stipend og fra Molecular Biology program av Université de Montréal
Konkurrerende interesser. Dette prosjektet ble finansiert delvis av en Sanofi Aventis forskning tilskuddet (FS) og av en kanadisk Uro-Oncology Group /Astrazeneca forskningspris (FS). Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Prostatakreft (PCA) er den hyppigst diagnostisert kreft og tredje største årsaken til kreft relaterte dødsfall for nordamerikanske menn [1]. Prostata s organogenese og karsinogenese er avhengige av nærvær av androgener [2]. Som sådan, den vanligste behandlingsform for menn med et avansert stadium eller tilbakevendende PCa er androgen-deprivasjon terapi (ADT). ADT fører til apoptose av hormonsensitiv prostata epitelceller [3]. Dessverre, i løpet av ett til fem år etter ADT initiering, de fleste pasienter utvikler hormon ildfast PCa (hrpc), hvis behandlingen forblir palliativ [4]. Nye behandlingsmetoder, slik som immunterapi, forsøk på å takle disse senere stadier av PCa. Imidlertid har dagens immunterapi mot PCa resultert i begrenset suksess i kliniske settinger. En detaljert forståelse av svulsten immunologiske mikromiljøet i prostatakreftpasienter skal gi ny innsikt i hvordan du kan forbedre dagens immunbaserte protokoller.
Nyere data viser at ulike immunsuppressive mekanismer er til stede i prostata og kan hemme anti- tumorimmunrespons i forbindelse med en immunterapi (oversikt i [5]). Arginase 2 (ARG2) uttrykkes i human PCa [6] og dens inhibering, samtidig med iNOS, øker aktivering av tumor-infiltrerende lymfocytter (Tīlss) [7]. Mens immunsuppressive egenskaper arginases gjennom metabolisme av L-arginin er godt dokumentert (oversikt i [8]), reguleringen av human arginase uttrykk, imidlertid, ikke er definert.
Androgener er kjent for å ha immunundertrykkende egenskaper , som er illustrert ved den intra-prostata inflammasjon etter ADT [9], [10]. Genekspresjon analyser og murine studier tyder på at androgener regulere ekspresjonen av ARG2 og andre enzymer av polyaminet veien [11], [12], [13]. Dermed vurderer de grunnleggende roller av androgener i prostata kreftutvikling og i sculpting av prostata er mikromiljøet, evaluert vi om androgener kunne regulere uttrykk for arginases av PCA celler
in vitro Hotell og
in vivo
.
I denne studien rapporterer vi at PCA cellelinjer uttrykke både funksjonelt aktiv ARG1 og ARG2. Interessant, hormon sensitiv (HS) og hormon ildfast (HR) vev uttrykt mindre ARG2 enn ikke-maligne vev. I HS LNCaP-cellelinjen, androgen stimulering resulterte i økt ekspresjon av både ARG1 og ARG2 i en androgen reseptor (AR) avhengig måte. Dette androgen-regulert ekspresjon ble også observert i den primære svulst ADT-behandlede pasienter som uttrykt mindre ARG2 i både de ikke-maligne vev tilstøtende til tumoren og tumorvev sammenlignet med kontrollpasienter. Til slutt, vi oppdaget at IL-8 ble også regulert av androgener under kontroll av AR, og deltok i reguleringen av ARG1 og ARG2 uttrykk. Til sammen gir våre data den første detaljerte
in vitro Hotell og
in vivo
beretning om en androgen-regulert immunsuppressive sti i menneskelig PCa.
Resultater
ARG1 og ARG2 uttrykk ved PCA
Vi først evalueres arginases uttrykk fra PCA cellelinjer og kliniske prøver. Våre data viser at PCA cellelinjer uttrykke både ARG1 og ARG2. Genekspresjon analyser av qPCR viste at
ARG1
mRNA var mer tallrike i det 22Rv1 cellelinje (figur 1A), mens ARG1 protein var litt mer til uttrykk ved de to HR PCA cellelinjer (Du145 og PC3) enn i LNCaP celler (figur 1B, nederst panel). ARG1 protein uttrykk korrelerte ikke med analyse av genuttrykk som tyder på en mulig post-transcriptional regulering. Som for ARG2 uttrykk uttrykte LNCaP cellelinje de høyeste nivåene av
ARG2
mRNA (figur 1A). Lav
ARG2
mRNA-ekspresjon ble påvist i de to cellelinjene HR DU145 og PC3 sammenlignet med de to HS PCA cellelinjer. ARG2 protein overflod korrelert med qPCR resultatene med LNCaP celler som uttrykker betydelig mer ARG2 enn de andre tre cellelinjer (figur 1B, nederst panel). Videre LNCaP cellene hadde høyest arginase aktivitet som tyder på at ARG2 er den dominerende enzym med hensyn til arginase aktivitet av PCA celler (figur 1B, topp panel).
PCA cellelinjer (LNCaP, 22Rv1, DU145 og PC3) ble opprettholdt i RPMI supplert med 10% FBS. A) Gene uttrykk for
ARG1 plakater (venstre panel) og (panel
ARG2
høyre). Midlere relative uttrykk (n = 3) med standard feil av gjennomsnittet (feilfelt). B) Topplate: Arginase aktivitet av PCA cellelinjer kvantifiseres i mU /mg proteiner. Bunnplate: Western blot av ARG1 og ARG2. Ran tjente som lasting kontroll. C) Representant bilde av immunhistokjemi farging av ARG2 uttrykk i prostatavevet. Legg merke til at uttrykket av ARG2 ble begrenset til epitelcellene uten stromal farging. D) Kvantifisering av ARG2 uttrykk ved immunhistokjemi i prostata prøver. * Statistisk signifikant forskjell i ARG2 uttrykk mellom PIN og HR vev (p = 0,033, Mann-U). ** Statistisk signifikant forskjell i ARG2 uttrykk mellom tumorvev og normalt vev (p 0,001, Mann-U), non-maligne vev som grenser til tumor (p 0,01, Mann-U) og PIN-vev (p 0,001, mann- U).
uttrykk av ARG2 protein ble evaluert i kliniske prøver ved immunhistokjemi på tre forskjellige vev mikro arrays (TMA) omgruppering prostata prøver fra en kohort av 99 PCA pasienter og 50 normal prostata hentet fra obduksjoner. Vi gjorde ikke vurdere ARG1 protein uttrykk som, i våre hender, anti-arg1 antistoffer testet var ikke egnet for immunhistokjemi på arkivformalinfiksert parafin-embedded vev. Vi har observert at ARG2 ekspresjon var begrenset til prostata epitel og fraværende fra stroma (figur 1C). ARG2 var statistisk signifikant mindre uttrykt i tumorvev i forhold til normal (p 0,001, Mann-U), til ikke-ondartet normal tilstøtende (p 0,01, Mann-U) og prostata intraepitelial neoplasi (PIN) vev (p 0,001 , Mann-U) (figur 1D). HR vev også uttrykt mindre ARG2, selv om bare signifikant forskjellig fra PIN-vev (p = 0,033, Mann-U). Det var ingen sammenheng mellom ARG2 uttrykk innenfor normale grenser og tumorvev (Tabell S1). Til slutt, vi evaluert hvis ARG2 uttrykk korrelert med klinisk-patologisk parametere som Gleason Score, preoperativ prostataspesifikt antigen (PSA) nivåer og biokjemisk tilbakefall. Våre resultater viser at ARG2 uttrykk innenfor det normale tilstøtende vev omvendt korrelert med vesikkel bryt invasjon (tabell S1). Til sammen disse
in vitro Hotell og
in vivo
data viser differensial uttrykk for ARG1 og ARG2 mellom ulike stadier av PCa progresjon, uavhengig av HR status.
Androgen- regulert uttrykk for ARG1 og ARG2
differensial uttrykk for ARG1 og ARG2 mellom HS og HR PCA cellelinjer ledet oss til å undersøke de regulatoriske roller av androgener i arginase uttrykk. For å gjøre dette, evaluert vi arginases gen og protein uttrykk følgende androgen stimulering.
ARG1
mRNA uttrykk var ikke statistisk signifikant oppregulert i enten LNCaP eller 22RV1 cellelinjer følgende R1881 stimulering (figur 2A). Men i LNCaP celler,
ARG2
mRNA uttrykk ble økt til 48 timer (p = 0,002, Mann-U) og 72 timer (p = 0,016, Mann-U) etter R1881 stimulering (Venstre panel, figur 2B). Overekspresjon av
ARG2
i 22RV1 var ikke statistisk signifikant (p = 0,248, Mann-U) (Høyre panel, figur 2B). Faktisk
ARG2
uttrykk korrelert med høyere androgen følsomheten av LNCaP-celler sammenlignet med 22RV1 (figur S1A). Som sådan ble LNCaP-celler brukt for videre eksperimenter. Bekreftende PCR data, Western blot fra LNCaP celler viste at R1881 stimulering økt ARG2 protein uttrykk (Figur 2C). Interessant, selv om ingen signifikante endringer ble observert i
ARG1
mRNA uttrykk i LNCaP celler behandlet med R1881, ARG1 protein uttrykk ble betydelig økt. Vi observerte ikke noen økning i ARG1 eller ARG2 protein uttrykk i DU145 og PC3 stimulert med 10 nM R1881 (figur S1B).
AB) LNCaP celler (venstre panel) og 22RV1 (høyre panel) ble stimulert i løpet en periode på 72 timer med 10 nM R1881 etter en 72 timers inkubasjonstid i kull-strippet media og genuttrykket av A)
ARG1 Hotell og Bed)
ARG2
analysert av qPCR. Control (lys grå søyler) og R1881-stimulerte (svarte søyler). * Statistisk signifikant forskjell (p 0,05, Mann-U). Gjennomsnittlig relativ uttrykk (n = 4) med standard feil (feilfelt). C) Økt protein uttrykk for både ARG1 og ARG2 følgende R1881 stimulering av Western blot. LNCaP-celler ble stimulert med 10 nM R1881 som tidligere beskrevet. PSA tjente som positiv kontroll. Representative eksperiment, (n = 6). D) Hemming av AR aktivitet med bikalutamid (Casodex). LNCaP-celler ble stimulert med R1881 i 72 timer som tidligere beskrevet, i nærvær av økende doser av bikalutamid (0, 10, 20 og 40 uM). ARG1 og ARG2 uttrykk nivåer ble evaluert av Western blot. Representative eksperiment er vist, (n = 3). Legg merke til agonisteffekt av bikalutamid i fravær av R1881 illustrert ved en øket PSA og ARG2 uttrykk. E) Hemming av AR uttrykk av siRNA. LNCaP-celler ble transfektert som beskrevet tidligere. AR, ARG1 og ARG2 uttrykk nivåer ble evaluert av Western blot. Representative eksperiment er vist, (n = 4). F) Arginase aktivitet ble kvantifisert i mU /mg proteiner. LNCaP celler ble transfektert med siCTRL (lys grå søyler) eller SIAR (svarte striper) og deretter stimulert med R1881 for 72 timer som tidligere beskrevet. Representant eksperiment (n = 3).
The AR er innblandet i ARG1 og ARG2 uttrykk
Som våre resultater tyder på at androgener regulere arginase uttrykk, evaluert vi bidraget av AR . Vi hemmet AR-aktivitet med ikke-steroide anti-androgen bikalutamid (Casodex) (figur 2D). Vi merket en redusert uttrykk for ARG1 med høyest konsentrasjon (40 mm) av bikalutamid følgende R1881 stimulering. Androgen induksjon av ARG2 ble ikke blokkert, selv ved den høyeste konsentrasjon av bikalutamid. Som tidligere dokumentert [14], observerte vi at bikalutamid hadde AR-agonist-aktivitet i LNCaP-celler dyrket i fravær av androgener. Det var en R1881-uavhengig induksjon av PSA og ARG2 ekspresjon i LNCaP-celler stimulert med 20 pM og 40 pM av bikalutamid i fravær av androgener. I denne samme tilstand, bikalutamid forårsaket en reduksjon i ARG1 uttrykk. Disse resultatene antyder at ARG1 ekspresjonen kan være mer følsomme overfor AR-inhibering enn ARG2, hvis ekspresjon ble indusert ved agnostisk effekten av AR-inhibitor.
Vi bestemte oss for ytterligere å inhibere AR ved blokkering av AR-ekspresjon i LNCaP-celler ved hjelp av siRNA. Tilstedeværelsen av siRNA mot AR resulterte i en signifikant inhibering av AR ekspresjon og i en redusert PSA uttrykk følgende R1881 stimulering (figur 2E). Både ARG1 og ARG2 induksjon følgende R1881 stimulering ble inhibert av siRNA behandling, som oversettes i fravær av en oppregulering i arginase aktivitet (figur 2F). Disse resultatene tyder på at AR regulerer uttrykket av ARG1 og ARG2
in vitro Hotell og at ARG1 og ARG2 har en annen følsomhet for AR hemming.
Redusert ARG2 uttrykk i PCA pasienter etter ADT
Basert på vår
in vitro
data, hypotese vi at androgener kan modulere ARG2 protein uttrykk i PCA pasienter også. Vi observerte at, sammenlignet med kontrollkreftpasienter (kirurgi bare), ADT-behandlede pasienter (ADT før operasjonen) hadde signifikant lavere ARG2 uttrykk i både ikke-maligne vev ved siden av svulsten (46,4 vs 23,5 relative enheter; p 0,001 , Mann-U) og tumorvev (41,7 vs 31,5 relative enheter; p 0,05, Mann-U). D) Redusert proliferasjon av LNCaP-celler i fravær av arginase uttrykk. LNCaP-celler ble transfektert som beskrevet tidligere. Proliferasjon ble målt ved celletall 96 timer etter transfeksjon. * Statistisk signifikant forskjell (p 0,05, Mann-U), (n = 3). E) Hemming av ARG2 uttrykk fører til økt PBMC spredning og aktivering. PBMC fra normale donorer ble aktivert med anti-CD3 (OKT3, 1 ug /ml) med eller uten IL-2 i nærvær av friskt medium eller kondisjonert medium fra LNCaP-celler transfektert med enten kontroll, siCTRL, siARG1 eller siARG2 som tidligere beskrevet. Kontroll PBMC ble inkubert med IgG-isotype-kontroll (1 pg /ml) og med PBS i stedet for IL-2. Venstre panel: PBMC-proliferasjon ble kvantifisert ved BrdU-inkorporering etter 120 timer med OKT3 og IL-2-stimulering. Gjennomsnittlig absorbans (n = 4) er vist med standard feil (feilfelt). Høyre panel: PBMC sekresjon av IFN-γ kvantifisert ved hjelp av ELISA. Samme eksperiment som beskrevet tidligere, men de PBMC ble aktivert i 24 timer uten IL-2. Representant uttrykket vises (n = 4) med standard feil av gjennomsnittet (feilfelt).
Som arginases er innblandet i polyaminsyntesen pathway nødvendig for cellulær proliferasjon, vi evaluert effekten av ARG1 og ARG2 på cellevekst. Det ble observert at inhibering av enten ARG1 eller ARG2 ekspresjon resulterte i en lavere spredning av LNCaP-celler holdt i komplett medium (p = 0,02 og p = 0,01, henholdsvis for siARG1 og siARG2) (Figur 4D). Videre, for å undersøke om ARG1 og ARG2 ekspresjon av LNCaP-celler påvirket deres immunundertrykkende potensial, PBMC fra friske donorer ble aktivert i nærvær av kondisjonert medium fra LNCaP + siCTRL eller LNCaP + siARG1 eller LNCaP + siARG2. Hemming av enten ARG1 eller ARG2 oversatt til økt PBMC spredning som kvantifisert ved BrdU inkorporering (figur 4E, venstre panel). Denne økte proliferasjon var assosiert med en forhøyet IFN-γ sekresjon av PBMC som målt ved ELISA (figur 4E, høyre panel). Det ble ikke observert noen signifikante variasjoner i utskillelsen av IL-2 eller IL-10 (data ikke vist). Til slutt, vurderte vi hvorvidt ARG2 uttrykket korrelert med immunceller infiltrat av primærtumor som vi nylig publisert [10]. Vi merket oss at ARG2 uttrykk gjorde omvendt korrelert med infiltrasjon av T-lymfocytter og makrofager i prostata (tabell S2). Sammen er disse resultatene tyder på at ARG1 og ARG2 uttrykt av LNCaP-celler er enzymatisk aktivt og delta i viktige fysiologiske prosesser så som cellulær proliferasjon og tumor-avledede immunsuppresjon.
IL-8 induksjon av ARG1 og ARG2 uttrykk
i arginases er godt dokumentert for å delta i den toning av tumoren immunologiske mikromiljøet [15], og at cytokiner er kjent for å indusere arginase ekspresjon i murine modeller [16], vurderte vi hvorvidt cytokiner kan også regulere arginase ekspresjon i humane PCa . Cytokin ekspresjonsprofilen av LNCaP-celler stimulert med 10 nM av R1881 ble kvalitativt bedømt ved anvendelse av en Proteome Profiler cytokin array (R & D Systems) (figur 5A). De proteomic data illustrerer at de R1881-stimulerte LNCaP-celler hadde økt ekspresjon av IL-8 og Serpin E1 (fig S2A). Vi undersøkte videre rollen til IL-8 i arginase uttrykk som IL-8 har nylig blitt knyttet til ekspresjonen av androgen-regulerte gener i PCa [17]. Vi kvantifisert således forhøyet ekspresjon av IL-8 i LNCaP-celler etter R1881 uttrykk (figur 5B). Denne IL-8 induksjon var avhengig av AR som inhiberingen av AR-ekspresjon ved siRNA forhindret IL-8-sekresjon følgende androgen stimulering (figur 5C). Vi vurderte deretter om hemming av IL-8 kan avta ARG1 og ARG2 uttrykket etter R1881 stimulering. Ved hjelp av et siRNA mot IL-8, kan vi få en betydelig redusere IL-8-sekresjon (figur 5D). Dette reduserte IL-8 produksjon var assosiert med en reduksjon av arg1 og ARG2 24 timer etter R1881 stimulering (figur 5E). Behandlingen av LNCaP celler med siIL-8 også oversatt til en nedgang i arginase aktivitet (figur S2B). Til slutt, stimulert vi androgen-fratatt LNCaP celler med økende konsentrasjon av eksogent IL-8 i 72 timer og overvåket uttrykk for ARG1 og ARG2. Ved Western blot-analyse, ble det observert at både 50 ng /ml og 100 ng /ml IL-8-indusert ekspresjon av ARG1 og ARG2 når sammenlignet med kontroll LNCaP-celler (Figur 5F). Nedgangen i ARG1 og ARG2 proteinekspresjon med 250 ng /ml IL-8 korrelerte med IL-8-indusert cellulær toksisitet. Vi har også observert en induksjon av
ARG2
, men ikke
ARG1
, genekspresjon etter en 24 timers stimulering (figur S2C). Til slutt, slik det var tidligere rapportert at fenolrødt kunne aktivere AR [18], vi også stimulert LNCaP-celler med IL-8 i fenolrødt-fritt RPMI media. Disse kontrollforsøk har vist at IL-8-avhengig induksjon av ARG1 og ARG2 kan forekomme i fravær av fenolrødt (figur S2D). Tatt sammen, dataene viser klart at androgener regulere ekspresjonen av IL-8, som i seg selv kan indusere ekspresjon av både ARG1 og ARG2.
Evaluering av cytokinet ekspresjonsprofilen av LNCaP-celler etter stimulering R1881. A) kondisjonerte medier fra LNCaP-celler stimulert som tidligere beskrevet ble analysert med en Proteome Profiler ™ (R & D Systems). B) kondisjonerte medier fra LNCaP-celler stimulert over tid med enten etanol kontroll (lys grå søyler) og R1881 (svarte søyler) ble analysert for produksjon av IL-8 ved hjelp av ELISA. Representanten Forsøket viste ble utført med samme kondisjonert medium som brukes til Proteome Profiler analyse i 5a, (n = 3). C) Kvantifisering av IL-8-sekresjon av LNCaP-celler transfektert med Siar og stimulert med R1881 som tidligere beskrevet. Representative eksperiment er vist, (n = 3). D) Kvantifisering av IL-8-sekresjon av LNCaP-celler transfektert med siIL-8 og stimulert med R1881 som tidligere beskrevet. Representative eksperiment er vist, (n = 3). For 5b og 5c, var det ingen IL-8-sekresjon detektert i fravær av R1881 stimulering. E) Uttrykk for ARG1 og ARG2 i LNCaP celler etter transfeksjon av siIL-8 og R1881 stimulering i 24 timer. Representative eksperiment er vist, (n = 3). F) LNCaP-celler ble sådd ut på trekull-strippet serum supplert media i 72 timer og i 24 timer i serumfritt RPMI. Cellene ble deretter stimulert i 72 timer med 10 nM R1881 eller med 50, 100 eller 250 ng /ml IL-8 i serumfritt RPMI. ARG1 og ARG2 uttrykk nivåer ble oppdaget av Western blot. Representative eksperiment, (n = 3). Merk induksjon av både ARG1 og ARG2 på 50 og 100 ng /ml IL-8-konsentrasjonen i fravær av R1881.
Diskusjoner
En mer grundig forståelse av prostata immunologiske mikromekanismer kan forbedre den kliniske effekten av dagens immunterapi mot PCa. Vi og andre har vist at ADT fører til drastiske endringer i prostata immunologiske mikromiljøet [9], [10]. Den arginase pathway deltar i utvikling av et immunsuppressivt tilstand innenfor den primære svulsten av PCA-pasienter [7]. Men reguleringen av arginase uttrykk ved PCA celler forblir udefinert.
I denne rapporten, observerte vi at androgener indusert uttrykk for både ARG1 og ARG2 i HS PCA cellelinjer. AR ble innblandet i denne forskrift som både bikalutamid og SIAR transfeksjon forhindret ARG1 og ARG2 overekspresjon følgende R1881 stimulering. Gjensidig, androgen deprivasjon og ADT redusert ARG2 uttrykk
in vitro Hotell og i primærtumor av PCA pasienter. LNCaP-celler uttrykte enzymatisk funksjonell ARG1 og ARG2 som, når deres protein-ekspresjon ble hemmet, forårsaket en reduksjon i celleformering og i sitt immunsuppressiv potensial. Til slutt viste vi at IL-8 ble også regulert av R1881 og kan stimulere ekspresjon av ARG1 og ARG2 uavhengig av androgen. Til sammen våre resultater gir den første mekanistisk bevis for en androgen-drevet immunsuppressive veien ved PCA gjennom uttrykket av ARG1, ARG2 og IL-8 av PCA celler.
Vi viser at PCA celler uttrykker både ARG1 og ARG2. ARG2 ble hovedsakelig uttrykt av HS PCA cellelinjer og av ikke-ondartet prostatavevet. Disse resultatene underbygge publiserte data som beskriver en lavere ARG2 uttrykk i androgen-insensitive PCA-cellelinjer (DU145 og PC3) og i tumor og HR vev av PCA-pasienter [6], [19]. Men til vår kunnskap, er vi den første gruppen til å studere uttrykket av ARG1 av PCA celler og definere mekanistiske konsekvenser som fører til sin androgen-regulert induksjon. I likhet med ARG2, inhibering av ARG1 uttrykk førte til redusert tumorcelle-proliferasjon, redusert l-arginin metabolisme og reduksjon av deres immunosuppressive potensial. Basert på protein uttrykk (figur 1B, nedre panel) og på arginase aktiviteten til PCA celler (figur 1B, topp panel), våre data tyder på at ARG2 kan likevel ha en mer fremtredende rolle enn ARG1 i arginase aktivitet potensialet i PCA celler [20].
Videre våre data viste at ARG1 og ARG2 ble ulikt regulert av androgener. I motsetning til ARG2 gen og proteinekspresjon, vi tydelig vist at genet og protein ekspresjon av ARG1 ikke korrelerer. Dette tyder på at androgener kan påvirke en post-transcriptional regulering av ARG1 som det ble tidligere rapportert i Xenopus [21] og i gjær modeller [22]. Siden ARG2 uttrykk er lokalisert til mitokondriene, evaluert vi enten celledeling uavhengig av androgener kan indusere ARG2 uttrykk i LNCaP celler. I en spredning analysen med EGF i stedet for R1881, ble det ikke observert ARG2 induksjon (data ikke vist). Kollektivt, våre resultater viser at, selv om både indusert av R1881, de signalveier som fører til ARG1 og ARG2 uttrykk forskjellig for de to enzymene og trenger å bli ytterligere undersøkt.
Implikasjonen av en androgen-regulert ekspresjon av ARG1 og ARG2 i prostata kreft krever videre undersøkelser. Arginase uttrykk og polyaminsyntesen er forhøyet ved PCA [23], [24] og i forbindelse med tumor grad [25]. En høy arginase aktivitet korrelerer med økt proliferasjon av brystkreft [26], tykktarmskreft [27] og nyrecellelinjer [28]. Men observerte vi at tumor eller HR vev uttrykke mindre ARG2 enn ikke-maligne vev. Det er mulig at tumorceller ikke anskaffer ekspresjonen av disse enzymene som et middel for ytterligere utnyttelse av deres immunosuppressive potensial, et aspekt forbundet med tumorprogresjon. Faktisk, siden prostata er organet med den høyeste produksjon polyaminet, kan arginase ekspresjon av prostataceller gå forut for utviklingen av kreft, som polyamin produksjon er avgjørende for proliferasjon av prostata-celler. Dermed kan det immunsuppressive fordel vunnet ved prostataceller være sekundært til den proliferative rolle de arginases. Fra våre data og andres, hypotese vi at arginase kan være innblandet i tidligere hormon-sensitive stadier av prostata kreftutvikling ved å fremme kreftcelle spredning og utvikling av en androgen-regulert immunsuppressive miljø.
Til slutt, vi observert at IL-8 ble oppregulert etter androgen stimulering og kan indusere uttrykk for ARG1 og ARG2. IL-8 medierer dens virkning gjennom aktivering av to høy-affinitets G-protein-koblede reseptorer, CXCR1 og CXCR2 [29], som begge er uttrykt av LNCaP-celler [30], [31]. Det er viktig å merke seg at ekspresjon av ARG1 og ARG2 følgende IL-8 stimulering var ikke så stor som med R1881 stimulering som tyder på at andre androgen-regulerte reaksjonsveier kan være involvert.
