Abstract
De fleste kliniske tilfeller av leverkreft kan ikke diagnostisert før de har utviklet seg til et avansert stadium, noe som resulterer i høy dødelighet. Det er velkjent at gjennomføringen av tidlige deteksjonsmetoder og utvikling av målrettet terapi for leverkreft er viktig for å redusere de høye dødeligheten assosiert med denne sykdommen. For å oppnå disse målene, er molekylære prober stand til å gjenkjenne leverkreft cellespesifikke mål trengs. Her beskriver vi et panel av aptamerer stand til å skille hepatokarsinom fra normale leverceller. De aptamerer, som ble valgt av cellebasert SELEX (Systematisk Utviklingen av ligander av eksponensiell Enrichment), har Kd-verdier i området fra 64 til 349 nM mot målet human hepatomcellelinje HepG2, og også gjenkjenne eggstokkreft celler og lunge adenokarsinom. Den proteinase behandling eksperiment viste at alle aptamerer kunne gjenkjenne målet HepG2 cellene gjennom overflateproteiner. Dette resultatet antydet at disse aptamerer kan brukes som potensielle prober for videre forskning på studier av kreft, slik som utvikling av tidlig deteksjon analyser, målrettet terapi, og billeddannende midler, såvel som for undersøkelse av vanlige membranproteiner i disse skjelnes kreft.
Citation: Xu J, Teng IT, Zhang L, Delgado S, Champanhac C, Cansiz S, et al. (2015) Molekylær Anerkjennelse av humane lever kreftceller ved hjelp av DNA-aptamerer genereres via Cell-SELEX. PLoS ONE 10 (5): e0125863. doi: 10,1371 /journal.pone.0125863
Academic Redaktør: Vittorio De Franciscis, Consiglio Nazionale delle RICERCHE (CNR), ITALIA
mottatt: 26 februar 2015; Godkjent: 25 mars 2015; Publisert: 04.05.2015
Copyright: © 2015 Xu et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health GM079359 og National Institutes of Health CA133086; Statens Scholarship Fund, PI = Jiehua Xu; National Natural Science Foundation of China 81101866, PI = Jiehua Xu; National Natural Science Foundation of China 81430041, PI = Jiehua Xu; og grunnleggende forskning Midler til sentrale universiteter 11ykpy41, PI = Jiehua Xu. Finansiører hadde ingen rolle i studien degign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Leverkreft kreft~~POS=HEADCOMP er den sjette vanligste kreftformen i verden, og den tredje største årsaken til kreft-relaterte dødsfall [1], noe som resulterer i 0,7 millioner dødsfall årlig. Som den største indre organ og det største kjertel i menneskekroppen, tjener leveren mange vitale funksjoner, inkludert å bryte ned og lagring av næringsstoffer som kreves for energiproduksjon eller reparasjon av vev, filtrering og nedbrytende giftig avfall i blodet, syntetisere de fleste av koagulasjonsfaktorer som holder kroppen fra massive blødninger, og produserer kjemikalier og hormoner som er nødvendig for å regulere mange kroppsfunksjoner. Til tross for dette kritisk rolle, er utvikling av leverkreft sjelden diagnostisert i en tidlig fase, fordi i de fleste tilfeller, ikke symptomene ikke vises før de senere stadier, noe som gjør det til en svært dødelig malignitet med en liten 5-års overlevelse. Således utvikler tidlig påvisningsmetoder og avansert målrettet terapi er viktig i bekjempelsen leverkreft.
aptamerer er korte, enkelt-trådet DNA eller RNA-oligonukleotider er i stand til spesifikk binding til en rekke av tilsvarende mål-molekyler med høy affinitet. Fremgangsmåten for å generere aptamerer kalt SELEX (Systematisk Utviklingen av ligander av eksponensiell Enrichment) [2, 3] følger en serie trinn: 1) kjemisk syntese av et oligonukleotid-bibliotek som har 10
13-10
16 enkelt-trådet nukleinsyremolekyler, 2) direkte eksponering av biblioteket til målene for å skille bindende tråder fra tilskuerne, 3) utvinning og forsterkning av overlevende, 4) anrikning av de aptamer overlevende ved iterative runder, og til slutt 5) sekvensering for å identifisere individuelle kandidater.
SELEX teknologien ble videreutviklet i vårt laboratorium for å utnytte hele celler som mål i aptamer utvelgelsesprosessen. Den celle-SELEX prosessen sikrer at kandidat oligonukleotider bindes til den opprinnelige tilstand av protein mål på kreftcelleoverflaten [4]. Ved hjelp av celle SELEX kan aptamerer genereres for syke celler uten forutgående kunnskap om et gitt mål molekylære signatur, og dermed gjør det mulig å oppdage molekylære prober for sykdommer med hittil ukjente biomarkører, som senere kan identifiseres ved hjelp av kjemiske og molekylærbiologiske metoder [5 , 6]. En rekke aptamerer stand til å gjenkjenne forskjellige celletyper, inkludert røde blodceller (RBC) [7], og celler for lymfatisk leukemi [4], myeloid leukemi [8], kolorektal kreft [9], brystkreft [10], eggstokk kreft [11], småcellet lungekreft [12], ikke-småcellet lungekreft [13, 14], og kreft i bukspyttkjertelen [15], har alle blitt generert ved hjelp av denne metoden. I tillegg har flere celleoverflate biomarkør-aptamer-par er identifisert, inkludert alkalisk fosfatase fra placenta-lignende 2 (ALPPL-2) [15], Prominin-1 (CD133) [16], epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) [17] , human epidermal vekstfaktor-reseptor-2 (HER2) [18, 19], immunoglobulin tung kjede mu (IGHM) [20], protein-tyrosin-kinase 7 (PTK7) [4, 5], og deres tilsvarende aptamerer. Oppdagelsen av kreftspesifikke aptamerer gir stort potensial i biomedisinsk forskning og i utvikling av cellespesifikk diagnose og terapi [21], spesielt når celleoverflate biomarkører er ofte knyttet til celle forskrifter eller signalveier.
Som oligonukleotider , aptamerer er lett reproduserbare ved kjemisk syntese med et minimum av batch-til-batch-forskjeller. Dessuten, med kjemisk modifisering, er det lett å innføre funksjonelle moduler på aptamerer for å oppfylle spesifikke behov, for eksempel fluoroforer [22-25], kjemiske linkere [26, 27], terapeutika [28-30], eller til og med nanopartikler [31- 33]. Med de ovennevnte bemerkelsesverdige egenskaper, har utviklingen av aptamerer blitt utnyttet i forskjellige områder, spesielt de som involverer biomedisinske anvendelser [34-41]. Videre forskning har ført til forbedring av spesifisitet og effekt av å levere bilde, diagnostiske eller terapeutiske midler med eskorte aptamerer [24, 33, 42].
Hensikten med denne studien var å oppdage aptamerer som gjenkjenner hepatocellulær karsinom (HCC), som er den viktigste form for leverkreft, sto for 90% av alle lever-kreft [43]. Her ble celle-SELEX-metoden som brukes for å generere aptamerer som er i stand til å differensiere human leverkreft levercellelinje HepG2 fra normal lever epitelcellelinje thle-2. Disse aptamerer kan brukes som verktøy i videre biomedisinske studier og kliniske applikasjoner.
Materialer og metoder
Cell Kultur og Buffere
HepG2 (leverkreft) og thle-2 ( normale leverceller) ble valgt som positive og negative seleksjons celler, respektivt. Andre cellelinjer, inkludert HeLa (livmorhalskreft), MCF-7 og MDA-MB-231 (bryst adenokarsinom), PL45 (kreft i bukspyttkjertelen), H226 (lunge plateepitel karsinom), A549 (lunge adenokarsinom), Ramos (Burkitt lymfom), CCRF-CEM (T-celle leukemi), og TOV-21G (ovariekreft), ble anvendt for å undersøke selektiviteten til aptamer kandidater. Alle cellelinjer ble kjøpt fra American Tissue Culture Collection (ATCC). HepG2, A549, MCF-7, og PL45 ble opprettholdt i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM); Ramos, CCRF-CEM, H226 og HeLa celler ble opprettholdt i RPMI-1640. Den TOV-21G-cellelinjen ble opprettholdt i kultur med MCBD 105: Medium 199 (1: 1). Alle ovennevnte media ble kjøpt fra Sigma-Aldrich. MDA-MB-231-cellelinjen ble dyrket i Leibovitz L-15 medium (ATCC) ved 37 ° C og hindret fra å kontakte CO
2. BEGM Bullet Kit (Lonza /Clonetics Corporation) ble anvendt for å fremstille vekstmedium for thle-2-celler. Gentamycin /Amphotericin (GA) og Adrenalin ble fjernet fra settet, men en ekstra 5 ng /ml epidermal vekstfaktor (EGF), 70 ng /ml phosphoethanolamine, og alle andre additiver i settet ble inkludert i basalmedium. Alle media ble supplert med 10% varme-inaktivert føtalt bovint serum (FBS) (Gibco) og 1% penicillin-streptomycin (100 enheter /ml penicillin og 100 mg /ml streptomycin) (Gibco). Alle celler, med unntak av MDA-MB-231, ble inkubert ved 37 ° C under en 5% CO
2 atmosfære.
Vaske-buffer ble fremstilt fra Dulbeccos fosfatbufret saltvann (PBS) med kalsiumklorid og magnesiumklorid (Sigma-Aldrich) med ekstra glukose (4,5 g /l) og MgCl
2 (5 mM). Bindingsbuffer ble fremstilt ved tilsetning av gjær-tRNA (0,1 mg /ml) (Sigma-Aldrich) og BSA (1 mg /ml) (Fisher) i vaskebuffer.
Syntese og rensing av DNA-biblioteket og Primere
fremover og revers primere ble merket med FAM og biotin, henholdsvis på deres 5′-ender. Sekvensen av forover primeren var 5′-FAM-AGA GAC CCT GAC TGC GAA-3 «; sekvensen av den reversprimeren var 5»-biotin-AAG AAG CCA CCG TGT CCA-3 «. DNA bibliotek besto av en randomisert 25-nt regionen flankert av primer bindingssteder: 5»-AGA GAC CCT GAC TGC GAA- (N
25) -TGG ACA CGG TGG CTT CTT-3 «. Alle bibliotek og primer sekvenser ble kjøpt fra Integrerte DNA Technologies (IDT) og renset ved omvendt fase HPLC.
Polymerase Chain Reaction
PCR forsterkning parametre ble optimalisert før utvelgelsesprosessen. Alle PCR-blandinger inneholdt 50 mM KCI, 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 1,5 mM MgCl
2, dNTP (0,2 mM hver), 0,5 M av hver primer, og Varmstart Taq DNA-polymerase (0,015 enheter /ul) . PCR ble utført på enten en BioRad T100 eller C1000 Thermo Cycler, og alle PCR reagenser ble kjøpt fra Takara. Hver forsterkning syklus ble utført ved 90 ° C i 30 sek, 57 ° C i 30 sek, og 72 ° C i 30 sekunder, etterfulgt av en endelig forlengelse i 3 minutter ved 72 ° C.
in vitro
Utvalg
den celle SELEX prosessen ble utført basert på protokollen [44] utviklet av vår gruppe med noen modifikasjoner. Utvalget ble utført på cellemono, som både positive HepG2 og negative thle-2 er brukt her er tilhenger cellelinjer. For den første runden av markeringen, DNA pool besto av 20 nmol av oligonukleotidet bibliotek i 700 ml bindingsbuffer. For senere runder, ble 250 nM av oligonukleotider forsterket fra forrige rester bassenget brukt. DNA-bibliotek ble oppvarmet ved 95 ° C i fem minutter, fulgt av hurtig avkjøling på is i 5 minutter før inkubasjon, slik at DNA-sekvensene for å danne de mest fordelaktige sekundære strukturer. DNA-bibliotek ble så inkubert med monolags HepG2 celler i 1 time ved 4 ° C etter fjerning av medium og vasking to ganger med vaskebuffer. Inkubasjonstiden ble redusert som det merkede forløp: 60 min for runde 1 og 2, 45 min for runde 3, og 30 min for alle etterfølgende runder. Mellom hver syklus ble cellene vasket tre ganger med vaskebuffer for å fjerne ubundet sekvenser. Vasketiden og volumet av vaskebuffer ble øket som markeringen utviklet for å fjerne svake kandidater og oppnå aptamerer med høy spesifisitet og selektivitet. Cellene ble så frigjort fra fatet med en celleskraper, og avfallet ble oppsamlet i 500 ul bindingsbuffer. Komplekset ble oppvarmet ved 95 ° C i 10 minutter og deretter sentrifugert ved 14000 rpm i 5 minutter. Supernatanten ble oppsamlet og var klar for PCR-amplifikasjon i løpet av de første to rundene når ingen negativ seleksjons var inkludert. For senere runder med negativ seleksjon, ble supernatanten inkubert med monolag av negative celler thle-2 i 1 time ved 4 ° C, og supernatantene ble samlet.
Supernatanten inneholdende bundne DNA-sekvenser ble amplifisert ved PCR ved hjelp av fami- og biotin-merkede primere. Antallet av optimaliserte PCR amplifiseringscykluser ble bekreftet med agarosegelelektroforese. Streptavidin-belagte sepharosekuler (GE Healthcare Life Sciences) ble anvendt for å isolere PCR-produktene fra reaksjonsblandingen. Den fluorofor-merket enkelt-trådet DNA (ssDNA) ble deretter separert fra det biotinylerte antisense-ssDNA ved eluering med 200 mM NaOH. Til slutt ble ssDNA avsaltet med en NAP-5-kolonne (GE) og gjenoppløst i bindingsbuffer.
Hele Utvelgelsesprosessen ble gjentatt inntil en vedvarende betydelig berikelse ble oppnådd ved 19. runde. Berikelse av bassengene ble analysert med flowcytometri (Accuri C6, BD).
Neste generasjons sekvensering og analyse
Beriket pool 19 ble valgt for sekvensering. Den ssDNA skilt fra bassenget 19 var PCR-forsterket igjen for å legge adapter sekvenser (CCA TCT CAT CCC TGC GTG TCT CCG TCT CCG ACT CAG AGA GAC CCT GAC TGC GAA og CCT CTC TAT GGG CAG TCG GTG ATA AGA AGC CAC CGT GTC CA ) og renset ved anvendelse av en PCR-rensesett (Qiagen). De rensede prøvene ble sendt til Ion Torrent neste generasjons sekvensering ved University of Florida, ICBR Sequencing Kjerne Facility. Produktene ble justert for å identifisere de mest tallrike sekvenser bruker Galaxy programvare. Enhver med færre enn 10 kopier ble fjernet fra analysen. De resterende leser (501084) ble deretter samlet, og de 20 mest tallrike sekvenser (Tabell S1 i S1 File) ble kjemisk syntetisert for ytterligere karakterisering.
Binding Analyse
Gjenn aptamer kandidater ble syntetisert ved standard fosforamiditt-metoden ved anvendelse av en 3400 DNA-syntetisator (Applied Biosystems) og renset ved omvendt fase HPLC (Varian Prostar ved anvendelse av en C18-kolonne og acetonitril /trietylammoniumacetat som mobil fase). Reagenser for syntese ble kjøpt fra Glen Research. BD Accuri C6 flowcytometri (BD Immunocytometry Systems) ble brukt til å overvåke berikelse av ssDNA sekvenser i bassengene i utvelgelsesprosessen og å vurdere binding affinitet og spesifisitet av de valgte aptamer kandidater. Ikke-enzymatisk celledissosiasjon løsning ble anvendt for å løsne cellene, og de dispergerte celler ble så vasket med vaskebuffer. Når protease-behandlede celler var nødvendig, ble trypsin benyttet i stedet for ikke-enzymatisk celledissosiasjon løsning. Trypsin og ikke-enzymatisk celledissosiasjon løsning ble begge innkjøpt fra Sigma-Aldrich. Bindingsanalyser ble utført ved hjelp av strømningscytometri etter inkubering av 4 x 10
5 dispergerte celler i 200 ul bindingsbuffer med bassenger eller aptamerer ved 250 nM i 30 min ved 4 ° C (eller 37 ° C som er indikert). For hver aptamer kandidat, bindingsaffinitet (som K
d) mot mål-cellelinje HepG2 ble evaluert ved anvendelse av Sigma Plot ved å tilpasse den relative midlere fluorescensintensitet av binding versus konsentrasjonen av de aptamerer hjelp av metnings ligningen Y = B
maxX /(K
d + X) (Y er spesifikk binding, ved en konsentrasjon på aptamer = X i nanomolar, og Bmax er maksimal binding.) Cellene ble inkubert ved 4 ° C i 30 minutter med en serie av konsentrasjoner (0,1, 0,5, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 250, 500, 1000, 2000 nM) av hver gjenvunnet aptamer med biotin-merket ved 5′-enden. Cellene ble deretter vasket to ganger med 1 ml vaskebuffer, ble suspendert i 200 ul bindingsbuffer inneholdende streptavidin-PE, og farget i 20 minutter. Cellene ble igjen vasket to ganger med 1 ml vaskebuffer og deretter suspendert i 100 ul bindingsbuffer for flowcytometrisk analyse. De biotin-merkede uselektert bibliotek ble anvendt som en negativ kontroll for å fastslå bakgrunnsbinding. Den midlere fluorescensintensitet av umerket bibliotek ble subtrahert fra den til den tilsvarende aptamer med målcellene for å bestemme den spesifikke bindingen av den merkede aptamer. Alle bindingsanalyser ble gjentatt tre ganger.
Resultater og Diskusjon
Utvelgelsesprosessen begynte med en tilfeldig bibliotek som inneholder omtrent 1,2 × 10
16 (20 nmol) ssDNA sekvenser av 61 nukleotider ( nt), fulgt av sekvensiell binding med target-HepG2-celler, eluering og påfølgende PCR-amplifikasjon for totalt 19 runder. Counter-utvalg med thle-2-celler ble introdusert i tredje runde og gjennomføres i alle de neste rundene for å eliminere muligheten for noen oligonukleotider erkjenner vanlige overflatemarkører på både mål og negative cellelinjer. Anrikning fremgang ble fulgt ved å teste bindingen av gjenvunnet ssDNA fra hver runde på målceller ved hjelp av strømningscytometri. Gradvise endringer i fluorescens intensitet ble observert i påfølgende runder. Den fluorescerende signal stoppet økende mellom rundene 17 og 19, noe som tyder på at mettet binding av beriket bassengene var oppnådd (fig 1A). Ingen åpenbare fluorescensintensitet økning ble funnet med normal thle-2 leverceller i bassenget 19 (fig 1B), som indikerer at, sammenlignet med den opprinnelige bibliotek anriket ssDNA basseng 19 viste preferensiell binding til HepG2-celler, ikke thle-2-celler.
(A) bindende analyser viste en merkbar endring i bulk binding av bassenget til leveren kreftceller (HepG2) og stoppet øke etter 17
th runde av valget. (B) En subtil reduksjon i fluorescensintensitet ble observert i de normale leverceller (thle-2), og nådde et minimum forskyvning i 19
th rund. Den røde kurven representerer celler inkubert med umerket første bibliotek.
ssDNA utvinnes fra runde 19 ble innlevert til neste generasjon dypt sekvensering. De mest tallrike 20-sekvenser (Tabell S1 S1 i fil) ble kjemisk syntetisert, merket med biotin ved 5 «enden, og deretter renset ved hjelp av HPLC. Sekvensene ble kvantifisert (UV 260/280) og fortynnet til standard konsentrasjoner.
Binding analyse ble utført ved å inkubere positive eller negative celler med 250 nM av hver aptamer kandidat. Ifølge flowcytometrisk analyse resultater, viste ingen av oligonukleotidene binding med thle-2 normale epitelceller leverceller, mens de syv aptamer kandidatene viste åpenbare endringer i fluorescensintensitet på HepG2-celler i forhold til en tilfeldig sekvens (figur 2, tabell S2 S1 fil), noe som tyder på at alle de valgte aptamerer kunne skille leverkreftceller fra normale leverceller.
de valgte aptamerer viste tydelig binding til hepatoma HepG2-celler (A), mens ingen fluorescens forbedring ble funnet med normale epitel-leverceller (B), ved hjelp av strømningscytometri. Eksperimenter ble utført ved 4 ° C.
bindingsaffiniteter for de valgte aptamerer ble deretter bestemt ved å evaluere dissosiasjonskonstantene (K
d). En mindre K
d verdien angir sterkere binding av det valgte aptamer til målcellene. Som angitt i tabell 1, de aptamerer rapportert i denne studien viste bindende slektskap mot HepG2 celler i nanomolar området (64-349 nM), noe som tyder på at disse aptamerer bundet fast til sine mål HepG2 celler.
For å hindre at bindende sekvenser blir internalisert, utførte vi
in vitro
utvalg ved 4 ° C, samt bmdingsanalyser nevnt ovenfor. De valgte aptamerer ikke miste sin anerkjennelse å målrette HepG2 celler ved fysiologisk temperatur (figur 3A). Fluorescensen skifte fra celler inkubert med aptamerer sammenlignet med celler inkubert med biblioteket ble bevart når bindingstester ble utført ved 37 ° C.
(A) forskyvning av fluorescens intensitet på HepG2 inkubert med hver av de utvalgte aptamerer holdt ved 37 ° C. (B) fluorescensstyrkene ikke forskyves når de HepG2 celler ble behandlet med trypsin i 30 minutter før inkubering, noe som indikerer at membranproteiner er de sannsynlige målene.
Det er blitt rapportert at aptamerer spesielt samhandler med overflaten av målcellene under valget [5, 20]; Derfor ble et annet sett med bindingstester (37 ° C) ved anvendelse av HepG2-celler ble behandlet med trypsin i 30 minutter før inkubering med prober utført for å undersøke om de valgte aptamerer ble rettet mot membranproteiner på HepG2. Som vist i figur 3B, alle valgte aptamerer mistet sin fortrinnsvis binding til biblioteket med protease-behandlede HepG2-celler, noe som indikerer målene for disse aptamerer er sannsynlig å være membranproteiner.
Det har blitt rapportert at visse proteiner er kreft-assosiert [45, 46]. Derfor identifisere vanlige proteiner som presenteres av kreftceller og undersøke deres relevans for kreft kan gi hint om kreftutvikling. Etter beviser de valgte aptamerer var i stand til å skille leverkreft fra normale lever epitelceller, vi videre undersøkt bindingen selektiviteten til aptamerer mot cellelinjer for andre typer kreft, inkludert lunge plateepitel karsinom (H226), lunge adenokarsinom (A549), livmorhals adenocarcinoma (HeLa), bryst adenokarsinom (MCF-7, MDA-MB-231), eggstokk-adenokarsinom (TOV-21G), pankreatisk adenokarsinom (PL45), og leukemi (Ramos, CCRF-CEM) (tabell 2). Det ble funnet at de syv aptamerer også vist signifikant binding til lunge adenokarsinom, eggstokk-kreft og embryonale nyreceller, noe som indikerer sterk mulighet for noen vanlige proteiner uttrykt av disse cellene, mens, på samme tid, viste de ingen affinitet til leukemi eller cervical kreftceller. Siden lungekreft er et vanlig mål for leverkreft metastaser [47], kan dette resultatet støtter bruken av disse aptamerer som molekylære prober for å studere kreft metastasering. I tillegg har alle de aptamerer oppviste gjenkjennelse til en brystkreftcellelinje MCF-7, men ikke den andre brystkreftcellelinje MDA-MB-231. Denne forskjell kan tilskrives det faktum at de er to distinkte subtyper i brystkreft. For eksempel, MCF-7 faller i Luminal En undertype med høyt uttrykt østrogenreseptor (ER) og progesteronreseptoren (PR), og MDA-MB-231 tilhører Basal-lignende subtype som er negative for ER og PR [48] . Følgelig, antyder dette resultatet at disse aptamerer kan anvendes for hormonavhengige kreft studier
Konklusjon
Alle syv aptamerer rapporteres her er i stand til å skille hepatoma fra normale leverceller.; de viste høye affiniteter overfor HepG2-cellelinjen ved 4 ° C (K
d’s fra 64 til 349 nM), så vel som ved 37 ° C, mens ingen påvisbar binding til normale leverceller ble observert. De proteinase behandlingsforsøk viste at alle de syv aptamerer gjenkjenne målcellen HepG2 gjennom overflateproteiner. I tillegg er disse aptamerer viste erkjennelse mot lungekreft, eggstokk-kreft, og Luminal A subtype brystkreft. Disse resultatene tyder på at disse aptamerer kan være potensielle prober for videre forskning på kreft studier, som utvikler tidlig deteksjon analyser, målrettet terapi og billeddannende midler, samt for etterforskningen av felles membran proteiner i disse skjelnes kreft.
Hjelpemiddel Informasjon
S1 fil. . Kombinert fil støtte tabeller
Tabell S1: Antall leser og prosentandel for de 20 mest tallrike sekvenser. Sequence # er utpekt i den rekkefølgen av overflod. Den totale # av lyder i hele DNA bassenget er 501 084. Blant de mest tallrike tjue sekvenser, er sju av dem rapportert som aptamerer rettet mot HepG2 celler. Tabell S2: Fluorescens intensitet detektert fra celler inkubert med 250 nM av hver av de aptamerer eller en vilkårlig 61-mer DNA-bibliotek. (G-middel: geometrisk gjennomsnitt)
doi: 10,1371 /journal.pone.0125863.s001 plakater (docx)
bekreftelser
Forfatterne takker Dr. Kwame Sefah for utforming primere og gi nyttige råd som bidro til dette arbeidet, Dr. Kathryn R. Williams for hennes kritisk gjennomgang av manuskriptet, og DNA-sekvensering kjernen, ICBR, ved University of Florida for å få hjelp i løpet av neste generasjons dypt sekvensering.
