Abstract
Aberrant Wnt /β-catenin signal har vært sterkt knyttet til tumorigenesis av menneskelig tykktarmskreft. Hemmere av denne veien kan da tilby terapeutiske strategier samt chemoprevention for ondartet sykdom. Henryin er en ent-kaurane diterpenoid isolert fra
Isodon
rubescens
var.
lushanensis
, en plante lenge vært brukt i folkemedisinen for å forebygge betennelser og gastrointestinal sykdom. I denne studien rapporterer vi at henryin selektivt hemmer spredning av menneskelige kolorektal kreft celler med en GI
50 verdien i nano-molar rekkevidde. Microarray analyse og reporter analyser viste at henryin jobbet som en roman antagonist av Wnt signalveien. Henryin redusert ekspresjon av Cyclin D1 og C-myc, og induserte G1 /S fase arrest i HCT116-celler. Samtidig henryin påvirket ikke cytosol-atom distribusjon av løselig β-catenin, men svekket foreningen av β-catenin /TCF4 transkripsjonen kompleks sannsynlig gjennom direkte blokkerer bindingen av β-catenin til TCF4. Vi analyserte struktur-aktivitetsforhold blant ent-kaurane typen diterpenoids. Våre data tyder på at henryin, som en roman hemmer av Wnt signalering, kan være en potensiell kandidat for ytterligere preklinisk evaluering for tykktarmskreft behandling, og som sådan garanterer videre leting
Citation. Li X, Pu J, Jiang S, Su J, Kong L, Mao B, et al. (2013) Henryin, en ent-kaurane diterpenoid, Hemmer Wnt signale gjennom Interferens med β-catenin /TCF4 Interaksjon i tykktarmskreftceller. PLoS ONE 8 (7): e68525. doi: 10,1371 /journal.pone.0068525
Redaktør: Chunming Liu, University of Kentucky, USA
mottatt: 04.03.2013; Godkjent: 30 mai 2013; Publisert: 02.07.2013
Copyright: © 2013 Li et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av både 100 Talenter Program (YL) og West Lys Foundation (JP) av den kinesiske Academy of Sciences, Major State Basic Research Development Program of China (No. 2009CB522300), Foundation of China Natural Science (No. 81173076, 81172939), og Rekruttert Top talent of Sciences and Technology i Yunnan-provinsen (2009C1120), Kina. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP (CRC) er en vanlig kreft som, til tross for fremskritt i behandling og bedre diagnose, er fortsatt en stor utfordring for den medisinske establishment verden. Selv om den eksakte patogenesen av sykdommen ikke er klart forstått, er kronisk betennelse tarmsykdom anses en risikofaktor som bidrar til utvikling og metastase for tykktarmskreft [1]. Tallrike studier har imidlertid antydet at avvikende aktivering av den kanoniske Wnt /β-catenin signalveien spiller en viktig rolle i tumorgenese. I fravær av wnt ligander, er β-catenin fosforylert av et kompleks som inkluderer adenomatøs polypose coli (APC) /Dsh /Axin /GSK3P, som deretter ubiquitinmolekyler og degradert gjennom proteasom-reaksjonsveien. Når reaksjonsveien blir aktivert ved binding av ligander til wnt sin membran reseptor-komplekset, blir β-catenin ødeleggelse komplekse dissosierer og β-catenin stabilisert seg og går inn i kjernen for å aktivere mål-genekspresjon i tandem med TCF transkripsjonsfaktorer [2,3 ].
i tykktarm kreft celler, Wnt /β-catenin veien er ofte abnormt aktivert [4-6]. Ifølge de siste rapportene fra Kreft Genome Atlas-nettverket, blir Wnt veien konstitutivt aktivert i over 90% av menneskelig tykktarmskreft med både genetiske og epigenetiske forandringer til en rekke gener som er involvert i Wnt signalveien, for eksempel β-catenin APC og Axin2 [7]. Aktivering av Wnt /β-catenin signale øker etterfølgende ekspresjon av wnt målgener, slik som Cyclin D1 [8], C-myc [9] og Survivin [10], som alle er involvert i celle-proliferasjon, apoptose og cellesyklus deregulering i utvikling og progresjon av maligne kolorektal kreft fenotyper [11-13].
til dags dato, fremskritt i behandling og diagnostisering av tykk- og endetarmskreft er fortsatt begrenset i sin effektivitet, spørre oss om å vurdere alternative muligheter i flytting framover. I folkemedisinen, noen
Isodon
arter, utbredt planter, brukes som te drikke for å forebygge betennelser, gastrointestinale bakterielle infeksjoner og selv svulster. Vi antok at kjemiske stoffer i noen
Isodon
arter sannsynlig besatt chemopreventive egenskaper samt kjemoterapeutiske effekter mot kreft. I vårt tidligere arbeid, ble mange kjemiske bestanddeler isolert og karakterisert fra
Isodon
arter, men studiet av deres bioaktive profil er svært begrenset og mekanismer mangler [14-16].
Vår nåværende studien fokuserer på screening forbindelser der det gis anti-tumor effekter, særlig på menneskelige kolorektal kreftceller. Vi fant ut at henryin, en ent-kaurane diterpenoid, isolert fra
Isodon
rubescens
var.
lushanensis
, utstilt selektive veksthemmende effekt på menneske kolorektal kreftceller ved å hemme Wnt signalering. Våre data viste at henryin forstyrrer β-catenin /TCF komplekst samspill og induserer G1 /S fase arrest i kolorektal kreftceller. Følgelig henryin, som romanen hemmer av Wnt /β-catenin veien, kunne gjøre en lovende medikament kandidat til både forebygging av tykktarmskreft, samt en roman terapeutisk.
Materialer og metoder
reagenser
RPMI 1640 medium, ble Dulbeccos modifiserte Eagle medium (DMEM), føtalt bovint serum (FBS), antibiotika løsning, og Trypsin-EDTA innkjøpt fra HyClone (Logan, UT, USA). Den komplette proteasehemmer cocktail ble kjøpt fra Roche Applied Science (Indianapolis, IN, USA). Mus monoklonalt anti-CyclinD1 og anti-β-catenin antistoffer ble kjøpt fra BD Biosciences (San Jose, CA, USA). Kanin monoklonalt anti-TCF4 og polyklonalt anti-fosfo-β-catenin antistoff ble innkjøpt fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA). Rabbit monoklonalt anti-p21 ble kjøpt fra Epitomics, Inc (Burlingame, CA, USA). Mus monoklonalt anti-lamin A /C, anti-β-aktin, anti-c-myc-antistoffer og andre reagenser, med mindre annet er angitt, ble innkjøpt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Rensede humane rekombinante proteiner β-catenin ble kjøpt fra Sino biologisk inc. Rensede humane rekombinante proteiner TCF4 ble kjøpt fra OriGene. Dual-luciferasereportergenet analysesystem ble kjøpt fra Promega (Madison, WI, USA). Lipofectamine 2000 ble kjøpt fra Invitrogen (Camarillo, CA, USA). Den QuantiTect SYBR, Grønn PCR Kit ble hentet fra Qiagen (Tyskland).
Forbindelser
Henryin og dets analoger ble hentet fra
Isodon
rubescens
Var .
lushanensis
, som tidligere beskrevet [14-16]. Forbindelsene ble oppløst i dimetylsulfoksid (DMSO).
Cellelinjer
Tykktarmskreft cellelinjer (SW480, HT-29 og HCT116), human lungekreft cellelinje A549, human normal lunge epithelial cellelinje (Beas-2B) og HEK293T ble kjøpt fra ATCC. Den normale colonic epitelial cellelinje (CCD-841-con) [17] ble velvillig Gitt av Dr Lin, Li ved Institutt for biokjemi og cellebiologi, Chinese Academy of Sciences (Shanghai, Kina). Cellene ble dyrket i henhold til produsentens anbefalinger. Alt medium ble supplementert med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% antibiotika-antimykotika (100 enheter /ml penicillin G-natrium, 100 mg /ml streptomycin) (Gibco, Invitrogen, USA).
MTS assay og GI
50 bestemmelse
Cellene ble sådd ut i 96-brønners plater i en tetthet på 5 x 10
3cells /brønn og inkubert i 12 timer i en CO
2 inkubator. Celler ble behandlet med en dose som strekker seg fra 0,008 til 4 um av henryin og dets analoger, med cisplatin som en positiv kontroll i 48 timer. Deretter ble 20 ul CellTiter 96® Aqueous One Solution Reagent (Promega, Madison, USA) tilsatt, og cellene ble ytterligere inkubert ved 37
° C i 1-2 timer. Cellelevedyktigheten ble deretter målt ved å avlese absorbans ved en bølgelengde på 490 nm. Den følgende formel ble anvendt for å bestemme cellevekstrate verdier: 100 * (A490 (prøve, T) – A490 (prøve, T0)) /(A490 (kontroll, T) – A490 (kontroll, T0)). GI
50 verdi de konsentrasjoner som forårsaker 50% hemming av cellevekst-ble bestemt ved ikke-lineær regresjonsanalyse ved bruk av programvare. Systat
Microarray og dataanalyse
SW480-celler ble inkubert med 4 um av henryin eller dimetylsulfoksid (DMSO) som en kontroll i 12 timer. Cellene ble lysert med TRIzol (Invitrogen, USA) og total RNA ble isolert med Qiagen RNeasy Mini Kit (Qiagen, Tyskland) før revers transkripsjon, merking og hybridisering til Agilent Whole Human Genome Oligo Mikromatrise (4 × 44K) (Agilent Technologies, Palo Alto, CA). Den microarray-analysen ble utført av Shanghai Bio Corporation. Etter GO merknader og sti analyse, ble gener med mer enn 2 ganger endring i uttrykket nivået som er valgt for videre analyse.
Cell transfeksjon og luciferaserapportørplasmid analyser
For reporter gen-analyser, celler ble sådd i 96-brønners plater og inkubert ved 37 ° C i 5% CO
2 inkubator i 12 timer. SW480 og HCT116 cellene ble ko-transfektert med 100 ng av plasmider totalt, inkludert 80ng av et godt karakterisert Wnt /β-catenin veien responsive ildflue luciferase reporter plasmid SuperTOPflash (ST-Luc) og 20 ng av PRL-SV40 (Promega) kontroll reporter plasmid bruker Lipofectamine 2000 (Invitrogen) i henhold til produsentens instruksjoner. Hver brønn av HEK293T celler ble transfektert med 200 ng av plasmider totalt, inkludert 80ng av ST-Luc og 20 ng av PRL-SV40 og 10 ng av β-catenin eller 64ng av wnt1 og tom vektor plasmider som angitt. Noen 3 timer etter transfeksjon ble cellene inkubert med forskjellige konsentrasjoner av forbindelser i 24 timer. Celler ble lysert med 50 ul av Promega lyseringsbuffer i hver brønn og luciferaseaktivitet ble målt og normalisert ved PRL-SV40 rapportøraktivitet. Alle forsøk ble utført in triplo uavhengig av hverandre. Resultatene er rapportert som gjennomsnitt og standardavvik (SD).
revers transkripsjon og kvantitativ real-time PCR
Total RNA ble ekstrahert fra dyrkede celler med TRIzol og revers transkripsjon ble utført ved hjelp av Super III Reverse Transcription Kit (Invitrogen) med oligo (dT) priming i henhold til produsentens instruksjoner. Gentranskriptene ble kvantifisert ved sanntids-PCR ved anvendelse av SYBR grønn I og β-aktin ble benyttet som en kontroll. Primtall som ble brukt var:
Menneskelig CyclinD1 frem primer: 5′-AAGTGCGAGGAGGAGGTCTT-3 «og omvendt primer: 5′-GGATGGAGTTGTCGGTGTAGA-3»
Menneske C-myc fremover primer: 5. «-CTTCTCTCCGTCCTCGGATTCT-3» og den reverse primer: «.
Humant β-actin forover primer: 5′-CGCGAGAAGATGACCCAGAT-3′ 5′-GAAGGTGATCCAGACTCTGACCTT-3 og revers primer: 5′-GATAGCACAGCCTGGATAGCAAC-3- «.
RT-PCR-eksperimenter ble utført in triplo og PCR effektivitet med å bruke primere som var mellom 95 og 100%. Melting kurver ble også utført for å overvåke primer spesifikke presiseringer.
cytosol og kjerne fraksjonering og western blotting analyse
SW480 celler ble behandlet med den henryin i seks-brønns plater. Fraksjonert nukleære og cytosoliske lysater ble oppnådd ved bruk av nukleær ekstraksjonsbuffer og hypotonisk lyseringsbuffer, respektivt. Alle protein utvinning buffere ble supplert med Komplett proteasehemmer cocktail og fosfatase inhibitor cocktail (Roche). Proteinkonsentrasjonen av hver rå lysat ble bestemt ved hjelp av forbedret BCA Protein Assay Kit (Beyotime, Shanghai, Kina). De normaliserte mengder av de lysatprøvene ble applisert på SDS-PAGE og overført til polyvinylidendifluorid (PVDF) membraner (Millipore, Bedford, MA, USA). Immunoblotting ble utført ved hjelp av antistoffer oppdage fosfor-β-catenin (Ser33 /37 /Thr41), β-catenin, Axin2, CyclinD1, C-myc, Survivin, P21, TCF4, med Lamin A /C og β-aktin brukt som laste kontroller . HRP-konjugert anti-mus-IgG og anti-kanin-IgG ble brukt som sekundære antistoffer. SuperSignal West Pico kjemiluminescenssubstrat (Thermo Scientific) ble brukt for å oppdage chemiluminescence, og blotter ble fotografert med selvlysende bilde Analyzer LAS-4000mini System (GE, USA).
Co-immunpresipitasjonsanalyse
SW480-celler ble dyrket i 6-brønns plater, behandlet med henryin og dets analoger enmenol og minheryin C i 12 timer, lysert i protein lyseringsbuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1 mM EDTA og proteinaseinhibitorer) og sentrifugert ved 14 000 x g i 15 min ved 4 ° C. Supernatanten ble inkubert med et spesifikt primært antistoff over natten ved 4 ° C og deretter inkubert med A /G PLUS agarose (Santa Cruz Biotechnology, Inc.) i minst 2 timer. Kulene ble deretter vasket fem ganger, og re-suspendert i 50 ul SDS applikasjonsbuffer. Western blot analyse ble utført på prøvene.
In vitro
bindingsanalysen
For å analysere effekten av forbindelser i begrenser β-catenin /TCF4 bindende, rensede rekombinante proteiner ß -catenin (0.8μg) og TCF4 (0,5 ug) ble inkubert med henryin og dets analoger enmenol og minheryin C ved indikerte konsentrasjoner ved 4 ° C i 2 timer, henholdsvis. β-catenin /TCF4 komplekser ble revet ned ved hjelp av protein A /G Plus agarose perler mettet med β-catenin antistoff. Deteksjon ble deretter utført ved hjelp TCF4 antistoff i western blotting analyse.
Cell syklus analyse
HCT116-celler (5 × 10
5cells /brønn i 12-brønners plater) ble inkubert med henryin for 0h, 12h og 24h, henholdsvis. Alle adherente celler ble samlet opp og vasket to ganger med PBS. Celler ble fiksert med 70% etanol over natten. Fikserte celler ble vasket med PBS, og deretter farget med en 50 ug /ml propidiumjodid (PI) oppløsning inneholdende 50 ug /ml RNase A i 30 minutter ved romtemperatur. Fluorescens intensitet ble analysert ved FACSCalibur1 strømningscytometer (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Prosentandelene av cellene fordelt i ulike faser av cellesyklusen ble bestemt ved anvendelse av ModFIT LT 2,0.
statistikker og
Data er presentert som gjennomsnitt ± SD for de angitte mengder uavhengig av hverandre utførte eksperimenter. Ikke-lineær regresjonsanalyse for beregning av GI
50 eller IC
50-verdier ble utført ved Systat. Statistisk signifikans ble analysert ved Student
t
-test eller enveis ANOVA i SigmaStat 3.1. Forskjeller ble ansett for å være statistisk signifikant når P 0,05.
Resultater
Henryin selektivt hemmer veksten av kolorektal kreft celler og induserer G1 fase arrestasjonen av cellesyklusen
veksthemmende effekter av henryin på humane kreftceller var primært evaluert med MTS analyser. Som vist i figur 1B, henryin oppviste sterkere veksthemmende effekter på colon cancerceller (SW480, HT-29 og HCT116) enn andre typer av kreft (lungekreft cellelinjen A549) eller normale celler (human normal colonic epithelial cellelinje CCD- -841-Con og normal lunge epitel cellelinje Beas-2B). Som en kontroll, cisplatin hadde tilsvarende hemmende effekter blant alle de forskjellige cellelinjer undersøkt (figur 1C). Analyse av GI
50 verdier av henryin og cisplatin på de forskjellige cellelinjer støttes også den observasjon at henryin hadde en selektiv hemmende effekt på tykktarmskreftceller (figur 1D). De veksthemmende virkninger av henryin på SW480-celler viste en tidsdoseavhengig måte (data ikke vist). Cellesyklusanalyse viste at cellene ble arrestert på G1 fase i HCT116-celler behandlet med henryin på en tidsavhengig måte (figur 1E). Disse resultatene sammen tyder på at henryin utstilt selektive veksthemming på kolorektal kreftceller.
(A) Strukturene henryin og ent-kaurane vises. (B) Vekst hemming av henryin på ulike cellelinjer, inkludert tykktarmskreftcellelinjer (SW480, HCT116 og HT29), normal colonic epitelial cellelinje CCD-con-841, lungekreft cellelinje A549, og normal epitelial celle lunge linje Beas- 2B, bestemt ved MTS-forsøk med cisplatin anvendt som en kontroll (C). Celler ble behandlet med henryin opp til 72 timer ved forskjellige konsentrasjoner. Absorbansen ble målt ved 490 nm. All prøvetaking ble gjort i triplikater, og dataene er presentert som gjennomsnitt ± SD. (D) Median vekstinhibering konsentrasjon (GI
50, 72h) verdier av henryin og cisplatin for forskjellige cellelinjer. (E) Representative histogrammer som viser celle-syklusfordeling som analysert ved hjelp av strømningscytometri i HCT116-celler behandlet med 4 um av henryin for henholdsvis 0h, 12 timer og 24 timer. Tellinger av G1 fase celler økt bemerkelsesverdig i de behandlede cellene i en tidsavhengig måte.
Henryin forstyrrer Wnt signal i CRC celler
For å undersøke de underliggende mekanismene gjennom hvilke henryin hemmer veksten av kolorektal kreft celler, gjennomførte vi en microarray analyse og endringer av genuttrykk ble analysert i henryin behandlet SW480 celler. Genene ble filtrert ved å sette kriteriet for fold endring 2 (up-regulert) eller 0,5 (nedregulert) som differensielt uttrykte gener. Både GÅ merknader og sti analyse viste at henryin sterkt påvirker Wnt signalveien samt andre endrede trasé som er forbundet med kolorektal kreft biologiske prosesser i både KEGG og BioCarta databaser (figur 2A-B).
( A) (B) Microarray-analyse og analyse av data fra differensial genekspresjon i henhold henryin behandling. SW480-celler ble behandlet i 12 timer med 4 um av henryin med 0,5% DMSO anvendt som en kontroll i analysen. GO merknader og sti analyse ble ansatt fra BioCarta og KEGG databaser, henholdsvis. Genene med fold endring av minst 2 (oppregulert) eller 0,5 (nedregulert) ble tatt som differensielt uttrykte gener. Dataanalyse og statistikk ble generert bare når hits 5 i hver signalveien. Representative trasé oppnådd etter microarray analyse av data vises. (C) Henryin hemmer Wnt reporter ekspresjon i en doseavhengig måte i wnt1 transfektert HEK293T celler, og i kolorektal kreftceller, SW480 og HCT116. Tre timer etter transfeksjon av Wnt1 og /eller ST-Luc, DMSO eller henryin med den angitte dosering ble tilsatt til cellene for ytterligere 24 timer og luciferase-aktiviteten ble deretter målt. (D) Henryin (4 um) preferensielt inhiberer Wnt signale (ST-Luc) over NF-kB signalveien (NF-kB-Luc) i HEK293T celler. Wnt signal ble stimulert av transfeksjon av wnt1 og NF-kB signale ble stimulert med 25 ng /ml TNFa. Hver søyle er gjennomsnitt ± SD fra tre uavhengige forsøk. * P 0,05, ** P 0,01, i forhold til kjøretøykontroll. NS, ikke signifikant.
Etter microarray analyse, sjekket vi effekten av henryin på Wnt /β-catenin signal bruker TOPflash reporter analysen. I wnt1 transfektert HEK293T celler, henryin hemmet Wnt signal reporter uttrykk på en doseavhengig måte etter 24 timer med behandling (figur 2C). Wnt signale konstitutivt aktivert i SW480 og HCT116 cellene på grunn av APC trunkering og β-catenin mutasjon, henholdsvis. I begge cellelinjer, ble Wnt signal også inhibert av henryin doseavhengig (figur 2C). Samtidig viste henryin ingen klar virkning på aktiviteten av NF-kB signale responsive luciferase reporter (NF-kB-Luc) (figur 2D). Disse dataene antyder at henryin spesifikt hemmer Wnt /β-catenin signalering.
For å karakterisere struktur-aktivitetsforhold henryin undersøkte vi virksomheten til ekstra henryin analoger (figur 3A) og undersøkt deres effekt på Wnt signalering med ST-Luc reporter analysen. To av forbindelsene, phyllostachysin F og oridonin, som utviser et keton gruppe ved C-15 og 14β-OH, i likhet med henryin, oppviste også tydelige hemmende effekter på ST-Luc aktivitet. I mellomtiden henryin analoger enmenol, minheryin og eriocalyxin B, som mangler den keton-gruppen ved C-15 eller 14β-OH, viste ingen effekt på den Wnt reporter-aktivitet (figur 3B-C). Deretter vi videre undersøkt veksthemmende effekten av enmenol, minheryin og eriocalyxin B. Enmenol og minheryin C, i samsvar med sine ikke-hemmende aktiviteter på Wnt signal, viste ingen vekst-hemmende effekt på kolorektal kreft celler (figur 3D). Spesielt eriocalyxin B viste sterk cytotoksisitet mot kolorektal kreftceller, lungekreft celler og selv de normale cellelinjer (figur 3D). Dette brede spekteret cytotoksisitet av eriocalyxin B kan være på grunn av dets inhibitoriske aktivitet på NF-kB vei, som rapportert NF-kB-inhibitor [18]. Disse data tyder på at keton-gruppen ved C-15 og 14β-OH er ansvarlig for henryin sin inhiberende effekt på Wnt signalering.
(A) Strukturer av henryin og dets analoger. (B) Effekter av henryin analoger på Topflash aktivitet i HEK293T celler. Cellene ble transfektert med Wnt1 og ST-Luc for 3 timer og deretter inkubert med henryin og dets analoger av ulike doser for 24 timer og etterpå luciferase aktiviteter ble målt. (C) Median vekstinhibering (GI
50, 72h) og ST-Luc inhibering (IC
50, 24) verdier av henryin og dets analoger i SW480-celler er vist. (D) Effekter av henryin analoger på veksten av forskjellige cellelinjer (48 timer). Dataene som vises, er gjennomsnitt ± SD fra tre uavhengige eksperimenter.
Henryin hemmer endogen Wnt mål genuttrykk
Vi sjekket uttrykk for endogene Wnt målgener i våre microarray data og funnet at uttrykket av wnt målgener, inkludert Axin2, cyclin D1, SP5, DKK1, NOS1, PPARδ og FGF20, var signifikant nedregulert etter behandling med henryin (figur 4A). For å bekrefte de hemmende effekter av henryin på uttrykket av Wnt signale målgener, behandlet vi wnt1 transfektert HEK293T og SW480 celler med henryin for 12h og overvåkes uttrykk for C-myc og cyclin D1 ved RT-PCR. Resultatene viste at henryin redusert ekspresjon i en doseavhengig måte (figur 4B-C). Vi benyttet også western blot analyser for å påvise protein uttrykk for cyclin D1, Survivin, Axin2 og C-myc i HEK293T, SW480 celler og HCT116-celler behandlet med henryin. I overensstemmelse med de ovenfor angitte resultater, proteinnivået av Axin2, Cyclin D1, C-myc og Survivin ble redusert med henryin innen 24 timer fra behandlingen (figur 4D-F).
(A) Henryin nedregulerer ekspresjon av wnt målgener i microarray analyse. (B-C) Henryin inhiberer syklin D1 og C-myc-ekspresjon i transfekterte wnt1 HEK293T celler og SW480-celler. Cellene ble behandlet med den angitte dosering av henryin for 12timer. Nivåene av Cyclin D1 og C-myc mRNA ble bestemt ved sanntids-PCR og normalisert til p-aktin. (D) Effektene av henryin på uttrykk for Axin2, CyclinD1 og Survivin proteiner i wnt1 transfektert HEK293T celler. Cellene ble transfektert med wnt1 3 timer før henryin behandling. (E) Effektene av henryin på uttrykk for Axin2, CyclinD1 og Survivin proteiner i SW480 celler. (F) Effektene av henryin på ekspresjon av CyclinD1, Survivin, C-myc og P21-proteiner i HCT116-celler. Cellene ble behandlet med henryin for 6, 12, 24 timer og celleekstrakter ble analysert med Western-blotting av de angitte proteiner. β-aktin ble benyttet som en kontroll lasting. * P 0,05, ** P. 0,01, i forhold til kjøretøykontroll
Henryin forstyrrer sammenslutning av β-catenin /TCF kompleks
Ett kjennetegn på aktivering av Wnt signal er stabilisering og kjernefysiske akkumulering av β-catenin i kolorektal kreftceller. Vi sjekket virkningen av henryin på nivået og fordeling av β-catenin i SW480 celler. SW480-celler ble behandlet i 24 timer med henryin ved forskjellige konsentrasjoner og total β-catenin og fosforylerte form av β-catenin ble undersøkt (figur 5A). I mellomtiden, den nukleære og cytoplasmiske β-catenin ble også undersøkt ved hjelp av western blot-analyse. Resultatene viste at henryin behandling verken påvirker nivået av total og fosforylert form av β-catenin, eller distribusjon av β-catenin i kjernefysiske og cytoplasma avdelinger (figur 5B), noe som tyder på at henryin rettet mot Wnt veien nedstrøms β-catenin . I samsvar med det ovennevnte resultat, ble aktiviteten av ST-Luc i HEK293T celler med β-catenin overexpressed betydelig redusert ved henryin, i tillegg til den stabiliserte form av β-catenin som følge av S37A mutasjon (figur 5C). LiCl er en inhibitor av GSK-3β som blokkerer fosforylering og etterfølgende nedbrytning av β-catenin, som derved resulterer i stabilisering av β-catenin [19]. Ikke overraskende, henryin antagonized LiCl-indusert aktivering av den kanoniske Wnt signalering samt (figur 5C). Samlet utgjør disse data tyder på at henryin ikke påvirker stabilisering av β-catenin eller sitt atomtrans, men snarere rettet mot Wnt signale nedstrøms av det.
(A) Henryin påvirker ikke mengden av total β -catenin og pho-β-catenin i SW480 celler. (B) Henryin påvirker ikke fordelingen av β-catenin i cytosol og nucleus fraksjoner i SW480 celler. SW480-celler ble behandlet med de angitte doser av henryin i 24 timer. Celleekstrakter eller fraksjoner ble fremstilt og analysert ved western blotting. Lamin A /C og β-actin ble brukt som laste kontroller av kjerner og cytoplasma proteiner, henholdsvis. (C) Henryin antagoniserer Wnt signal stimulert med LiCl eller β-catenin. HEK293T celler ble transient transfektert med ST-Luc og β-catenin eller konstitutivt aktiv β-catenin (S37A) plasmider, henholdsvis, eller behandlet med LiCl (20mm). Rundt 3 timer etter transfeksjon eller behandling, ble henryin tilsatt og cellene ble inkubert i ytterligere 24 timer. Hver søyle er gjennomsnitt ± SD fra tre uavhengige forsøk. (D) Henryin, men ikke enmenol og minheryin C, reduserte TCF4 nivåer forbundet med β-catenin i SW480-celler på en doseavhengig måte. Celler ble behandlet med de angitte doser av henryin og dets analoger enmenol og minheryin C i 12 timer og immun-utfelling ble utført ved β-catenin-antistoff med muse-IgG som en kontroll, og deretter TCF4 ble påvist ved western blotting. (E) Henryin direkte forstyrrer interaksjonen av β-catenin med TCF4 i in vitro bindingsanalysen. Human rekombinant β-catenin (0.8μg) og TCF4 (0,5 ug) ble blandet, inkubert med forskjellige konsentrasjoner av henryin og dets analoger enmenol og minheryin C, og blandingen ble underkastet ko-immunoutfelling med β-catenin antistoff og western-blotting-analyse med TCF4 antistoff med muse-IgG anvendt som kontroll. (F) Kvantifisering av de vestlige blotter vist i D og E. Programvaren ImageJ ble brukt til å analysere intensiteter av band. Dataene ble presentert som gjennomsnitt ± SD fra tre eksperimenter. Hen, henryin, En, enmenol, Min, minheryin C.
I kjernen, må β-catenin å binde transkripsjonsfaktorer av TCF familien å regulere målet genuttrykk. Vi sjekket om henryin svekker β-catenin /TCF interaksjon. SW480-celler ble behandlet med henryin var immune-utfelt ved β-catenin antistoff eller muse-IgG som en kontroll, og TCF4 ble påvist ved western blotting og blottene ble analysert med ImageJ for intensitetene for bånd. Resultatene viste at henryin sterkt inhibert binding av TCF4 p-catenin på en doseavhengig måte i SW480 celler, men ikke dens analoger enmenol og minheryin C (figur 5D, 5E), som er i overensstemmelse med de inhiberende aktiviteter på Wnt signal og kreftcellevekst av forbindelsene.
for å kunne bestemme hvorvidt henryin kan direkte forstyrre interaksjonen av β-catenin med TCF4, in vitro bindingsanalyser ble utført med puri fi ed rekombinant β-catenin og TCF4 proteiner. Resultatet viste at henryin sterkt inhibert binding av TCF4 p-catenin i in vitro bindingsanalyser, mens dens analoger enmenol og minheryin C oppviste ikke noen virkning som forventet (figur 5E, 5F).
diskusjon
Målretting Wnt signal kan representere en lovende strategi for å utrydde ondartet sykdom med unormal aktivering av denne veien. Følgelig identifisere nye inhibitorer av Wnt /β-catenin signalveien er av stor viktighet og betydning. Denne inhibering kan oppnås ved å forstyrre interaksjonen av β-catenin /TCF [20] eller CREB-bindende protein (CBP) [21]. Stabiliserende Axin2 [22,23] og aktivering av CK1α også ble tatt som effektive mekanismer for å hindre Wnt signal for målrettet terapi mot tykktarmskreft [24]. I tidligere undersøkelser, har en rekke forbindelser som er funnet å ha evnen til å avbryte β-catenin /TCF krets direkte, for eksempel PKF115-854 og CGP049090, og lignende.
I de senere år har det vært betydelig interesse i jakten på Wnt /β-catenin signale antagonister av naturlige produkter [25]. Faktisk har mange strukturtyper av naturprodukter blitt identifisert som hemmer Wnt /β-catenin signalering, inkludert Murrayafoline A [26], Tetrandrine alkaloid [27], curcumin [28], EGCG [29,30], fl avonoids [31, 32], Magnolol [33] og andre [34,35]. Nylig, resveratrol ble rapportert å være i stand til å hemme Wnt signale nedstrøms β-catenin, og dermed bidra til undertrykkelse av tykktarmskreft tumorigenesis [36].
Henryin, en ent-kaurane diterpenoid, isolert fra
Isodon
rubescens
var.
lushanensis
fortrinnsvis indusert kolorektal kreft celler død og samtidig la normale colonic CCD-con-841 og normal lunge epitel Beas-2B celler mindre påvirket (figur 1B, D). Vi identifiserte signalveier som påvirkes av henryin i tykktarmskreftceller av microarray analyse, hvorav de Wnt signalveien ble funnet å være sterkt forandret en. I samsvar med den microarray data, i begge wnt1 transfekterte HEK293T celler og kolorektal kreft celler, henryin hemmet Wnt-responsive reporter-aktivitet på en doseavhengig måte (figur 2C). Henryin redusert uttrykk av endogene Wnt målgener (figur 4A-F) og blandet med foreningen av β-catenin /TCF transkripsjon kompleks sannsynlig ved direkte blokkere bindingen o f β-catenin til TCF 4 (figur 5D, 5E, 5F).
