Abstract
PHB er en rapportert onkogen og tumor suppressor i magekreft. Her vurderte vi om
PHB
kopiere nummer og rs6917 polymorfisme påvirke sitt uttrykk i magekreft. Down-regulering og oppregulering av
PHB
ble observert i de evaluerte svulster. Redusert uttrykk var assosiert med tumor dedifferentiation og kreft innvielse. T allel av rs6917 polymorfisme var assosiert med redusert
PHB
mRNA nivåer. Videre er oppregulering av
PHB
syntes å være regulert av forsterkningen av ytterligere genkopier. Dermed
PHB
kopiere nummer variasjon og forskjells uttrykk for rs6917 polymorfisme kan spille en rolle i
PHB
transkripsjonsregulering
Citation. Leal MF, Cirilo PDR, Mazzotti TKF , Calcagno DQ, Wisnieski F, Demachki S, et al. (2014) Prohibitin Expression Deregulering i magekreft er assosiert med 3 «ikke-translatert område 1630 C T Polymorphism og Kopier nummer Variasjon. PLoS ONE 9 (5): e98583. doi: 10,1371 /journal.pone.0098583
Redaktør: Amanda Ewart Toland, Ohio State University Medical Center, USA
mottatt: 17 februar 2014; Godkjent: 05.05.2014; Publisert: May 30, 2014
Copyright: © 2014 Leal et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nivel Superior (CAPESP), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, RC, MACS og RRB) og Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, MFL, PDRC og DQC ) som tilskudd og måltids utmerkelser. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser. RC er en akademisk redaktør for PLoS ONE. De andre forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer for dem. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til PLoS ONE redaksjonelle retningslinjer og kriterier.
Innledning
Magekreft (GC) er den fjerde vanligste kreftformen og den nest største årsaken til kreftrelaterte dødsfall verdensomspennende [1]. Til tross for betydelige fremskritt i studiet av GC, de molekylære modifikasjoner som er involvert i mave karsinogenese er imidlertid ukjent.
Kromosom 17 er en av de mest vanlige kromosomene som oppviser tallforstyrrelser i GC (se gjennomgang [2]). Vår gruppe har tidligere rapportert tilstedeværelse av kromosom 17 Aneuploidy, både gevinster og tap, i GC i individer i Nord-Brasil [3], [4], [5], [6] og i alle GC cellelinjer etablert fra neoplasier i denne befolkning [7], [8]. Derfor kan dette kromosomet inneholder viktige gener involvert i magekreftutvikling.
prohibitin-en (
PHB
) genet kart til kromosom 17q21 locus. Dette genet koder for et allestedsnærværende, evolusjonært konservert protein som er funnet i en rekke organismer, inkludert bakterier, planter, gjær, protozoer og pattedyr [9]. PHB var opprinnelig tenkt å spille en sentral rolle i hemming av cellesyklusprogresjon. Mer nylig PHB er blitt karakterisert som en anstand involvert i stabilisering av mitokondrielle proteiner; således har PHB vært implisert i en rekke cellulære prosesser, inkludert regulering av proliferasjon, apoptose og gentranskripsjon [10].
PHB ser ut til å spille en rolle i utviklingen av forskjellige typer kreft. Overekspresjon av PHB er rapportert i cancer i cervix, øsofagus, bryst, lunge, blære, skjoldbruskkjertel, ovarium og prostata. I kontrast, redusert PHB uttrykk har blitt observert i hjernesvulst, og somatiske mutasjoner i
PHB
er påvist i sporadiske brystkreft [9]. I tillegg er en funksjonell enkeltnukleotidpolymorfi (SNP) i det
PHB
gen, endre en cytosin til en tymin i posisjon 1630 i den 3 «UTR (rs6917), opprettes en variant som mangler antiproliferativ aktivitet [11] [12], og deretter kan øke risikoen for ondartet vekst. T allel av dette SNP er blitt assosiert med en øket risiko for brystkreft [13] og melanom [14]. Derfor rolle PHB i kreft spredning og /eller undertrykkelse fortsatt kontroversielt.
Rollen PHB i magekreftutvikling er ikke fullstendig klarlagt. Noen tidligere studier har beskrevet økt PHB-ekspresjon i GC prøvene [15], [16], [17], [18] og serum av pasienter GC [19]. Imidlertid har andre studier rapportert PHB ned-regulering i denne type kreft [20], [21]. Etterforskningen av de molekylære mekanismene som er involvert i transcriptional regulering av
PHB
kan gi ny innsikt i sin rolle i GC og bidra til utviklingen av nye kreft behandlinger.
I denne studien først evalueres vi mRNA og protein uttrykk for PHB i GC og matchet ikke-neoplastiske prøver mage vev. I tillegg er de mulige sammenhenger mellom
PHB
og clinicopathological egenskaper ble undersøkt. Fordi
PHB
genet ligger i en kromosomal region ofte involvert i numeriske avvik i GC [2], vurderte vi også
PHB
kopiere nummer i tumorprøver. Videre allel-spesifikke uttrykk for
PHB
mRNA ble vurdert til å undersøke den relative transkripsjon av hvert allel i heterozygote individer med rs6917 polymorfisme som en mulig mekanisme involvert i
PHB
regulering. Så vidt vi vet, har ingen tidligere studie evaluert
PHB
kopiere nummer og allel-spesifikk uttrykk i tumorprøver.
Materialer og metoder
vevsprøver
førti-åtte par av GC prøver og tilsvarende prøver ikke-neoplastiske mage vev ( 5 cm fra kanten av svulsten) ble brukt for å evaluere
PHB
mRNA uttrykk og SNP rs6917 genotype. I 38 av disse GC prøver,
PHB
kopiere antall ble også vurdert. PHB immunoreaktivitets ble evaluert i 12 GC prøver.
Alle mage prøver ble innhentet fra pasienter som gjennomgikk gastrektomi for GC på João de Barros Barreto universitetssykehus (HUJBB) i Nord-Brasil. Alle pasientene hadde negative historier av eksponering for enten kjemoterapi eller strålebehandling før operasjonen, og det var ingen co-forekomst av andre diagnostisert kreft. Skriftlig informert samtykke med godkjenning av etikkutvalg av HUJBB ble oppnådd.
En del av hver dissekert tumorprøve var formalinfiksert og parafininnebygd (FFPE). Deler av FFPE vev ble farget med hematoksylin-eosin for histologisk evaluering eller brukes for immunhistokjemi (IHC) analyse. Ytterligere porsjoner av hver tumor og sammenkoblede prøven ikke-neoplastisk vev ble hurtigfrosset i flytende nitrogen og lagret ved -80 ° C inntil nukleinsyrerensing.
Alle prøvene ble klassifisert i henhold til Laurén [22], og svulstene ble iscenesatt i henhold til TNM staging kriterier [23].
DNA og mRNA Purification
Totalt DNA og mRNA ble samtidig isolert fra mage vevsprøver ved hjelp av en AllPrep DNA /RNA /protein sett (Qiagen, Tyskland) i henhold til produsentens instruksjoner. DNA og RNA konsentrasjon og kvalitet ble bestemt ved hjelp av en Nanodrop spektrofotometer (Kisker, Tyskland), og RNA integritet ble bestemt ved gel elektroforese.
PHB Gene Expression
PHB
ekspresjon ble undersøkt ved revers transkripsjon kvantitativ polymerasekjedereaksjon (RT-qPCR). Først ble komplementær DNA (cDNA) syntetisert ved hjelp av en High-Capacity cDNA Arkiv kit (Applied Biosystems, Polen) i henhold til produsentens protokoll. Real-time RT-qPCR analyse ble utført ved hjelp av QuantiFast SYBR Grønn Master Mix (Qiagen, tysk) på en 7500 Fast Real-Time PCR maskin (Applied Biosystems, USA). De følgende primere (150 nM hver) ble utformet for RT-qPCR amplifikasjon:
PHB
F5′-GTGTGGTTGGGGAATTCATGTGG-3 «og R5′-CAGGCCAAACTTGCCAATGGAC-3»;
ACTB
F5′-AGAAAATCTGGCACCACA-3 «og R5′-AGAGGCGTACAGGGATAG-3». Alle reaksjoner ble utført i triplikat for både målgenet og internkontrollen (
ACTB
).
PHB
uttrykk var normalisert til
ACTB
uttrykk. Overflod av mRNA uttrykk ble justert ved forsterkning effektivitet (
PHB
= 99%,
ACTB
= 102%) [24]. En ikke-neoplastisk mage vevsprøve ble utpekt som en kalibrator for hver sammenkoblet svulst å beregne relativ kvantifisering (RQ) [24].
PHB Protein Expression
parafinsnitt ble utsatt for IHC . Tumor vevssnitt (3 eller 4 mm tykke) ble deparaffinized i xylen og rehydrert i en gradert etanol serien. Epitop gjenfinning ble utført i citratbuffer, pH 6,0, i fuktig varme i en trykkoker. Deretter ble vevssnittene inkubert med et primært monoklonalt museantistoff mot PHB (II-14-10, fortynning 1:100; ThermoFisher Scientific, USA). Steder av immunoreaktivitet ble visualisert ved anvendelse av en SuperPicture Polymer deteksjonssettet (Invitrogen, USA). Glassene ble vist ved lysmikroskopi ved hjelp av et Nikon Eclipse E600 mikroskop (Nikon, USA) utstyrt med et digitalt kamera Nikon DSM1200F (Nikon, USA). Den ikke-farget regionen (hvit region) ble valgt og bruke som bakgrunn. Enhver farging ble ansett for å være et positivt resultat, uavhengig av intensiteten. Negative kontroller, i hvilket det primære antistoff ble erstattet med 5% bovint serumalbumin (BSA) i fosfatbufret saltvann (PBS), ble inkludert i alle serier, og deler av normalt humant prostatavev ble anvendt som positive kontroller.
PHB
Kopier nummer
for å evaluere kopi nummervariasjoner (CNV), qPCR prosedyren ble utført ved hjelp av kvantitative TaqMan CNV analyser (Life Technologies, USA) for
PHB
genet (Hs00178432_cn) og for den interne kontrollen
RNase P product: (# 4403326). Multiplex qPCR reaksjoner ble utført i fire eksemplarer med gDNA henhold til produsentens protokoll og sykkelforholdene i en 7500 Fast Real-Time PCR maskin (Life Technologies, USA). Den relative kopiantallet av hver prøve ble beregnet ved hjelp av Kopier Caller Software V1.0 (Life Technologies, USA). Kommersielle menneskelige gDNAs (G1471 og G1521, Promega, USA) ble brukt for kalibrering
PHB
Genotyping
DNA fra ikke-neoplastiske prøvene ble brukt for
PHB.
genotyping. Fagene ble genotypet for rs6917 polymorfisme ved hjelp Custom TaqMan SNP prober og primere (Applied Biosystems, Foster City, California). De følgende primere og MGB prober ble utformet for alleliske diskriminering: primere F5′-TTGGTCCCTCTCAGATACCCA-3 «og R5′-CCGTGAGAAGGGCAGTCTCT-3′; FAM-merket probe 5»-CTGCCAAAGACGTGT-3 «; og mindre allel VIC-merket probe 5»-CTGCCAAAGATGTGT-3 «.
PHB
Allele spesifikke uttrykk
Allele spesifikke uttrykk ble først bestemt ved sekvensering. Tyve til 40 ng av DNA eller cDNA ble anvendt som et templat for PCR-amplifikasjon med primerene anvendt for
PHB
genotyping. Før sekvensering ble PCR-produktene separert ved bruk av 2% agarosegel-elektroforese, og den spesifikke bånd ble ekstrahert og renset. Sekvensering ble utført ved bruk av foroverprimeren anvendt for PCR-amplifikasjon og en BigDye Terminator Cycle Sequencing kit v3.1 (Applied Biosystems, USA). Sekvenseringsprodukter ble separert ved bruk av en ABI 3500 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA). Noen av prøvene ble analysert på minst to ganger, inkludert forskjellige RT-PCR og sekvenseringsanalyser.
allelisk ekspresjonsnivåer ble bestemt ved å bruke PeakPicker programvare [25]. Programvaren som ble brukt til å først utføre et normaliseringstrinn, hvor det SNP allelet høyde sammenlignet med høyden av referansetopper i flankerende sekvenser. Vi begrenset denne normalisering skritt til innenfor en 21-basen vinduet. Ratio-verdier over 1 ble transformert til 1 /(forhold) for å transformere alle verdiene til en 0-1 skala, og verdiene ble deretter justert til middelverdien av toppintensitetsforhold fra et referanse DNA-prøve heterozygote for det rs6917 polymorfisme. Genomisk DNA fra heterozygote (N = 3) og homozygot prøver (N = 3, for genotype CC, N = 2, for genotype TT) ble anvendt for å validere analyse og for å bekrefte alleliske forhold av 50:50 og 0:100, henholdsvis. I tillegg ble cDNA fra vevsprøver (tumoral og ikke-tumorale eksemplarer) fra de to fag som er homozygote for de mindre allel i rs6917 polymorfisme også anvendt som kontroller.
Allele-spesifikk
PHB
ekspresjon ble også evaluert i heterozygote prøver ved hjelp av RT-qPCR, som tidligere beskrevet [26]. Ved hjelp av en egendefinert TaqMan SNP genotyping analyse for
PHB
genotyping, genererte vi en lineær regresjon kurve for log10 fluorescens intensitet
vs
log10 allel grad basert på serie fortynning av CC- og TT genotypet genomisk DNA fra kontrollprøver (prøver fra to homozygote individer) i flere forholdstall (CC: TT 08:01, 04:01, 02:01, 01:01, 01:02, 01:04, 01:08) ved RT -qPCR (figur 1A). Den allelisk forholdet av genekspresjon ble ekstrapolert ved skjæringspunktet på den log10 av FAM: VIC intensitet på standardkurven. ROX (intern referanse fargestoff) og ikke-spesifikk FAM og VIC fluorescens ble normalisert i alle analyser. Alle reaksjoner ble utført i duplikat.
A) log
10 av FAM /VIC intensitetsforholdet for
PHB
plottet mot log
10 av FAM /VIC allele forholdet mellom blande homozygot DNA på forskjellige forhold (08:01, 04:01, 02:01, 01:01, 01:02, 01:04, 01:08 FAM /VIC allel). B)
PHB
uttrykk ved rs6917 genotype i mageprøver. C) C /T allel forholdet i cDNA fra mage prøver av heterozygote pasienter ved sekvensering; D) FAM /VIC allelisk forholdet i gastriske prøver av heterozygote pasienter som anvender et tilpasset genotyping TaqMan®-analyse, hvori en spesifikk probe for C-allelet ble merket med FAM fargestoff og en mindre allel T-proben ble merket med VIC fargestoff. * Uttrykt forskjellig mellom gruppene ved T-test for uavhengige utvalg,
P
. 0,05
For de heterozygote cDNA prøvene, allele forholdstall 0,8 eller 1.2 var sett som et tegn på allel-spesifikke uttrykk.
Statistical Analysis
for mRNA uttrykk analyse, må vi først vurderes under forutsetning av at dataene hadde en normalfordeling med Shapiro-Wilk normalitet test for å finne riktig tester for påfølgende statistiske sammenligninger.
PHB
mRNA nivåer ble ikke normalfordelte og ble forvandlet (z-score) for analyse. Observasjoner 2 eller -2 ble ansett som uteliggere og ekskludert fra analysene. En paret t-test ble utført for å sammenligne gjennomsnittlig
PHB
uttrykk mellom ikke-neoplastiske og tumorprøver. T-test for uavhengige utvalg og enveis ANOVA etterfulgt av Games-Howell post-hoc test ble brukt for å vurdere mulige sammenhenger mellom
PHB
uttrykk og clinicopathological egenskaper, protein immunoreaktivitets, genkopitallet og genotype . The Chi-kvadrat test eller Fishers eksakte test ble brukt for å vurdere forholdet mellom
PHB
kopiere nummer og immunoreaktivitets og clinicopathological faktorer. Pearsons korrelasjon ble anvendt for å vurdere en mulig sammenheng mellom sekvensering og den TaqMan®-analyse for allel-spesifikk ekspresjon analyse. I alle analysene,
P
. 0,05 ble betraktet som signifikant
Resultater
PHB
mRNA uttrykk på Gastric Svulster
PHB
uttrykk var ikke forskjellig mellom neoplastiske og matchet ikke-neoplastiske mage prøver (0,173 ± 0,255
vs
0,227 ± 0,297,
P
= 0,149). Imidlertid ble mRNA-nivåer redusert med minst 1,5 ganger i 20 (45,5%) av GC prøvene og økt i 9 (20,5%) sammenlignet med sammenkoblede ikke-neoplastiske gastriske vevsprøver.
Tabell 1 viser assosiasjoner mellom
PHB
uttrykk og clinicopathological egenskaper samt protein immunoreaktivitets, rs6917 genotype og genkopitallet. Dårlig differensierte svulster present redusert
PHB
uttrykk sammenlignet med moderat differensierte svulster (
P
= 0,029, Tabell 1). Men både dårlig differensiert GC (0,025 ± 0,022
vs
0,239 ± 0,303;
P
0,001, ANOVA etterfulgt av Games-Howell post-hoc test) og moderat differensiert GC (0,057 ± 0,051
vs
0,239 ± 0,303;
P
0,001, ANOVA etterfulgt av Games-Howell post-hoc test) present reduserte
PHB
uttrykk sammenlignet med ikke- neoplastiske mage vevsprøver
Redusert
PHB
uttrykk var assosiert med lavere invasjon (
P
= 0,002, Tabell 1). og et fravær av lymfeknutemetastase (
P
= 0,040, Tabell 1). I tillegg presenterte tidlig GC redusert
PHB
uttrykk sammenlignet med avansert GC (
P
= 0,002, Tabell 1). Videre bare tidlig GC presentert en betydelig reduksjon i
PHB
mRNA nivåer sammenlignet med ikke-neoplastiske prøver (0,044 ± 0,027
vs
0,239 ± 0,303,
P
0.001, ANOVA etterfulgt av Games-Howell post-hoc test).
PHB immunreaktivitet i Gastric Svulster
Protein farging ble observert i alle de tumorprøver evaluert av IHC (tabell 2). I alle tilfeller ble PHB immunreaktivitet påvist i neoplastiske og ikke-neoplastiske celler, inkludert tarmmetaplastiske og inflammatoriske celler (figur 2A-H). PHB var først og fremst uttrykt i cytoplasma. Fargeintensitet, og prosentandelen av immunreaktive celler varierte blant de undersøkte tilfellene (tabell 2). Prøver presentere 80% av tumorceller med PHB immunoreaktivitets viste redusert mRNA uttrykk (
P
= 0,036, Tabell 1)
A) PHB farging i normal mageslimhinnen (400x).; B) PHB immunoreaktivitets i normal mageslimhinnen og betennelsesceller (400x); C) sterk PHB flekker i tarmmetaplastiske celler (400x); D) sterk PHB farging i en intestinal-type tumor; E) moderat til intens PHB immunoreaktivitets i en dårlig differensiert tumor; F) moderat til intens PHB immunoreaktivitets i en moderat differensiert tumor; G) svak PHB flekker i en moderat differensiert tumor (400x); D) svak PHB flekker i en diffus-type svulst (400x).
PHB
Kopier nummer i Gastric Svulster
PHB
ble forsterket i 13 av 38 (34,2%) svulster, inkludert 2 prøver med 4 eksemplarer. Ingen svulst presentert en
PHB
sletting. Interessant, 3 prøver som presenteres uteligger verdier for
PHB
mRNA uttrykk presenteres også genamplifikasjon. Derfor, når uteligger verdier ble inkludert i analysen,
PHB
uttrykk var høyere i prøver med genamplifisering enn i de uten genet forsterkning (median ± interkvartilt område: 0,344 ± 0,335
vs
0,047 ± 0,07;
P
= 0,003, ikke-parametrisk Mann-Whitney test, figur 3).
PHB
gevinst var assosiert med sent oppstått GC sammenlignet med tidlig debut GC (
P
= 0,022; tabell 2). Ingen sammenheng mellom
PHB
kopiere nummer og protein immunoreaktivitets eller andre clinicopathological egenskaper ble funnet (tabell 3).
Lines viser median og interkvartilt spekter av
PHB
uttrykk. * Uttrykt forskjellig mellom gruppene med Mann-Whitney test,
P
. 0,05
PHB
Allele spesifikke uttrykk
Vi undersøkte også hvorvidt nærværet av den mindre allel i rs6917 var forbundet med den genekspresjon deregulering i GC pasienter. I vår prøve, 11 av 48 pasienter (22,9%) var heterozygote og 2 pasienter (4,17%) var homozygote for mindre allel i rs6917 polymorfisme. Alle prøvene med T-allelet present 2 eksemplarer av
PHB
genet. Tilstedeværelsen av T-allel i rs6917 polymorfisme var assosiert med redusert
PHB
ekspresjon i GC (
P
0,001; tabell 1; figur 1B) og i ikke-neoplastiske prøver (bety ± SD. 0,302 ± 0,325
vs
0,045 ± 0,043;
P
0,001; figur 1B)
Ett par av heterozygote prøver (tumor og ikke-tumor) ble ikke brukt for analyse av allel-spesifikk ekspresjon. En korrelasjon mellom alleliske forholdet mellom rs6917 polymorfisme bestemmes ved sekvensering og TaqMan analysen ble oppdaget (
P
= 0,003; r = 0,627). Ved sekvensering, omtrent 50% av tilfellene presentert differensial allelisk uttrykket (figur 1C). Imidlertid TaqMan®-analysen viste at T- og C-allelene presentert differensial allelisk uttrykk i de fleste pasienter (figur 1D). Graden av forskjell i uttrykket mellom de to alleler varierte blant individer. T til C allel uttrykk forholdet var lik i de fleste par av tumor og ikke-tumorprøver. Kun en pasient presentert en høyere C /T-forholdet i både tumor og ikke-neoplastiske prøver i begge analysene. I de fleste tilfeller, ble en lavere C /T-forhold detekteres uavhengig av metoden som er anvendt (figurene 1C og 1D). Ingen sammenheng mellom differensial allel uttrykk og debutalder eller annen clinicopathological variable ble oppdaget.
Diskusjoner
PHB ser ut til å være avgjørende i cellulær homeostase. Nyere studier har antydet at PHB kan fungere som en pro-tumorigen og anti-tumorigen faktor i flere celletyper (se anmeldelse [10]). I denne studien, protein og mRNA uttrykk profiler av PHB presentert en heterogen mønster blant tumorprøver. Selv om vi ikke finner en signifikant forskjell mellom GC og matchet ikke-neoplastiske prøver, observerte vi at mRNA-nivået ble redusert 1,5 ganger i 45,5% av GC prøver og økt i 20,5% av svulster. Den reduserte mRNA uttrykk var delvis på grunn av en redusert frekvens av tumorceller som presenterer PHB immunoreaktivitets, som fremhever heterogenitet blant tumorcellekloner.
Liu et al. [21] rives redusert mRNA-ekspresjon i fire mage-tumorer sammenlignet med deres tilsvarende normale vev, noe som delvis bekrefter resultatene. Støtte en anti-tumorigen rolle, PHB blokker inntreden i S-fasen [27]. I tillegg er de villtype rs6917
PHB
3’UTR alene er i stand til å inhibere cellesyklusprogresjon [11], [28] og tumorvekst [12] samt redusere cellemobilitet [29]. Videre spiller PHB en rolle i å opprettholde normal mitokondriefunksjon og morfologi [30]. Det har blitt foreslått at tap av mitokondriell PHB uttrykket (cytoplasmatisk lokalisering, som observert i våre prøver) kan føre til akselerert proteolyse av membranproteiner og svekke funksjonen av mitokondrie respiratoriske kjeden [10]. Vår forrige proteomikk studie viste at flere proteiner som er involvert i energiomsetningen baner (mitokondriell dysfunksjon, pyruvat metabolisme, oksidativ fosforylering, citrate sirkel, glykolyse /glukoneogenese) ble deregulert [31] og foreslo at fremtredende mitokondrielle funksjoner kan endres, skiftende energiproduksjon i GC celler og antyder at Warburg effekten [32].
Så vidt vi vet, er det få studier har evaluert en mulig sammenheng mellom
PHB
mRNA nivåer og rs6917 polymorfisme. I en studie Tang et al. ikke observere en signifikant sammenheng mellom rs6917 polymorfisme og mRNA-ekspresjon i lymfoblastoide cellelinjer inkludert i databasen HapMap [33]. Disse forfatterne rapporterte at T-allelet var forbundet med en økt risiko for brystkreft. I foreliggende studie demonstrerte vi at tilstedeværelsen av T-allel i rs6917 polymorfisme var assosiert med redusert
PHB
ekspresjon i ikke-neoplastiske og neoplastiske gastriske celler. Den rs6917 polymorfisme er plassert i 3’UTR og er til stede bare i en isoform av PHB, som ble påvist i den foreliggende studie av cDNA-sekvensering og en TaqMan-analyse. Den 3’UTR inneholder flere
cis
– og
trans
-elements, og disse strukturene har en utbredt innflytelse på mRNA oversettelse, stabilitet og subcellulære lokalisering [34], [35], [36 ]. T varianten skaper en potensiell bindingssete for microRNAs har-MIR-1292 og har-886-5p (https://snpinfo.niehs.nih.gov/cgi-bin/snpinfo/mirna.cgi?2_rs6917), som kan endre genuttrykk ved enten mRNA forråtnelse eller oversettelse. Andre microRNAs ble tidligere knyttet til regulering av
PHB
uttrykk i GC. Liu et al. [21] har rapportert at
PHB
reguleres av MIR-27a, som vanligvis er oppregulert i GC. Forfatterne antydet at nedregulering av
PHB
av denne mikroRNA kan forklare hvorfor den undertrykkelse av MIR-27a kan hemme GC cellevekst. I tillegg 3’UTR av
PHB
koder et antisense RNA (Gene ENSG00000250186; HAVANA https://www.sanger.ac.uk/). Nærværet av sjelden allel i antisens-RNA kan modifisere den sekundære struktur og redusere kcal /mol når sammenlignet med det store typesekvensen ved hjelp av CLC-RNA Arbeidsbenk 4.0 programvare (data ikke vist). Derfor kan rs6917 polymorfisme føre til
PHB
nedregulering ved å skape nye mikroRNA målse eller gjennom sin regulering av antisense RNA i mage celler, og dermed bidra til magekreftutvikling.
I vår prøver, de fleste av de heterozygote pasientene viste økt ekspresjon av T-allelet i forhold til den C-allelet. Forskjellen i de relative mRNA-nivåer i de to alleler kan være et resultat av forskjeller i transkripsjon eller mRNA-stabilitet, og de viser at denne polymorfismen presenterer en
cis
virkning i mage-celler. Så vidt vi vet, er dette den første studien for å evaluere differensial
PHB
allel-spesifikk uttrykk i tumorprøver. Tidligere studier har vist at en
PHB
variant med T-allelet i posisjon 1630 i den 3’UTR mangler anti-proliferative og tumorveksthemming egenskaper in vitro og i dyremodeller [29]. Derfor er nærværet av T-allelet, spesielt når det viser forhøyet ekspresjon i forhold til den C-allel, kan indusere en «svamp effekt» for post-transkripsjonelle regulatorer som mirnas og bidra til gastrisk celleproliferasjon, disponerer heterozygote individer på GC.
den mulige effekten av
PHB
nedregulering – på grunn av rs6917 polymorfisme, for eksempel – på GC risiko er i overensstemmelse med assosiasjoner mellom redusert
PHB
mRNA og lavere invasjon, mangel på lymfeknutemetastase og tidlig stadium GC. Så vidt vi vet, har ingen tidligere studie i litteraturen evaluert en mulig sammenheng mellom
PHB
uttrykk og GC prognostiske faktorer. Disse funnene tyder på at
PHB
nedregulering kan være nødvendig for startfasen.
Men forrige proteomikk studier rapportert PHB oppregulering i magesvulster [15], [16], [17] . I tillegg, Kang et al. [18] har rapportert at overekspresjon av PHB-protein og mRNA i GC (sammenlignet med tilstøtende normale gastrisk vev) i asiatiske individer. I vårt utvalg, 20,5% av svulster presenteres også økt
PHB
uttrykk. PHB ser ut til å spille en rolle i celleproliferasjon, adhesjon og migrasjon og, derfor, i utviklingen av malign transformasjon via RAS-RAF signalering [37]. Vi hypotese at økt
PHB
mRNA nivå er nødvendig for GC progresjon. Evalueringen av humane prøver bare tillater undersøkelse av en eneste gang punkt (ved tidspunktet for kirurgisk reparasjon); dermed kan vi ikke vurdere dynamisk regulering av genekspresjon. Men
PHB
uttrykk er mest sannsynlig relatert til mobil sammenheng og molekylær bakgrunn av mage celler.
Kang et al. [18] har rapportert at PHB-protein og mRNA-ekspresjon varierer mellom moderat og dårlig differensiert GC, og at bare dårlig differensierte tumorer Foreliggende PHB overekspresjon sammenlignet med ikke-neoplastiske prøver. I vår prøve, ble noen få tumorer klassifisert i henhold til graden av differensiering. Men observerte vi at både dårlig og moderat differensierte svulster present redusert
PHB
uttrykk sammenliknet med ikke-neoplastiske prøver og at
PHB
mRNA nivåene var lavere i dårlig differensierte svulster. Derfor, i våre prøver,
PHB
uttrykk syntes å avta med svulst dedifferentiation. Videre undersøkelser er nødvendig for en bedre forståelse av PHB rolle i differensieringen prosess i normale og neoplastiske mage celler.
I denne studien, observerte vi at 34,2% av svulster fått kopier av
PHB
. Endringer i kromosom 17 har vært forbundet med tumorprogresjon og maligne potensial i primær GC [38], [39]. Så vidt vi vet, er dette den første studien som bruker en nøyaktig og robust teknikk for å evaluere
PHB
kopiere nummer i GC prøver. Vi observerte en sammenheng mellom
PHB
kopiere nummer og mRNA nivåer, avslører en cis-dosering effekten av CNV på genuttrykk nivåer. Derfor våre resultater tyder på at CNV er et viktig element i å drive nedstrøms
PHB
transkripsjon i noen mage svulster. Denne genetiske mekanismen, hovedsakelig observert i sen debut GC, kan bidra til
PHB
rolle som onkogen. Dette funnet også markere at flere mekanismer kan føre til
PHB
deregulering i GC-celler.
Økningen i
PHB
kopiere nummer ble assosiert med sent oppstått GC. Clinicopathological forskjeller mellom tidlig debut og sent innsett GC har blitt beskrevet [40], [41], [42], men lite er kjent om de genetiske endringer knyttet til en alder av utbruddet av GC [2]. Buffart et al. [43] tidligere vist at unge og gamle pasienter som tilhører grupper med ulike genomiske profiler. Forsterkningen av
PHB
locus streker heterogenitet av GC.
Den største begrensningen med denne studien er det relativt liten utvalgsstørrelse. Derfor er noen statistisk analyse presentert redusert kraft for å detektere signifikante forskjeller mellom gruppene sannsynligvis på grunn av det store heterogenitet blant prøver. Derfor kan falsk-negative resultater har forekommet. Ytterligere evalueringer er likevel nødvendig å vurdere rollen til
PHB
i magekreftutvikling og dens transkripsjonsregulering.
I konklusjonen, både ned-regulering og oppregulering av
PHB
kan bli observert i GC. Reduksjonen av
PHB
ekspresjon synes å være involvert i tumor dedifferentiation prosessen og kreft initiering. T-allelet i
PHB
rs6917 polymorfisme kan bidra til den observerte reduksjonen i
PHB
mRNA nivåer og derfor bidra til GC risiko. Imidlertid
PHB
oppregulering synes å være regulert av genkopitallet. Differensial ekspresjon av rs6917 polymorfisme i gastriske prøver ble rapportert for første gang, og denne varianten kan spille en rolle i reguleringen av
PHB
uttrykk.
