Abstract
gaffelhodeboks protein O1 (FOXO1), et nøkkelmedlem av FOXO familien av transkripsjonsfaktorer, fungerer som en tumor-suppressor og har vært forbundet med forskjellige viktige cellulære funksjoner, inkludert cellevekst, differensiering apoptose og angiogenese. Derfor er det et tankekors at FOXO protein uttrykk er nedregulert i kreftceller. MicroRNAs, ikke-kodende 20~22 nukleotid enkelt-strandet RNA, resultere i translasjonell undertrykkelse eller degradering og genet Slå av sine mål gener, og bidra vesentlig til regulering av genuttrykk. I denne studien rapporterer vi at Mir-370 uttrykk var signifikant oppregulert i fem prostata kreft cellelinjer, sammenlignet med normal prostata epitel (PREC) celler. Ektopisk uttrykk for MIR-370 indusert spredning og økt ankeruavhengig vekst og kolonidannelse evne DU145 og LNCaP prostata kreft celler, mens hemming av MIR-370 redusert spredning, forankringsuavhengig vekst og kolonidannelse evne. Videre oppregulering av MIR-370 forfremmet oppføring av DU145 og LNCaP prostata kreft celler i G1 /S cellesyklus overgangen, som ble assosiert med nedregulering av cyclin-avhengig kinase (CDK) hemmere,
p27
Kip1 Hotell og
p21
Cip1
, og oppregulering av cellesyklusen regulator cyclin D1 mRNA. I tillegg viste vi at MIR-370 kan nedregulere uttrykk for FOXO1 ved direkte rettet mot den
FOXO1
3′-utranslaterte område. Til sammen våre resultater tyder på at Mir-370 spiller en viktig rolle i spredning av menneskelige prostata kreft celler, ved direkte undertrykke tumor suppressor FOXO1
Citation. Wu Z, Sun H, Zeng W, Han J Mao X (2012) oppregulering av MircoRNA-370 induserer spredning i human prostata kreft celler ved Downregulating transkripsjonsfaktor FOXO1. PLoS ONE 7 (9): e45825. doi: 10,1371 /journal.pone.0045825
Redaktør: Jindan Yu, Northwestern University, USA
mottatt: May 24, 2012; Akseptert: 24. august 2012; Publisert: 18.09.2012
Copyright: © Wu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Disse forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
Konkurrerende interesser:. Weixia Zeng er ansatt av et kommersielt selskap Laura Biotech Co, Ltd Dette endrer ikke vår tilslutning til alle de PLoS ONE politikk på deling av data og materialer. De andre forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer.
Innledning
Prostatakreft er den nest vanligste kreftformen hos menn, med mer enn 0,78 millioner nye tilfeller oppstår globalt hvert år [1]. Omtrent 190.000 mennesker er diagnostisert med prostatakreft og mer enn 27,360 prostatakreftpasienter dør hvert år i USA [2]. Prostatakreft er en stor folkehelseproblem og er forbundet med betydelige helsekostnader. Serum prostataspesifikt antigen (PSA) screening er nyttig for tidlig diagnostisering av prostatakreft; har imidlertid PSA screening mange svakheter, for eksempel, er PSA nivåer ofte forhøyet hos menn som lider godartet prostata betennelse. De behandlingsstrategier som er tilgjengelige for prostatakreft, inkludert kirurgisk kastrering og kjemoterapi, er generelt mislykket [3]. Det er velkjent at prostata kreft lesjoner er heterogen og ofte svarer godt til første androgen deprivasjon terapi (ADT) [4]. I dag, de fleste pasienter med prostatakreft valgte et gonadotropin-frigjørende hormon (GnRH) agonist /antagonist snarere enn kirurgisk kastrering, og ADT er hovedsakelig brukt som systemisk behandling hos pasienter med metastaser. Men mange prostata kreftpasienter til slutt oppleve tilbakefall og androgen uavhengighet, noe som fører til akselerert sykdomsprogresjon og død [4], [5]. Derfor nye mål for effektive prostatakreft behandling strategier presserende behov for å bli identifisert.
Selv om både genetiske og miljømessige faktorer er vurdert å være viktige faktorer, de molekylære mekanismene for prostatakreft utvikling og progresjon fortsatt i stor grad ukjent. Ondartede svulster er preget av feilregulert aktivitet i de regulatoriske trasé som styrer spredning og /eller apoptose. Evnen til å hemme en eller flere sentrale mål innenfor disse signalveier kan gi nye gjennombrudd i kreftbehandlingen. Flere regulatoriske trasé, som androgen reseptor (AR) signalveien og Akt /protein kinase B (PKB) signalveien spiller en viktig rolle i reguleringen av apoptose og proliferasjon i prostatakreftceller 6-10. Derfor er det viktig å forstå disse banene, som oppdagelsen av de viktigste regulatorer kan ikke bare generere presise prognostisk informasjon, men kan også gi nye behandlingsstrategier for prostatakreft.
Akt /PKB sti fremmer celle overlevelse ved å regulere en rekke av transkripsjonsfaktorer, inkludert gaffelhodetranskripsjonsfaktor superfamilien [11], slik som gaffelhodeboks protein O1 (FoxO1, også kjent som gaffelhodet i rhabdomyosarcomas [FKHR]), FoxO3a (FKHRL1), FoxO4 (AFX) og FoxO6 . Siden isolering av gaffelhode genet i
Drosophila melanogaster
, mer enn 100 strukturelt-relaterte gaffelhodetranskripsjonsfaktorer er identifisert [12]. Medlemmene av FOXO underfamilien er evolusjonært konserverte transkripsjonelle aktivatorer, karakterisert ved et høyt konservert gaffelhode domene inneholdende et DNA-bindende motiv [13]. FOXO1 ble identifisert under studiet av t (2,13) (q35; Q14) og t (1,13) (p36; Q14) translokasjon, som vanligvis finnes i alveolene rhabdomyosarkom, en skjelettmuskel svulst utbredt hos barn [ ,,,0],14]. FOXO proteiner spiller en sentral rolle i en rekke biologiske prosesser, herunder apoptose, cellesyklus, differensiering, stressreaksjoner, DNA-skade og reparasjon glukosemetabolismen [15]. Aktivering av FOXO familien medlemmer kan oppregulere celle-syklus hemmere p21
Cip1 og p27
Kip1, og downregulate cellesyklusen regulator cyclin D1 /2, dermed fører til G1 /S cellesyklus arrest [16] – [ ,,,0],18]. Derfor FOXO transkripsjonsfaktorer er sentrale tumor suppressors. Økende bevis tyder på at aktivering av FOXO1 induserer apoptose i prostatakreftceller [18] – [23]. Brunet et al. indikerte at, ved å interagere med 14-3-3 chaperonproteiner, kan fosforylering indusere nukleær translokasjon av de FOXO transkripsjonsfaktorer [13]. Men årsakene til at FOXO er nedregulert i kreftceller dårlig karakterisert. Dermed hypoteser vi at en alternativ mekanisme kan regulere FOXO protein uttrykk i kreftceller.
microRNAs (mirnas) er en klasse av små, ikke-koding, single-strandet RNA som kan negativt regulere genuttrykket på innlegget -transcriptional nivå, hovedsaklig ved å binde seg til det 3′-ikke-translaterte region (UTR) av sine mål-mRNA [24] – [26]. Tallrike studier har vist at avvikende ekspresjon av mirnas er nært forbundet med spredning, invasjon, metastase og prognose av forskjellige kreftformer, inkludert prostatakreft, brystkreft, gliom og lungekreft [27] – [30]. Avvikende uttrykk for miRNAs resultater i genuttrykk endringer, epigenetiske modifikasjoner og endrede overflod av miRNA-behandling enzymet Dicer. Prostatakreft progresjon er assosiert med endret uttrykk av flere onkogener og tumor dempere, og mirnas potensielt kan regulere disse genene; har imidlertid forholdet mellom mirnas og prostatakreft bare begynte å bli belyst i de senere år [31]. Mer enn 50 mirnas rapporteres å være involvert i prostata kreft; Men de fleste av dagens data tyder på at bare et lite antall av disse er knyttet til patogenesen av prostatakreft. Interessant, av mirnas som er kjent for å endre fenotypen av prostata kreftceller, er noen betraktes onkogen (f.eks MIR-221 /-222, MIR-21 og MIR-125b), mens andre er ansett for å være tumorbeskyttelse (f.eks , MIR-101, MIR-126 *, MIR-146a, MIR-330, Mir-34 cluster og MIR-200 familie). Basert på disse funnene, er mirnas tenkt å ha en rekke potensielle kliniske anvendelser i prostatakreft som biomarkører og terapeutiske mål [27], [30], [32] -. [38]
I denne studien , offentlig tilgjengelige algoritmer (TargetScan, Pictar, Miranda) indikerte at MIR-370 kan direkte rettet mot 3`-UTR av
FOXO1
. Vi viste at MIR-370 forfremmet prostatakreft celleproliferasjon ved direkte rettet mot 3′-UTR av
FOXO1
mRNA, som senere redusert uttrykk for cyclin-avhengig kinase (CDK) hemmere,
p27
Kip1 Hotell og
p21
Cip1
, og oppregulert cellesyklus regulator
cyclin D1
. Våre resultater tyder på at Mir-370 kan spille en viktig rolle i utvikling og progresjon av prostatakreft.
Materialer og metoder
Cell kultur
Normal prostata epitelceller (prec ) ble erholdt fra Clonetics-BioWhittaker (Walkersville, MD, USA) og dyrket i PrEMB medium (Clonetics-BioWhittaker). Prostata kreft cellelinjer Tsu-PR1, PC3, DU145, 22Rv1 og LNCaP cellelinjer ble innhentet fra ATCC (Manassas, VA, USA). PC3 ble holdt i F-12K Medium (Invitrogen), DU145 ble dyrket i Eagles Minimum Essential Medium (Invitrogen), og Tsu-Pr1,22Rv1 og LNCaP ble dyrket i RPMI-1640 medium (Invitrogen), supplert med 10% føtalt bovint serum (HyClone, Logan, UT, USA) og 1% penicillin /streptomycin (Invitrogen).
plasmider og transfeksjon
klone sekvens av
FOXO1
3’UTR er som følgende: CTTCAGATTGTCTGACAGCAGGAACTGAGAGAAGCAGTCCAAAGATGTCTTTCACCAACTCCCTTTTAGTTTTCTTGGTTAAAAAAAAAAACAAAAAAAAAAACCCTCCTTTTTTCCTTTCGTCAGACTTGGCAGCAAAGACATTTTTCCTGTACAGGATGTTTGCCCAATGTGTGCAGGTTATGTGCTGCTGTAGATAAGGACTGTGCCAT.
This sekvensen ble forsterket av PCR fra PREC RNA og klonet inn i
Sac
I /
Xma
I områder av pGL3-kontroll luciferase reporter plasmid (modifisert ved å legge til
Sac
jeg /
Xma
jeg sider til plasmider fra Promega, Madison, WI, USA) og
Sac
i /
Xma
i områder av pGFP-C3 (modifisert ved å legge
Sac
I /
XMA
I områder til plasmider fra Clontech, Mountain View, CA, USA). Vi har endret den opprinnelige pGL3-kontroll Vector ved å fordøye stedet Xbal 1934 og ødelegge multiplisere kloningsseter (MCS) som er i oppstrøms arrangøren SV40, slik de opprinnelige områder av
Sac
I /
Xma
jeg er tapt. Og så har vi syntetisert en del av sekvens inkludert
Sac
I /
Xma
I områder. Senere la vi denne sekvensen til stedet av Xbal 1934. pGL3-kontroll modifisert sekvens er som følgende:
TCTAGA AA GAGCTC AACCAATGCATTGGTCC CCCGGG GGAGCTCTAGA
Etter alle disse, FOXO1 3’UTR er klonet inn i 3’UTR av luc + ikke oppstrøms av arrangøren SV40.
i pGFP-C3 Plasmid, er MCS ligger i 3’UTR av GFP, blant annet følgende sequence:
TACAAGTACTCAGATCTCGAGCTCAAGCTTCGAATTCTGCAGTCGACGGTACCGCGGGCCCGGGATCCACCGGATCTAGATAACTGATCA.
The primere var:
FOXO1
-3’UTR-vekt-up: 5′-GCCCCGCGGCTTCAGATTGTCTGACAGCAGGAAC-3 «;
FOXO1
-3’UTR-vekt-dn: 5′-GCCCTGCAGATGGCACAGTCCTTATCTACAGC-3 «;
FOXO1
-3’UTR-mu-up: 5′-GCCCCGCGGCTTCAGATTGTCTGACAGCACCAAC-3 «og
FOXO1
-3’UTR-mu-dn: 5′-GCC CTGCAGATGGCACAGTCCTTATCTACAGC-3′. Den P3X IRS-MLP-luc plasmid ble konstruert som tidligere beskrevet [19]. Mir-370 etterligner, negativ kontroll og anti-MIR-370 inhibitor ble kjøpt fra RiboBio (Guangzhou, Guangdong, Kina). Transfeksjon av mikroRNA og mikroRNA-inhibitor ble utført ved anvendelse av Lipofectamine 2000 (Invitrogen) i overensstemmelse med produsentens instruksjoner.
Western blotting
Western blot-analyse ble utført i henhold til standard metoder under anvendelse av anti-FOXO1, anti -p21, anti-p27, anti-cyclin D1, anti-Ki-67 antistoffer (cellesignalisering, Danvers, MA, USA), anti-Rb og anti fosforylerte Rb antistoffer (Abcam, Cambridge, MA, USA). Membranene ble strippet og re-strøket med en anti-ß-tubulin monoklonalt antistoff (Sigma, St. Louis, MO, USA) som en lasting kontroll.
RNA ekstraksjon og sanntids kvantitativ PCR
totalt mirnas ble hentet fra dyrkede celler ved hjelp av Mirvana miRNA Isolation Kit (Ambion, Austin, TX, USA) i henhold til produsentens anvisninger, så cDNA ble syntetisert fra 5 ng av total RNA bruker Taqman miRNA revers transkripsjon kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Uttrykket nivåer av MIR-370 ble kvantifisert ved hjelp av en miRNA-spesifikke TaqMan Mirna Assay Kit (Applied Biosystems). De miRNA ekspresjonsnivåer ble definert basert på terskelen syklusen (C
t), og de relative uttrykk nivåer ble beregnet som 2
– [(Ct av MIR-370) – (Ct av U6)].
real-time PCR ble utført ved hjelp av Applied Biosystems 7500 Sequence Detection system ved hjelp av følgende primere for
p21
Cip1
, (forover, 5′-CGATGCCAACCTCCTCAACGA-3 «og omvendt, 5» TCGCAGACCTCCAGCATCCA-3 «);
p27
Kip1 plakater (forover, 5′-TGCAACCGACGATTCTTCTACTCAA-3 «og omvendt, 5′-CAAGCAGTGATGTATCTGATAAACAAGGA-3′) og cyklin D1 mRNA (forover, 5»-AACTACCTGGACCGCTTCCT-3 «og omvendt, 5 «-CCACTTGAG CTTGTTCACCA-3»). Ekspresjonselementene data ble normalisert til den geometriske middel ekspresjonsnivået av husholdningsgenet
GAPDH plakater (forover, 5′-GACTCATGACCACAGTCCATGC-3 «, omvendt, 3′-AGAGGCAGGGATG ATGTTCTG -5») og beregnet ved hjelp av to
– [(Ct på
p21, p27, eller cyclin D1
) – (Ct
av
GAPDH
)], hvor C
t representerer terskelen syklus for hver transkripsjon .
3- (4, 5-dimetyl-2-tiazolyl) -2, 5-difenyl-2H-tetrazolium-bromid (MTT) assay
Celler ble sådd ut i 96-brønners plater. Ved de angitte tidspunkter ble cellene inkubert med 100 ul sterilt MTT (0,5 mg /ml, Sigma) i fire timer ved 37 ° C, og deretter ble mediet fjernet og erstattet med 150 ul dimetylsulfoksid (DMSO, Sigma). Absorbans ble målt ved 570 nm med 655 nm som referansebølgelengde. Alle forsøk ble utført in triplo.
forankrings-uavhengig vekst evne assay
Fem hundre celler ble trypsinisert og resuspendert i 2 ml fullstendig medium inneholdende 0,3% agar (Sigma). Agar-celleblandingen ble sådd ut på fullstendig medium inneholdende 1% agar. Etter 10 dager ble levedyktige kolonier som målt ved anvendelse av en okulær mikrometer og kolonier som inneholdt mer enn 50 celler og kolonier større enn 0,1 mm i diameter ble tellet. Eksperimentet ble gjennomført tre uavhengige ganger for hver cellelinje.
kolonidannelse assays
Celler ble sådd ut i 6-brønns plater (0,5 x 10
3-celler per plate), dyrket i 10 dager, fiksert med 10% formaldehyd i 5 min, farget med 1,0% krystallfiolett i 30 s og telles.
bromdeoksyuridin merking og immunfluorescens
Celler dyrket på dekkglass (Fisher, Pittsburgh, PA , USA) ble inkubert med bromdeoksyuridin (BrdU) i 1 time og deretter farget med et anti-BrdU antistoff (Upstate, Temecula, CA, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. Grå nivå bildene ble anskaffet ved hjelp av en laser scanning mikroskop (Axioskop 2 pluss, Carl Zeiss Co Ltd, Jena, Tyskland).
luciferase analysene
prostata kreft celler (3,5 × 10
4) ble sådd i tre eksemplarer i 24-brønners plater, lov til å bosette seg i 24 timer og deretter co-transfektert med 100 ng P3X IRS-MLP luciferase plasmid DNA, 100 ng pGL3-FOXO1-3’UTR (vekt /mu) plasmid DNA eller 100 ng pGL3 kontroll-luciferase-plasmid og 1 ng av styre Renilla plasmidet PRL-TK (Promega) ved anvendelse av Lipofectamine 2000 (Invitrogen) i overensstemmelse med produsentens instruksjoner. Luciferase og Renilla aktivitet ble målt 48 timer etter transfeksjon med Dual luciferaserapportørplasmid Assay Kit (Promega) i henhold til produsentens instruksjoner. Tre uavhengige eksperimenter ble utført, og dataene er presentert som gjennomsnitt ± SD. Luciferase aktivitetsverdier normalisert til Renilla aktivitet.
Strømningscytometri-analyse
Cellene ble høstet ved trypsinering, vasket i iskald PBS, fiksert i iskald 80% etanol i PBS, sentrifugert ved 4 ° C og resuspendert i kald PBS. Bovint pankreatisk RNAase (Sigma-Aldrich) ble tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 2 ug /ml, inkubert ved 37 ° C i 30 min, deretter 20 ug /ml propidiumjodid (Sigma-Aldrich) ble tilsatt og inkubert i 20 min ved værelses temperatur. I hver gruppe ble 50.000 celler analysert ved flowcytometri. (FACSCalibur, BD Biosciences, San Jose, CA, USA)
Statistisk analyse
Den tosidige Student
t
-test ble anvendt for å vurdere betydningen av forskjellene mellom to grupper;
P
verdier 0,05 ble betraktet som signifikant
Resultater
MiR-370 er oppregulert i prostata kreft cellelinjer
Real-time PCR-analyse avdekket. at MIR-370 uttrykk ble markert økt i alle fem prostata kreft cellelinjer som ble testet (Tsu-PR1, PC3, DU145, 22Rv1 og LNCaP), sammenlignet med normal prostata epitel (PREC) celler (figur 1A), noe som indikerer at MIR-370 er oppregulert i prostatakreftcellelinjer
a, real-time PCR analyse av Mir-370 uttrykk i normale prostata epitelceller. (PrECs, vist som N1 og N2) og prostatakreft cellelinjer inkludert PC3, DU145, 22Rv1 og LNCaP celler B, MTT analyser indikerer at spredning av MIR-370-transfekterte celler økt, sammenlignet med negativ kontroll (NC) -transfected celler. C, Colony dannelsen analysen av MIR-370 overekspresjon celler; representative mikrografer (til venstre) og kvantifisering (høyre) av krystallfiolett farget cellekolonier. D, Kvantifisering av Ki-67 positive celler i PC3 og DU145 cellene transfektert med Mir-370 etterligne eller negativ kontroll (NC) 48 timer etter transfeksjon. E, oppregulering av MIR-370 forfremmet prostatakreft celle tumorigenicity; representative mikrografer (til venstre) og kvantifisering av kolonier som inneholder mer enn 50 celler (i midten) eller kolonier større enn 0,1 mm (til høyre) i ankeruavhengig vekst analysen. Stolper representerer gjennomsnittet ± SD-verdiene for tre uavhengige eksperimenter; *
P
0,05
Overuttrykte MIR-370 øker spredning og forbedrer tumorigenicity
For å undersøke funksjonen av MIR-370 i prostatakreft. transfektert vi en HSA-Mir-370 etterligne i PC3 og DU145 prostata kreft celler og målt celleproliferasjon. Ved hjelp av MTT og kolonidannelse analyser, observerte vi at veksten av MIR-370 overekspresjon celler ble dramatisk økt, sammenlignet med negativ kontroll (NC) -transfected prostatakreftceller (Figur 1B og 1C). Videre er andelen av Ki-67 positive celler, en kjent indikator på prolifererende celler, ble betydelig øket i celler som uttrykker ectopically MIR-370, sammenlignet med NC-transfekterte celler (figur 1D). Resultatene viste at oppregulering av MIR-370 fremmer spredning av prostata kreft celler.
Videre ektopisk uttrykk for MIR-370 i PC3 og DU145 prostatakreftceller betydelig forbedret forankringsuavhengig vekst evne og føre til økt koloni tall og størrelser i myk agar-kolonidannelse analysen (figur 1F), noe som tyder på at oppregulering av MIR-370 økt prostatakreft celle tumorigenicity
in vitro
. Samlet utgjør disse forsøkene viste at oppregulering av MIR-370 forfremmet spredning og transformasjon av prostatakreftceller.
Overuttrykte MIR-370 fremmer G1 /S cellesyklus overgang i prostatakreftceller
Vi undersøkte videre effekten av MIR-370 på spredning ved hjelp av flowcytometri. MiR-370-overekspresjon PC3 og DU145-celler hadde en signifikant lavere prosentdel av celler i G1 /G0 fase og økte prosentandelen av celler i S-fasen, sammenlignet med NC-transfekterte celler (figur 2A). I tillegg ble økt antall BrdU-inkorporering celler observert i MIR-370-transfekterte celler, sammenlignet med NC-transfekterte celler (figur 2B). Kollektivt, disse dataene antydet at overekspresjon av MIR-370 kan øke spredning av prostata kreft celler ved å fremme G1 /S cellesyklus overgang.
, Flowcytometrisk analyse av PC3 og DU145 cellene transfektert med Mir-370 etterligne eller negativ kontroll (NC) 48 timer etter transfeksjon. B, Representative mikrografer (til venstre) og kvantifisering (høyre) av BrdU inkorporering analysen i PC3 og DU145 cellene transfektert med MIR-370 eller NC 48 timer etter transfeksjon. C, Western blotting-analyse som indikerer redusert uttrykk av p21
Cip1, p27
Kip1 og økt uttrykk av cyclin D1 og fosforylert Rb (p-Rb) i PC3 og DU145 cellene transfektert med MIR-370 eller NC 48 timer etter transfeksjon . α-tubulin ble anvendt som en kontroll lasting. D, Real time PCR-analyse av
p21
Cip1, p27
Kip1 Hotell og cyclin D1 mRNA i PC3 og DU145 cellene transfektert med MIR-370 eller NC 48 timer etter transfeksjon.
GAPDH
ble anvendt som en kontroll lasting. Stolper representerer gjennomsnittet ± SD-verdiene for tre uavhengige eksperimenter; *
P
. 0,05
MiR-370 reduserer uttrykk for celle-syklus hemmere
p21
Cip1 Hotell og
p27
Kip1 Hotell og øker uttrykk av cellesyklusen regulator cyclin D1
som MIR-370 forfremmet celleproliferasjon, vi utforsket effekten av MIR-370 på uttrykket av gener som regulerer G1 /S overgang [4 ] – [6], inkludert CDK hemmere p21
Cip1 og p27
Kip1 og CDK regulator cyclin D1. Ved hjelp av Western blotting og real-time PCR-analyse, observerte vi at p21
Cip1 og p27
Kip1 protein og mRNA ble nedregulert og cyklin D1-protein og mRNA ble oppregulert i MIR-370-transfekterte celler, sammenlignet med NC-transfekterte celler (figur 2C og 2D). Sammenfallende med endret ekspresjon av cellesyklus regulatorer, fosforyleringen nivået av Rb, en nedstrøms målprotein av CDK, var signifikant økt i MIR-370-transfekterte celler (figur 2C), noe som ytterligere bekrefter at MIR-370 kan påvirke proliferasjon av prostata kreftceller.
Hemming av MIR-370 reduserer spredning av prostata kreft celler
Som beskrevet ovenfor, spiller MIR-370 en avgjørende rolle i spredning av prostata kreft celler. Det var imidlertid ikke kjent om hemme MIR-370 vil redusere celleproliferasjon. Som forventet, hemming av MIR-370 økt transkripsjon av
p21
Cip1 Hotell og
p27
Kip1 Hotell og redusert uttrykk for cyclin D1 mRNA (figur 3A). I tillegg inhibering av MIR-370 økte betydelig prosentandelen av celler i G0 /G1 fase og reduserte prosentandelen av celler i S-fasen (Figur 3B). Dessuten, ved anvendelse av MTT-analysen, oppdaget vi at ektopisk ekspresjon av HSA-MIR-370 hemmer reduserte veksten av PC3 og DU145 prostatakreftceller, sammenlignet med NC-transfekterte celler (figur 3C). I tillegg, som vist i figur 3D, inhibering av MIR-370 reduserte kolonitall og koloni størrelser av PC3 og DU145 celler i kolonidannelsesbestemmelsen, og også betydelig redusert den forankrings-uavhengig vekst evne til begge cellelinjer.
real-time PCR-analyse av
p21
Cip1, p27
Kip1 Hotell og cyclin D1 mRNA i PC3 og DU145 cellene transfektert med MIR-370-hemmer eller negativ kontroll (NC) 48 timer etter transfeksjon .
GAPDH
ble anvendt som en kontroll lasting. B, Flowcytometrisk analyse av PC3 og DU145 cellene transfektert med MIR-370-hemmer eller NC 48 timer etter transfeksjon. C, MTT-analyser avslørte at inhibering av MIR-370 redusert cellevekst. D, Representative mikrografer (til venstre) og kvantifisering av kolonier som inneholder mer enn 50 celler (i midten) eller kolonier større enn 0,1 mm (til høyre) i forankringsuavhengig vekst analyser. Stolper representerer gjennomsnittet ± SD-verdiene for tre uavhengige eksperimenter; *
P
. 0,05
MiR-370 direkte rettet mot transkripsjonsfaktor
FOXO1
i prostatakreftceller
En tidligere studie viste at FOXO1 kan regulere en rekke gener som er relevante for cellesyklusen på en transkripsjonsnivået, inkludert
p21
Cip1
,
p27
Kip1 Hotell og cyclin D1 mRNA. Parallelt vår analyse ved hjelp av tre offentlig tilgjengelige algoritmer (TargetScan, Pictar, Miranda) viste at MIR-370 kan direkte rettet mot 3′-UTR av
FOXO1 plakater (Figur 4A). Disse dataene indikerte at MIR-370 kan modulere uttrykk for p27
Kip1, p21
Cip1 og cyclin D1 ved å regulere
FOXO1
. Som vist i figur 4B, Figur S2A og figur 4C, ektopisk ekspresjon av MIR-370 reduserte protein og mRNA-ekspresjonsnivåene av FOXO1 i PC3 og DU145-celler, noe som indikerer at
FOXO1
er en potensiell MIR-370 målgenet . FOXO1 er nedregulert i prostatakreftceller (Figur S1 A og figur 1A); som sannsynligvis vil være knyttet til oppregulering av MIR-370 i prostatakreftceller (figur 1), noe som vil redusere uttrykket av Mir-370 mål genet
FOXO1
.
A, Sekvens av
FOXO1
3’UTR MIR-370 bindende frø regionen og mutasjon av
FOXO1
3′-UTR frø regionen for å skape FOXO1-mu. B, Western blotting analyse av FOXO1 uttrykk i MIR-370 eller negativ kontroll (NC) -transfected PC3 og DU145 cellene 48 timer etter transfeksjon. C, Relative FOXO1 reporter aktiviteter i MIR-370 eller NC-transfekterte celler 48 timer etter transfeksjon. D, Western blotting-analyse av GFP reportergenekspresjon i MIR-370 eller NC-transfekterte celler 48 timer etter transfeksjon. E, relativ luciferase aktivitet av PC3 eller DU145 prostata kreft celler kotransfektert med økende mengder Mir-370 etterligne oligonukleotider (20, 50 nm), og pGL3 kontroll reporter, pGL3-FOXO1-3’UTR reporter, eller pGL3-FOXO1 -3’UTR-mu reporter, 48 timer etter transfeksjon, henholdsvis. Stolper representerer gjennomsnittet ± SD-verdiene for tre uavhengige eksperimenter; *
P
. 0,05
For å bekrefte funksjonen til den antatte MIR-370 bindingsstedet i
FOXO1
3′-UTR, vi klonet
FOXO1
3′-UTR inn reporteren plasmidene pEGFP-C3 og pGL3. GFP protein uttrykk ble dramatisk hemmet av ektopisk uttrykk for MIR-370 i PC3 og DU145 cellene, sammenlignet med kontrollgruppen plasmid GFP-γ-tubulin, noe som tyder på at MIR-370 er spesielt rettet mot den
FOXO1
3 «UTR. Transfeksjon av MIR-370 gående og doseavhengig redusert luciferase aktiviteten av
FOXO1
3′-UTR luciferase reporter plasmid i PC3 og DU145 prostatakreftceller (Figur 4E). Videre undertrykkende effekt av MIR-370 på
FOXO1
3′-UTR ble opphevet ved punktmutasjoner i MIR-370-binding frø regionen av
FOXO1
3′-UTR ( Figur 4E). Resultatene viste at
FOXO1
er en
bona fide
målet på MIR-370.
Transfeksjon av en MIR-370 inhibitor restaurert luciferase aktiviteten av pGL3-FOXO1- 3’UTR reporter plasmid i PC3 og DU145 prostatakreftceller (figur 5A), og oppregulert FOXO1 protein uttrykk (figur 5B). Videre inhibering av MIR-370 gående og doseavhengig øket luciferaseaktiviteten av pGL3-FOXO1-3’UTR i begge prostata cancer-cellelinjer (figur 5C). Til sammen tyder disse resultatene på at hemming av MIR-370 oppregulert FOXO1.
Relativ luciferase aktivitet analyse av PC3 og DU145 cellene co-transfektert med pGL3-FOXO1-3’UTR plasmid og økende mengder (20, 50 nM) av MIR-370 mimic- eller MIR-370 inhibitor-oligonukleotider, 48 timer etter transfeksjon, henholdsvis. B, Western blotting analyse av FOXO1 uttrykk i MIR-370 eller negativ kontroll (NC) -transfected PC3 og DU145 cellene 48 timer etter transfeksjon. C, Luciferase aktivitetsanalyse av PC3 og DU145-celler transfektert med den pGL3-plasmid FOXO1-3’UTR og økende mengder (20, 50 nM) av MIR-370 Inhibitor-oligonukleotider som 48 timer etter transfeksjon. Stolper representerer gjennomsnittet ± SD-verdiene for tre uavhengige eksperimenter; *
P
. 0,05
For å bekrefte effekten av MIR-370 overekspresjon i prostatakreftceller (figur 1), kvantifisert vi uttrykk for FOXO1 i prostatakreftceller. Vi observerte at FOXO1 er nedregulert i prostatakreftceller (Figur S1 A og figur 1A); bekrefter at overekspresjon av MIR-370 nedregulerer Mir-370 mål genet
FOXO1
i prostatakreftceller.
MiR-370-indusert prostatakreft celleproliferasjon moduleres av FOXO1
For å undersøke om FOXO1 kunne undertrykke MIR-370-indusert spredning,
FOXO1 plakater (uten 3′-UTR) og
FOXO1
-3′-UTR (med 3′-UTR) ble transfektert inn MIR-370-overekspresjon prostatakreftceller. Som forventet, ektopisk uttrykk for FOXO1 føre til vesentlig større endringer i uttrykket av
p27
Kip1
,
p21
Cip1 Hotell og cyclin D1 mRNA enn FOXO1-3’UTR (figur 6A). Spesielt etter transfeksjon av en FOXO1 reporter gen og MIR-370 i PC3 og DU145 prostata kreft celler, luciferase aktivitet kan gjenopprettes ved overekspresjon av FOXO1 og delvis reddet av transfeksjon av FOXO1-3′-UTR (figur 6B). Videre ble veksten av både PC3 og DU145 prostata kreft celler hemmet til en betydelig større grad av co-transfeksjon av MIR-370 og FOXO1 enn co-transfeksjon av FOXO1-3′-UTR og MIR-370 (figur 6C). I konklusjonen, disse resultatene tyder på at Mir-370-indusert prostatakreft celleproliferasjon er direkte formidlet av undertrykkelse av
FOXO1
.
Real-time PCR-analyse av
p21
Cip1 , p27
Kip1 Hotell og cyclin D1 mRNA uttrykk i de indikerte cellene.
GAPDH
ble anvendt som en kontroll laste 48 timer etter transfeksjon. B, Luciferase aktivitetsanalyse av de angitte celler transfektert med en FOXO1 reporter 48 timer etter transfeksjon. C, MTT analyse av prostata kreft celler transfektert med Mir-370 etterligne, co-transfektert med MIR-370 og FOXO1, eller co-transfektert med MIR-370 og FOXO1-3′-UTR.
diskusjon
i denne studien, viste vi at MIR-370 er oppregulert i prostatakreftcellelinjer, sammenlignet med primær normale prostata epitelceller. Oppregulering av MIR-370 fremmet G1 /S cellesyklus overgang i prostatakreftceller som korrelerte med nedregulering av cyclin-avhengig kinase (CDK) hemmere p27
Kip1 og p21
Cip1. Motsatt, hemming av MIR-370 redusert prostatakreft cellevekst, oppregulert p27
Kip1 og p21
Cip1, og forsinket G1 /S overgang. MiR-370 oppregulert cellesyklus regulator cyclin D1 ved direkte rettet mot den
FOXO1
3′-UTR, viser at FOXO1 reguleres av MIR-370 i prostatakreftceller. Sammen er disse funnene tyder på at oppregulering av MIR-370 kan fremme initiering og progresjon av prostatacancer.
Det er blitt demonstrert at FOXO1 ekspresjon blir regulert av en rekke microRNAs, slik som MIR-223, MIR-182, MIR-27a, MIR-139 og MIR-96 [39] – [43]. Av disse kan noen microRNAs bli dysregulerte i prostata kreft, slik som MIR-27a, MIR-182 [41], [44].
