Abstract
Formål
ovarialcancer har høyest dødelighet av alle gynekologiske kreftformer. Vi har vist at høy RAN uttrykk sterkt korrelerer med høyverdig og dårlig pasient overlevelse i epitelial eggstokkreft. Men som RAN er en liten GTPase involvert i to hoved biologiske funksjoner, Nucleo-cytoplasma transport og mitose, er det fortsatt ukjent hvilken av disse funksjonene forbinder med dårlig prognose.
Metoder
For å undersøke biomarkøren verdien av RAN nettverkskomponenter i serøs epitelial eggstokkreft, protein uttrykk for seks konkrete Ran partnere ble analysert ved immunhistokjemi hjelp av en vev microarray som representerer 143 pasienter i forbindelse med kliniske parametre. RAN BNP /GTP syklus ble evaluert av uttrykket av RANBP1 og RCC1, den mitotiske funksjon ved TPX2 og IMPβ, og Nucleo-cytoplasma trafficking funksjon ved XPO7, XPOT og IMPβ.
Resultater
Basert på Kaplan-Meier analyser, RAN, cytoplasma XPO7 og TPX2 var signifikant assosiert med dårlig generell pasient overlevelse, og RAN og TPX2 var assosiert med lavere sykdomsfri overlevelse hos pasienter med høy grad av serøs karsinom. Cox regresjonsanalyse viste at RAN og TPX2 uttrykk var uavhengige prognostiske faktorer for både generell og sykdomsfri overlevelse, og at cytoplasma XPO7 uttrykk var en prognostisk faktor for pasientene, og overlevelse.
Konklusjoner
I denne systematisk studie viser vi at løp og to protein partnere er involvert i sine Nucleo-cytoplasma og mitotiske funksjoner (XPO7 og TPX2, henholdsvis) kan brukes som biomarkører for å lagdelt pasienter basert på prognose. Spesielt vi rapporterte for første gang den kliniske relevansen av exportin XPO7 og viste at TPX2 uttrykk hatt den sterkeste prognostisk verdi. Disse funnene tyder på at protein partnere i hvert av Ran funksjoner kan diskriminere mellom ulike utfall i høy grad serøs epiteliale kreftpasienter på eggstokkene. Videre disse proteinene peke på cellulære prosesser som kan til slutt være målrettet for å bedre overlevelse i serøs ovarialcancer
Citation. Cáceres-Gorriti KY, Carmona E, Barres V, Rahimi K, Létourneau IJ, Tonin PN , et al. (2014) RAN Nucleo-Cytoplasmatiske Transport og Mitotisk Spindel Assembly Partners XPO7 og TPX2 er nye Prognostiske Biomarkører i Serous ovarialcancer. PLoS ONE 9 (3): e91000. doi: 10,1371 /journal.pone.0091000
Redaktør: Eric Asselin, University of Quebec i Trois-Rivieres, Canada
mottatt: 26. juli 2013, Godkjent: 06.02.2014; Publisert: 13 mars 2014
Copyright: © 2014 Cáceres-Gorriti et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av en bevilgning (MOP # 36056) fra den kanadiske Institutes of Health Research (CIHR) til A-MM-M, PNT og DP. Tumor bank ble støttet av Banque de Tissus et données av Réseau de recherche sur le kreft i Fond de recherche du Québec – Santé (FRQS), i forbindelse med den kanadiske svulst Repository Network (CTRNet). KYC-G ble støttet delvis av Stipend fra Carole Epstein Foundation og Canderel fond av Institut du kreft de Montréal. I. som ble støttet av en FRQS postdoktor trening award. A-MM-M og DMP er forskere ved Centre de recherche du Centre hospitalier de l’Université de Montréal (CRCHUM) og PNT er forsker ved forskningsinstitutt McGill University Health Centre (muhc), som begge får støtte fra FRQS. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
ovarialcancer (EOC) er den mest dødelige av alle gynekologiske kreftformer i Nord-Amerika [1] og på verdensbasis. Dette er knyttet til asymptomatiske sykdommens art antyde en sen diagnose med en fem-års overlevelse på 30% [2], [3]. I løpet av de siste 30 årene har fremskritt innen kirurgi og kjemoterapi hadde liten effekt på samlet pasientens overlevelse [4], fører [5] og aktuell behandling til tilbakefall hos flertallet av pasientene. Omtrent 80% av pasientene EOC presenterer en serøs histotype [6], [7], som er kategorisert i henhold til tumor karakter og til klinisk stadium, som representerer graden av cellulær differensiering og spredning av sykdommen [8] hhv. Molecular bevis støtter en klassifisering som skiller pasienter med disse serøs karsinom i to typer: pasienter med lavgradige svulster (LG, godt differensierte) og med høy grad av tumorer (HG, dårlig differensierte) [9], [10]. Pasienter med LG serøs svulster har vanligvis en god prognose, men står for 5% av alle serøs EOCs. Pasienter med HG serøs carcinoma har en dårlig prognose med overlevelse i fem-års mindre enn 40% [11]. Forskning på disse to forskjellige sykdommer, LG og HG serøs EOC, vil dermed gi en bedre forståelse av eggstokkreft biologi og bidra til å forbedre kliniske resultater. Videre kan biomarkører diskriminerende HG serøs EOC pasienter som har god eller dårlig prognose bidra til pasient terapeutisk lagdeling og kan øke total overlevelse.
I tidligere studier har vi vist at RAN (RAS-relaterte Nuclear protein), i EOC, er over uttrykt som tumor grad øker og er sterkt assosiert med dårlig pasient overlevelse [12], [13]. Derfor RAN funksjoner kan bli deregulert i ovariekarsinomer og RAN uttrykk mønstre kan anvendes som et prognostisk redskap i pasienter med avansert EOC.
In vitro
, bruk av et kort hårnål RNA (shRNA) rettet mot RAN ekspresjon hindrer EOC celleproliferasjon, noe som tyder RAN som et potensielt terapeutisk mål mottagelig for behandling av denne sykdom [14]. Videre mink RAN uttrykk i
in vivo
mus xenograft eksperimenter resulterte i pågripelsen av EOC tumorvekst [14]. Disse observasjonene indikerer at RAN er involvert i kreft progresjon eggstokkreft og kan bli innblandet i tumorigenesis og /eller celle overlevelse. Disse funnene korrelerer godt med tilsvarende undersøkelser i ulike typer kreft [15] -. [19]
På cellenivå, RAN utfører to store og tydelige funksjoner. På inter, RAN regulerer nucleo-cytoplasma transport av molekyler gjennom kjernefysiske pore komplekse [20], [21]. Ved mitose, utfører RAN en annen funksjon og styrer cellesyklusprogresjon gjennom regulering av mitotisk spindel formasjon [22]
RAN-GTP syklusen er regulert av tre proteiner.; RCC1, RAN-GAP1, og RANBP1 [23], [24]. RCC1 børser BNP for GTP, konvertering RAN-BNP til RAN-GTP [23]. I kontrast, RANBP1 og RAN-GAP1 arbeid for å øke GTP hydrolyse [24] og dermed fylle RAN-BNP basseng [25], [26]. RAN bruker samme GTP /GDP syklus for å regulere begge sine fysiologiske funksjoner. Men gradienten GTP /BNP oppnådd ved disse regulatorer er unik for hver funksjon av RAN. For nukleær transport ligger gradient etablert på tvers av kjernemembranen ved asymmetrisk fordeling av regulatorproteiner [27]. Under mitose, selv om noen membran adskiller de regulatorer, blir en gradient oppnådd i nærhet til kromosom med RCC1 blir festet til kromosomene [27].
Selv RAN bruker de samme regulatorer for GTP /GDP utveksling, den benytter unike partnerproteiner under interfase og mitosen å utføre forskjellige fysiologiske funksjoner (transport vs. spindelenheten). Under inter blir anrikning av RAN-GTP i kjernen er koplet til exportins som exportin-t (XPOT) [28], [29] og exportin-7 (XPO7 også betegnet RANBP16) [30], [31], hvilken tjener som adaptere ved å koble tRNA og proteiner, henholdsvis, for å tillate eksport av kjernefysiske deres last. I kontrast, RAN-BNP i cytoplasma bindes til importins som importin β (IMPβ) [32], [33], som anerkjenner kjernefysiske lokalisering sekvens (NLS) av proteiner for å lette deres bevegelse gjennom kjernefysiske konvolutten. Under mitose, fremmer RAN-GTP spindelenheten på en måte som er uavhengig av atom transport [34]. IMP beta binder og hemmer spindelenheten faktorer, som TPX2 (Targeting Protein for Xklp2). I nærhet til kromosomer, er TPX2 senere løslatt tilrettelegge regulering av microtubuli organisasjon og dynamikk [35].
Formålet med denne studien var å undersøke hvilken funksjon RAN ville bli mer relevantly innblandet i HG serøs EOC malignitet og dårlig pasient overlevelse. For å verifisere effekten av en funksjon
versus
den andre, uttrykket av molekylære partnere, spesielt for nucleo-cytoplasma transport og mitose, ble analysert ved immunhistokjemi på en vev microarray av 143 serøse karsinomer omfatter 131 tilfeller av HG og 12 av LG svulster. Vi evaluerte uttrykket av enkelte proteiner i sammenheng med kliniske parametre og bestemt deres tilknytning til EOC progresjon og resultat. Lovende resultater ble oppnådd for to kjørte partnere, XPO7 og TPX2, med potensial til å være klinisk relevant i stratifying HG serøs EOC pasienter.
Metoder
Etikk erklæringen
kompis institusjonelle etisk komité (Comité d’éthique de la recherche du Centre hospitalier de l’Université de Montréal) godkjent denne studien og skriftlig samtykke ble innhentet fra pasienter før prøvetakingen.
pasienter og vevsprøver
tumorprøver ble innhentet fra pasienter som gjennomgikk kirurgi for kreft i eggstokkene ved Institutt for gynekologisk onkologi – Centre hospitalier de l’Université de Montréal (kompis). En gynekolog-onkolog bestemt stadium av sykdommen som definert av Federation International of gynekologi og fødselshjelp (FIGO). En uavhengig patolog anmeldt histopatologi og svulst klasse. Tissue utvalgskriteriene for denne studien var basert på uavhengig bekreftelse av serøs histopatologi i prøver fra kjemoterapi-naive pasienter. Prøvene ble samlet mellom 1990 og 2006. Pasient total overlevelse ble definert som tiden fra kirurgi for å dø av kreft i eggstokkene eller siste oppfølging. Pasient sykdomsfri overlevelse ble beregnet fra tidspunktet for operasjonen til den første progresjon. Derfor bare pasienter som progrediert ble inkludert i vår analyse. Kliniske data på progresjonsfri intervall ble definert i henhold til nivået av blod ca125 og tumorstørrelse vurdert av bildebehandling. Pasienter som er kjent for å være fortsatt i live på tidspunktet for analyse ble sensurert på tidspunktet for deres siste oppfølging. Alderen på diagnostisering av pasienter med LG svulster varierte fra 27 til 71 år (gjennomsnitt = 48,5 år), og de ble fulgt 50,6 måneder i gjennomsnitt. Alderen på pasienter med HG svulster varierte fra 34 til 87 år (gjennomsnitt = 62,6 år) og deres gjennomsnittlige oppfølging var 37,2 måneder. Kohorten er beskrevet i Tabell S1.
Epitelial Serous Ovarian Tumor Tissue microarray (TMA)
Alle saker ble anmeldt av en gynekologisk patolog. Karakteren og type av ovarialcancer [9], [10] ble identifisert og interesseområder ble markert på lysbilder. To kjerner av 1mm for hver vevsprøve ble kledd på to mottakerparafinblokker. Dette vevet rekke var sammensatt av kjerner fra 12 LG og 131 HG svulster (2 kjerner per pasientprøve) av serøs histopatologiske subtype og seks parafininnstøpte EOC cellelinje pellets som fargekontroll (292 totalt kjerner). Den TMA ble deretter seksjonert, farget med hematoksylin-eosin og utsatt for en annen vurdering av vev patologi for å bekrefte tilstedeværelse av tumor materiale i hver kjerne.
Western Blot analyse
Kvaliteten og spesifisitet individuelle antistoffer hvor verifisert av Western blot analyse. Total proteinekstrakter (30 ug) ble lastet og elektroforese på SDS-polyakrylamidgel og deretter overført på en nitrocellulosemembran. Membranene ble blokkert med 5% melk-PBS (1 time) og deretter probet med primære antistoffer (2 timer ved romtemperatur) på det optimale fortynninger (1:500 for RAN, XPO7, XPOT og TPX2; 1:200 for IMPβ; 1:300 for RCC1; 1:75 for RANBP1). Hver primært antistoff ble påvist med et HRP-konjugert sekundært antistoff (Santa Cruz Biotechnology Inc.) og visualisert ved den forbedrede chemiluminescence (ECL) metode (GE Healthcare, UK). Beta-aktin ble brukt som en lastekontroll (1:50,000) (Abcam, Cambridge, MA).
Immunohistochemistry (IHC)
For manuell fargemetode, TMA blokken ble seksjonert på 4 mikrometer på Superfrost + glass objektglass (Fisher Scientific Limited, Nepean, ON, Canada). Objektglass ble oppvarmet ved 60 ° C i 15 min, deparaffinized i xylen, rehydrert i en etanol-gradient, og vasket i fosfat-bufret saltvann (PBS). Å avsløre antigener, ble objektglass plassert i 20 min ved høy temperatur under høyt trykk i citrat-buffer (10 mM natriumcitrat, 0,05% Tween 20, pH 6,0) for farging med anti-RCC1 (1/50, SC-1161, Santa Cruz Bioteknologi Inc.), anti-IMPβ (1/25, SC-1863, Santa Cruz Biotechnology Inc.) og anti-TPX2 (1/100, NBP1-01041, Novus Biologicals), eller i citrat-EDTA buffer (10 mM natrium citrat, 1 mM EDTA, 0,05% Tween 20, pH 8,0) for farging med anti-RANBP1 (1/25, SC-1159, Santa Cruz Biotechnology Inc.), anti-XPOT (1/50, LS-C80366, levetid Biosciences Inc.) og anti-XPO7 (1/200, LS-C55360, Levetid Biosciences Inc.) antistoffer. Platene ble deretter inkubert med 3% hydrogenperoksid i PBS (for å blokkere endogen peroksidase), og vasket i PBS. Vevssnitt ble blokkert med et ikke-serum-protein-blokkerende reagens (DakoCytomation Inc., Mississauga, ON, Canada) i 15 minutter ved romtemperatur og inkubert med primært antistoff i 60 minutter ved romtemperatur i et fuktig kammer. Substitusjon av det primære antistoff med PBS tjente som en negativ kontroll. Objektglassene ble deretter vasket i PBS, inkubert med sekundære antistoffer konjugert med pepperrot peroksidase (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA). Reaksjonsproduktene ble utviklet ved hjelp av diaminobenzidin (DAB) inneholdende 0,3% hydrogenperoksid inntil 5 min. Cellekjerner ble kontra med fortynnet hematoxylin i 1 min.
For automatisert fargemetode, deler av formalinfiksert parafin innebygd svulster (4 mikrometer) ble farget med BenchMark XT automatiserte Stainer (Ventana Medical System Inc., Tucson , AZ). Antigen gjenfinning for RAN ble utført med Cell Conditioning 1 (Ventana Medical System Inc.) i 30 min. Lysbilder ble inkubert med anti-RAN antistoff (1/100, SC-1156, Santa Cruz Biotechnology Inc.) i 40 minutter, og er utviklet av iView DAB deteksjon kit (Ventana Medical System Inc.). Hematoxylin og bluing reagens ble brukt for kontra (Ventana Medical System Inc.). TMA ble observert av lysfelt mikroskopi og digitalt avbildes (Aperio ScanScope, Vista, California, USA).
Farging Kvantifisering
Protein uttrykk ved IHC ble scoret i henhold til subcellulære lokalisering og fargeintensitet av ondartet celler. Kjerne- og cytoplasmatiske uttrykk for RAN nettverks proteiner i eggstokkreft vev ble observert ved bruk av digitalt fotografert skanninger av hver farget TMA og scoret i henhold til intensiteten av farging. For hvert RAN nettverk protein i epitel-soner av tumor kjernene, var fargeintensitet av DAB definert som 0 (ingen farging), 1 (svak farging), 2 (moderat farging) og 3 (sterk farging). Alle TMA ble analysert i en blind studie av to uavhengige observatører. Inter-vurdering korrelasjon (ICC) var større enn 75% for alle analyser. Gjennomsnittet av alle kjerner med cancer fra den samme pasient ble anvendt for analyse. Når sterke forskjeller i score mellom de to observatører skjedde kjernen ble re-evaluert for å nå en enighet mellom de to observatører.
Statistical Analysis
Alle statistiske analyser ble utført ved hjelp av SPSS programvare versjon 16.0 ( SPSS Inc., Chicago, IL, USA) der p 0,05 ble ansett som signifikant. Protein uttrykk mønstre av Ran partnere ble korrelert (Pearson korrelasjon test, to-tailed) med protein uttrykk for RAN og sykdom stadium (I-IV). Overlevelseskurver (total overlevelse og sykdomsfri overlevelse) ble plottet i et Kaplan-Meier estimatoren, sammenlignet med log rank test og analysert for signifikante forskjeller. For hver RAN partner, er det antall pasienter i hver overlevelse kurve omgås i Tabell S2. Univariate og multivariate Cox proporsjonal fare modeller ble brukt til å bestemme hasardratio for hver markør. Multivariate analyser ble gjort ved hjelp av en risikomodell med et skriv metode. Maksimalt fire uavhengige variabler ble inkludert i multivariat Cox regresjonsmodell for å unngå over-fitting.
Resultater
Uttrykk for RAN og dens Nettverkspartner Proteiner i Serous EOC Vev
for å finne ut om noen av partnerne i RAN er innblandet i biologi EOC, utførte vi en IHC analyse ved hjelp av en TMA som inneholder totalt 286 kjerner av kreftprøver som representerer 143 pasienter. RAN og de seks RAN-partner proteiner (RANBP1, RCC1, IMPβ, XPO7, XPOT og TPX2), ble analysert ved hjelp av dette vevet array. Spesifisitet for hvert antistoff ble først undersøkt ved western blot-analyse ved bruk av cellulære ekstrakter av fire EOC-cellelinjer (figur S1) og ved IHC ved hjelp av parafininnstøpte cellepelletene fra de samme cellelinjer (figur S2). Intensiteten og lokalisering av fargingen ble deretter vurdert ved hjelp av digitalt fotografert skanninger av hver farget TMA. Kjerne- og cytoplasmatiske uttrykk for RAN nettverks proteiner i EOC vev ble observert og klassifisert i henhold til den gjennomsnittlige intensiteten i farging så lavt (score 1), middels (score = 1 2) og høy (score ≥2) (figur 1) , med unntak av TPX2, som ble klassifisert som fraværende (score = 0) eller til stede (score 0)., på grunn av den unike fargemønster av dette proteinet (figur 1-2)
Representative bilder av immunoperoxydase fargemønster på et TMA kjerne er vist for hvert protein og tumor klasse (forstørrelse x 20). Kvantifisering av RAN (A-B), RANBP1 (C-D) og IMPβ (G-H) var utelukkende for cytoplasmatisk farging. RCC1 (E-F) og TPX2 (M-N) ble utelukkende lokalisert til kjernen. XPO7 (I-J) og XPOT (K-L) ble kvantifisert for både sin kjernekraft og cytoplasma uttrykk.
For hvert protein ble fargeintensitet definert som 0 (ingen flekker), 1 ( svak farging), 2 (moderat farging) eller 3 (mørke flekker) i det epiteliale rom av to uavhengige observatører. Gjennomsnittet av fargeintensitet for hvert protein ble sammenlignet mellom lav karakter (hvite søyler) og høy grad av svulster (grå søyler) ved hjelp av en student test. * P 0,05 ** p≤0.005
uttrykk for RANBP1 (BNP) og RCC1 (GTP), som er de generelle proteiner knyttet til RAN-GTP syklus, ble først undersøkt.. IMPβ uttrykk ble analysert for å samtidig vurdere begge de to viktigste funksjonene til RAN. Da spesielt utforsket vi den Nucleo-cytoplasma funksjon av RAN ved å vurdere uttrykk for to exportins: XPO7 og XPOT. Til slutt, undersøkte vi TPX2 uttrykk for å evaluere spindelenheten i løpet av mitose, en annen viktig funksjon av RAN. Figur 1 viser representative bilder for farging av hvert protein i HG serøs eggstokkene karsinomer. Ekspresjon av RAN (figur 1A-C), RANBP1 (figur 1D-F) og IMPβ (figur 1J-L) ble lokalisert til både cytoplasma og kjernen, selv om signal kvantifisering fokusert utelukkende på cytoplasma basert på dets høyere ekspresjon i denne cellerommet. Expression of RCC1 (figur 1G-I) og TPX2 (figur 1Y-Z) var kjernekraft. Kjerne- og cytoplasmisk farging ble observert for XPO7 (figur 1 M-R) og XPOT (figur 1 S-X) proteiner, og begge ble kvantifisert.
RAN Nettverks Proteiner er korrelert med Tumor Grade
Å ha etablerte fargemønsteret for hver av de RAN nettverks proteiner, så vurdert vi fargeintensitet etter tumor grad (figur 2). I en tidligere studie rapporterte vi observasjonen at RAN farging ble positivt assosiert med økt tumor karakter i serøs EOC [13]. I denne studien, ved hjelp av en beriket pasient kohort, vi ytterligere underbygge vår første funn viser at nivåene av cytoplasma RAN var betydelig høyere i HG svulster i forhold til LG svulster (p 0,001) (figur 2A). Den cytoplasmatisk fargeintensitet av RANBP1 (p 0,001), IMPβ (p = 0,048), og nukleær lokalisering av RCC1 (p = 0,004) var signifikant høyere i HG versus LG tumorer (figur 2B-D). For den nucleo-cytoplasmisk RAN nettverk proteiner, ble kjerne XPO7 signifikant mindre uttrykt i HG enn lg tumorer (p = 0,005), mens ingen signifikante forskjeller ble observert for cytoplasmatisk XPO7 farging eller for cytoplasmisk /nukleær XPOT farging (figur 2E-2H). Interessant, i motsetning til alle andre RAN nettverks proteiner undersøkt, farging for den mitotiske RAN partner TPX2 ble funnet utelukkende innenfor kjernen av HG serøs karsinom (p 0,001) (Figur 2i). Dets ekspresjon ble dikotomisert som enten positiv eller fraværende på grunn av den unike fargingsmønsteret av dette proteinet i tumorer i pasienter. Våre resultater tyder på at dereguleringen av RAN nettverk er karakteristisk for HG serøs EOC, og dermed er i tråd med den siste forestillingen om at HG og LG serøs EOC er distinkte sykdomsenheter [9], [10].
neste bekreftet sammenhengen mellom ekspresjonen av RAN og hver av de RAN nettverkspartnere ved hjelp av Pearsons korrelasjons test (to-halet) (tabell 1). Som forventet, er involvert i GTP-syklus og IMPβ proteiner, var positivt korrelert med RAN (RANBP1, p 0,001; RCC1, p = 0,026; IMPβ, p 0,001), noe som tyder på en kompetent RAN GTPase syklus (tabell 1). For den nucleo-cytoplasmatiske rolle RAN, ble en signifikant positiv korrelasjon funnet for cytoplasmiske XPO7 (p = 0,028), så vel som kjerne XPOT uttrykket (p = 0,050) (tabell 1). Imidlertid ble ikke observert noen korrelasjon mellom flekker intensiteter av RAN og TPX2, noe som kan forklares med den indirekte innholdet i deres samhandling i mitose [35].
Sammenhengen mellom uttrykket av RAN eller av de RAN nettverks samarbeider med sykdomsstadiet ble også undersøkt ved hjelp av Pearsons korrelasjon test (to-halet) (tabell 1). En signifikant korrelasjon ble observert bare for RANBP1 farging (p = 0,034), som viser en svak negativ assosiasjon (Pearson koeffisient = -0,181) (tab 1).
RAN, XPO7 og TPX2 er assosiert med dårlig pasient overlevelse
Vi har undersøkt forholdet mellom uttrykket av RAN partnerproteiner og total overlevelse i kohort av 143 pasienter. Kaplan-Meier overlevelseskurver ble hentet og sammenlignet med den log-rank test for HG tilfeller bare (figur 3, Bord S2-S3). LG saker ble ikke tatt med på grunn av lavt antall pasienter, noe som reflekterer den sjeldenhet av denne sykdommen, og på grunn av deres forskjellige sykdomskarakteristika sammenlignet med HG tilfeller. En terskelverdi kan ikke oppnås ved ROC-kurver analyser, og for å unngå skjevhet i å velge en cut-off for hvert protein ble alle flekker score (gruppert som vist i figur 1) tas i betraktning ved utledning av Kaplan-Meier-kurver for hvert protein.
Expression of Ran nettverks proteiner ble evaluert som prognostiske indikatorer i bare høy grad serøs karsinom av Kaplan-Meier analyse. Overlevelse ble definert som tiden fra kirurgi for å dø av kreft i eggstokkene eller siste oppfølging. Log-rank-test ble anvendt for å definere statistisk forskjell mellom gruppene. For panelene A-H, lav farging (blå linje) som er definert ved verdiene 1, medium farging (grønn linje) definert ved = 1 2 og høy farging (rosa linje) definert som ≥2. For panel jeg blir prøver scoret som negative (svart linje) eller positive (grå linje) for TPX2 farging. I A-I, betegner p betydning blant alle grupper. For paneler J-K, negative TPX2 flekker med lav fargeintensitet av RAN (J -Svart linje) eller XPO7 (K – sort linje); negative TPX2 farging med medium + høy farging av RAN (J – cyan linje) eller XPO7 (K – fiolett linje); positiv TPX2 farging med medium + høy farging av RAN (J – grå linje) eller XPO7 (K – grå linje). I J-K, er p (øverst til høyre) beregnet for svart versus cyan (RAN, panel J) eller fiolett (XPO7, panel K). I J-K, p (nederst til venstre) er beregnet for grå versus cyan (RAN, panel J) eller fiolett (XPO7, panel K). A-K, p 0,05 er angitt i fet skrift
Økende nivåer av cytoplasma RAN flekker i HG serøs EOC var signifikant assosiert med en dårligere total overlevelse (p = 0,016;. Figur 3A, tabell S3 ). Disse observasjonene er i samsvar med våre første funn [13]. Av de RAN nettverkspartnere, den høye cytoplasma uttrykk for XPO7 (p = 0,02, figur 3E) og høy kjerne TPX2 uttrykk (p = 0,002, figur 3I) ble korrelert med generelle kortere overlevelse
For å undersøke videre. potensialet prognostisk betydning av RAN og sin partner proteiner i pasientene, overlevelse, ble univariate Cox regresjonsanalyser utført (tabell 2). Cytoplasmatiske RAN og XPO7 farging og kjernekraft TPX2 lokalisering i HG serøs EOC var signifikant korrelert med dårlig total overlevelse (p = 0,008, p = 0,027, p = 0,002, henholdsvis). Disse proteinene var vesentlige uavhengige prognostiske faktorer for overlevelse med hazard ratio (HR = 1,82 for RAN, HR = 1,58 for XPO7 og HR = 2,66 for TPX2) kan sammenlignes med at av restsykdom (HR = 1,82), en kjent prognostisk faktor [3] .
til sammen våre resultater tyder på at XPO7, involvert i RAN er nucleo-cytoplasma eksport av proteiner, og TPX2, en partner av RAN i mitose, samt RAN selv, kan bidra til ondartet potensialet i serøs EOC og innflytelse pasientens generelle overlevelse.
Association of RAN og TPX2 med regelmessighet i serous EOC Pasienter
betydningen av RAN nettverks proteiner i tilbakefall i sammenheng med sykdomsfri overlevelse ble vurdert av Kaplan-Meier-kurve og Cox regresjonsanalyse som beskrevet ovenfor. Økende nivåer av cytoplasma RAN flekker i HG serøs EOCs var signifikant assosiert med kortere sykdomsfri overlevelse etter Kaplan-Meier analyse (p = 0,014; figur 4A, tabell S3). Av de kjørte nettverks proteiner, analyser Kaplan-Meier kurve som bare finnes atom TPX2 lokalisering som signifikant assosiert med tilbakefall i HG serøs EOC (p = 0,004; figur 4I, tabell S3). Univariate Cox regresjonsanalyse validert disse funnene hvor RAN (p = 0,006) og TPX2 (p = 0,006) proteiner viste signifikant sammenheng med tilbakefall av sykdommen (tabell 2). Disse funnene var også sammenlignes med hazard ratio fastsatt for restsykdom (tabell 2).
Evaluering av RAN nettverk protein uttrykk i bare høyverdig serøs karsinom av Kaplan-Meier analyse. Progresjonsfri overlevelse tilsvarer tiden i måneder regnet fra tidspunktet for første operasjonen til den første progresjon. Log-rank-test ble anvendt for å definere statistisk forskjell mellom gruppene. (Se figur 3 legende for detaljer).
Derfor våre resultater tyder på at RAN er mitotisk funksjon spesielt, via sin TPX2 partner, ser ut til å være assosiert med tilbakefall av HG serøs EOC.
multivariate analyser bekrefter god Association of TPX2 Expression i pasientens overlevelse og tilbakefall av sykdommen
for ytterligere å definere den potensielle prognostiske verdien av RAN protein-nettverket, ble multivariate Cox regresjonsanalyser utført for RAN og hver partner som oppnås betydning i univariat analyse.
Hazard ratio av RAN, ble XPO7 og TPX2 for pasientene, overlevelse sammenlignet med standard prognostiske faktorer som stadium og restsykdom (tabell 2). Våre resultater viser at bare RAN (p = 0,015, HR = 1,84), TPX2 (p = 0,033, HR = 2,15) og restsykdom (p 0,05) var signifikante uavhengige prognostiske markører for total overlevelse i HG tumorer. Interessant, både RAN og TPX2 hadde høyere HRS enn restsykdom (tabell 2).
For gjentakelse, ble mønsteret av uttrykk for RAN og TPX2 også i forhold til standard prognose variabler (stadium og restsykdom). I HG svulster, bare RAN (p = 0,013, HR = 1,69) og TPX2 (p = 0,024, HR = 2,53) var uavhengige variabler spår en høy risiko for tilbakefall (tabell 2).
En Samtidig Over- uttrykk mønster av TPX2 /RAN eller TPX2 /XPO7 er forbundet med dårligere utfall i serous EOC Pasienter
Våre resultater tyder på at uttrykket mønstre av RAN og dens mitotisk partner TPX2 i serøs EOC opptre som uavhengige prognostiske biomarkører for både pasientene, overlevelse og gjentakelse. Vi neste evaluert den kombinerte effekten av disse to kandidat biomarkører på generell og sykdomsfri overlevelse ved bruk av Kaplan-Meier kurve analyse. Våre resultater viste en signifikant forskjell mellom fargemønstre av RAN og TPX2 i progresjonsfri overlevelse (figur 4J) i HG tilfeller. Spesielt ble det samtidig tilstedeværelse av RAN og TPX2 forbundet med kortere sykdomsfri overlevelse sammenlignet med tilstedeværelsen av RAN alene (15 måneder versus 30 måneder, p = 0,001, fig 4J). Den samme trenden ble også observert for pasientene, overlevelse med border signifikans (p = 0,07, figur 3J). Anvendelse av de samme analyser har vi også vist at XPO7 og TPX2 uttrykk mønstre var signifikant assosiert med både dårligere total overlevelse (p = 0,012) og kortere sykdomsfri overlevelse (p = 0,012) sammenlignet med tilstedeværelsen av bare XPO7 (figur 3K, figur 4K). Det er bemerkelsesverdig at TPX2 uttrykk, når det skjedde, var alltid forbundet med enten RAN eller XPO7 co-uttrykk.
Diskusjoner
Høy RAN uttrykk nivåer har blitt rapportert i ulike tumorer, som bukspyttkjertel , tykktarm, lunge, nasofarynks, mage og nyre, sammenlignet med normalt vev [17] – [19], [36]. Interessant, har RNA interferens studier vist at RAN nedreguledrastisk påvirker kreftcelleoverlevelse, men ikke som normale celler [14], [18]. Men til tross for den avgjørende betydningen av RAN i kreftceller har det vært vanskelig å finne ut hvilken funksjon av dette proteinet er involvert i tumordannelse. For å begynne å løse dette problemet har vi studert uttrykket av flere Ran partnere, spesielt for sin distinkte funksjoner, i samarbeid med EOC pasient overlevelse og gjentakelse.
Ved hjelp av en større kohort, vi har bekreftet våre innledende funnene at pasientene med høy RAN ekspresjon i serøs EOC er assosiert med sykdomsprogresjon og dårlig prognose [12], [13]. β-aktin ble benyttet som en kontroll lasting.
