Abstract
Til tross for økt forståelse av tykktarmskreft og innføring av målrettet medikamentell behandling, forblir metastatisk fase av sykdommen ildfaste til behandling. Siden dereguleringen av normal apoptose bidrar til patogenesen av kolorektal kreft, ble nye nukleosidanaloger syntetisert her og evaluert for deres evne til å indusere apoptose og forårsake celledød i to kolorektale adeno-karsinom-cellelinjer, Caco-2 og HT-29. Tre nye nukleosidanaloger vurderes her viste cytotoksisk aktivitet, som målt ved hjelp av MTT-analysen mot begge cellelinjer: IC
50-verdier lå mellom 3 og 37 um, med Caco-2-celler er mer sensitive enn HT-29-celler. Sammenlignet med camptothecin, den positive kontrollen, nukleosidanalogene var betydelig mindre giftig for normale ustimulerte leukocytter (
p
0,05). Videre nukleosidene var i stand til å indusere apoptose som målt ved en økning i kaspase 8 og kaspase 3 aktivitet over det til kontrollen. Dette ble ytterligere understøttet av data som er avledet fra Annexin V-FITC analyser. Til tross for marginale endringer av mitokondriemembranpotensialet, alle tre nukleosider forårsaket en signifikant økning i cytosol-cytokrom c (
p
0,05), med en tilsvarende reduksjon i mitokondrie cytokrom c. Morfologisk analyse av begge cellelinjer viste den hurtige opptreden av vakuoler etter eksponering for to av de nukleosider, mens en tredje forårsaket celle løsgjøring, forsinket cytoplasmisk vakuolisering og atom abnormiteter. Foreløpige undersøkelser, ved hjelp av autophagic indikator monodansylcadaverine og klorokin som positiv kontroll, viste at to av nukleosider indusert dannelse av autophagic vakuoler. Oppsummert er de nye nukleosidanaloger viste selektiv cytotoksisitet mot både kreft cellelinjer og er effektive initiativtakerne til en uvanlig apoptotisk respons, demonstrere sitt potensial til å tjene som strukturelle stillas for mer potente analoger
Citation. Harmse L, Dahan -Farkas N, Panayides JL, van Otterlo W, Penny C (2015) Aberrant apoptotiske Response av tykktarmskreftceller til å Novel nukleosidanaloger. PLoS ONE 10 (9): e0138607. doi: 10,1371 /journal.pone.0138607
Redaktør: Ferenc Gallyas Jr., Universitetet i Pecs Medical School, UNGARN
mottatt: 28 februar 2015; Godkjent: 01.09.2015; Publisert: 21.09.2015
Copyright: © 2015 Harmse et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All data finnes i manuskriptet og saksdokumenter
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Forsknings nisjer Program av National Research Foundation (NRF) i Sør-Afrika og University of the Witwatersrand det helsevitenskapelige fakultet Forskningsutvalget . JLP ble støttet av NRF Knappe Skill Program for studier mot en doktorgrad Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling, analyse, beslutning om å publisere eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
det har vært betydelig fremgang i forståelsen av de molekylære mekanismene bak kolorektal kreft. Imidlertid, til tross for bruk av målrettet medikamentterapi, forblir kolorektal kreft assosiert med en dårlig prognose. Mens legemidler som bevacizumab har bedret overlevelse perioden for metastatisk sykdom utover 20 måneder, har de ikke vært i stand til å påvirke en kur. Nylig har kliniske studier vist svikt i tyrosin kinase hemmere som sunitinib, noe som forårsaket en økning i alvorlighetsgrad og forekomst av alvorlige bivirkninger med minimal terapeutisk nytte [1]. Derfor forblir søket etter effektive midler for å behandle avansert kolorektal kreft en prioritet.
Tallrike studier har vist at den normale apoptotiske prosessen er dysfunksjonell i tykk- og endetarmskreft [2-5]. Dysregulering av apoptose bidrar til utvikling av resistens mot kjemoterapi og en dårlig prognose [6]. Apoptose, som først beskrevet av Kerr i 1972 [7], er karakterisert ved en rekke morfologiske endringer, inkludert plasmamembran blebbing, kromatin kondensasjon, nukleær fragmentering og dannelse av apoptotiske legemer. Kjennetegnene ved apoptose omfatter eksponering av fosfatidylserin på den ytre paknings av plasmamembranen [8, 9], endringer i mitokondriemembranen permeabilitet [10] og frigjøring av cytokrom c fra mitokondrie inter-membran plass, med påfølgende aktivering av effektoren caspaser [11].
Apoptose er viktig for regulering av normal celle omsetning av tarmepitelet. Men i kolorektal kreft, er både den ytre og den iboende apoptotiske reaksjonsveier kompromittert som favoriserer proliferasjonen av neoplastiske celler. I tykktarmskreft, til tross for FAS-reseptor-ekspresjon, cellene er resistente mot FAS-ligand-mediert apoptose som indikerer en defekt i FAS-mediert signalisering [12]. TNF relatert apoptose inducing ligand (TRAIL) reseptor mediert apoptose normalt oppregulert i kreftceller; imidlertid, i kolorektal cancer, motstand mot TRAIL-reseptor-mediert apoptose er blitt observert [13]. P53 tumor suppressor genet produktet mutert eller fraværende i 85% av kolorektal kreft. Denne transkripsjonsfaktor er essensielt for aktivering av den indre apoptotiske reaksjonsvei, så vel som ekspresjon av cyklinavhengig kinase inhibitor p21
waf1 /Cip1. Celler som er defekte i p53 har redusert nivå av apoptotiske proteiner, for derved å begun proliferasjonen av neoplastiske celler [14].
Kjemoterapeutiske midler som er i stand til å indusere apoptose er fordelaktig, fordi de bringer om død av kreftceller uten utløser betennelsesreaksjon og tumorlysesyndrom assosiert med nekrose. Nukleosidanaloger brukes mye til å behandle kreft og administrere virale infeksjoner som herpes og HIV. Legemidler som tilhører denne klassen er kjent for å indusere apoptose i kreft der de er effektive [15].
I denne studien ble det nye nukleosidanaloger skjermet mot to tykktarmskreft cellelinjer, for å undersøke både deres cytotoksiske effekter og deres potensial for å indusere apoptose. Vi har vist at til tross for viser relativt høye IC
50-verdier som bestemt ved MTT cytotoksisitets-analysen, noe nukleosidanaloger var sammenlignbare med camptothecin med hensyn til deres evne til å indusere apoptose. Videre er forbindelsene induserte en uvanlig mitokondrie svar som kan gi ytterligere ledetråder til de underliggende apoptotiske abnormiteter i tykk- og endetarmskreft.
Materialer og metoder
Cell kultur
HT-29 (HTB -38 ™) og Caco-2 (HTB-37 ™) humane kolorektale cancercellelinjer oppnådd fra ATCC, ble dyrket i lav glukose Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) som inneholdt 5% varme-inaktivert føtalt kalveserum. Kulturmedium og føtalt kalveserum ble oppnådd fra Highveld Biologicals, Sør-Afrika. Celler ble dyrket i 75 cm
2 kultur- kolber og inkubert ved 37 ° C i en fuktet atmosfære med 5% CO
2. Begge cellelinjer ble dyrket da de nådde Confluence. I korthet ble cellene vasket to ganger med 10 ml fosfatbufret saltoppløsning, etterfulgt av tilsetning av 4 ml trypsin og inkubering ved 37 ° C i 10 minutter. Frigjorte celler ble sådd på nytt i den samme kolbe. Camptothecin (Sigma), en kjent induser av apoptose, og en inhibitor av topoisomerase-1, ble anvendt som en positiv kontroll i alle eksperimentelle prosedyrer.
Bestemmelse av cellelevedyktighet
Vurdering av test nukleosid cytotoksisitet ble utført av 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT), analyse (Sigma). Den trypanblått (Sigma) utelukkelse analyse ble brukt for å vurdere levedyktigheten til kreftcellene før utplating celler for nukleosid-celle-levedyktighet analyser. Celler ble sådd ut i 96 brønners plater ved en celletetthet på 9 000 celler /brønn, tillates å følge den vekstoverflate i 4 timer og deretter eksponert for test nukleosidene i 48 timer ved konsentrasjoner som varierer mellom 1 og 120 pM. MTT-analysen ble i det vesentlige utført som beskrevet av Mossman [16] med unntak av å oppløse formazankrystaller i DMSO. I korthet, etter inkubasjon med MTT, 100 ul medium ble erstattet med DMSO for å lette oppløseliggjøring av de formazankrystaller. Absorbansen av solubilisert formazankrystaller ble målt ved 540 og 690 nm med en Labsystems IEMS plateleser. Data ble erholdt fra eksperimentene som ble gjentatt minst tre ganger, med hvert datapunkt som blir bestemt i fire eksemplarer. responskurver sigmoidal dose ble konstruert med GraphPad Prism, versjon 5.
Isolering av humane perifere leukocytter
Tillatelse til å isolere humane leukocytter fra friske frivillige ble hentet fra Human Etisk komité i Avdeling for helse Sciences, University of the Witwatersrand (clearance nummer, M070519). Skriftlig, ble informert samtykke fra hver donor innhentet for eksperimentell bruk av hans /hennes leukocytter i forskning. Perifere leukocytter fra en enkelt donor ble isolert fra blod oppsamlet i et heparinisert rør. Røde blodceller ble selektivt lysert ved hjelp av Versagene Blood DNA Kit (Gentra Systems). Nylaget leukocytter ble benyttet for å bestemme nukleosid toksisitet for normale celler. Leukocyttene ble overført til RPMI (Highveld Biologicals) dyrkningsmedium supplementert med 2 mM glutamin (Sigma) og 10% føtalt kalveserum (Separations). Etter høsting av leukocytter, ble deres levedyktighet bestemt av trypanblått eksklusjon analysen før de ble utsatt for test nukleosidene i 24 timer.
Vurdering av apoptose
Induksjon av caspase 3 og caspase 8 aktivitet.
caspase 3 og caspase 8 konkrete kolorimetriske analyser, nemlig CPP32 og FLICE, ble brukt til å måle caspase aktivitet i henhold til produsentens protokoll (Biovision Forskning Products). Nivået av kaspase-aktivitet i cellelysatene var direkte proporsjonal med absorbansen
p
-nitroaniline (pNA) målt ved 405 nm i et Labsystems IEMS Multiscan plateleser. Celler ble utsådd i 6-brønners plater i en tetthet på 50 000 celler per brønn og tillatt å vokse i 18 timer før behandling med nukleosider. Proteininnholdet ble standardisert i alle testprøvene. Kaspase 3 og kaspase 8-aktiviteten ble målt etter forskjellige eksponeringsperioder i cellene til test nukleosidene, typisk ved 2, 4, 8, 12 og 24 timer etter tilsetningen av nukleosidene til de dyrkede celler.
måling av mitokondriemembranpotensialet.
den kationiske fargestoff 5,5 «, 6,6′-tetraklor-1,1′, 3,3»-tetraethylbenzimidazolcarbocyanine jodid (JC-1) er selektiv for mitokondrier og dens iboende fluorescens gjør det nyttig å måle den elektrokjemiske gradienten som eksisterer på tvers av mitokondriemembranen. Protokollen ble fulgt i henhold til produsentens spesifikasjoner (BD Pharmingen). JC-1 fargestoff akkumuleres i mitokondriene av friske celler som fluorescerende røde aggregater. Celler ble utsådd i 6-brønners plater i en tetthet på 50 000 celler per brønn og tillatt å vokse til nær konfluens før behandling med nukleosider. Flowcytometri, med eksitasjon /emisjonsfiltre av 485/540 nm (grønn fluorescens) og 540/590 nm (rød fluorescens), ble brukt for å måle effekten av test nukleosidene på mitokondriemembranpotensialet. Mitokondriene inneholdende røde JC-1-aggregater i friske celler ble detektert i FL-2-kanals (øvre port i scattergraphs), mens grønne JC-1-monomerer i apoptotiske celler ble detektert i FL-1 kanal (nedre port i scattergraphs ).
Måling av mitokondriell og cytoplasmatisk cytokrom c.
humant cytokrom c Titerzyme enzym-immunometrisk assay (Assay Designs Inc) ble brukt til å måle konsentrasjonen av cytokrom c i mitokondrie og cytoplasmatiske fraksjoner av celler eksponert til test nukleosider. Celler ble utsådd i 6-brønners plater i en tetthet på 50 000 celler per brønn og tillatt å vokse i 18 timer før behandling med nukleosider. De behandlede celler ble høstet og skylt med iskald fosfatbufret saltløsning. Cytosoliske fraksjon ble oppnådd ved resuspendering cellepelleten med en celle permeabiliseringsbuffer, (250 mM sukrose, 137 mM NaCl, 70 mM KCl, 4,3 mM Na
2HPO
4, 1,4 mM K
2HPO
4, 0,2 mg /ml Digitonin og 0,1% Hydorol M) som følger med i Mitokondrie isolasjon kit, (analyse Designs Inc.) som forlot mitokondriene intakt. Dette ble etterfulgt av sentrifugering for å separere den cytosoliske fraksjonen og for å pelletere mitokondriene. Mitokondriene ble deretter lysert med RIPA-buffer, bestående av 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 1% natriumdeoksykolat, og 0,1% SDS.
Bestemmelse av apoptose målt ved annexin V-analysen.
Fosfatidylserin (PS) translokasjon til den ytre cellemembran ble bestemt ved fluoresceinisotiocyanat (FITC) -merket Annexin V Strømningscytometrisk analyse med FITC-merket annexin V og propidiumjodid ble utført i henhold til produsentens protokoll (BD Pharmingen), på celler eksponert for 100 uM av hver av test nukleosider eller camptothecin i 24 timer. Celler ble utsådd i 6-brønners plater i en tetthet på 50 000 celler per brønn og tillatt å vokse til nær konfluens før behandling med nukleosider. Celle farging ble vurdert ved hjelp av Annexin V-FITC (grønn fluorescens) samt et fargestoff utelukkelse av propidiumjodid (PI) (negativ for rød fluorescens), opptak på minst 10
4 arrangementer. Etter eksponering til test nukleosidene, ble cellene høstet og analysert ved flowcytometri på en BD LSR II strømningscytometer. Dataene ble plottet som en scattergraph med FITC-Annexin V (grønn fluorescens) er representert på x-aksen
versus
PI (rød fluorescens) på Y-aksen.
caspase 9 aktivitet.
caspase 9 aktivitet ble bestemt med Abcam® caspase 9 aktiv FITC farging kit. Caspase 9 selektiv inhibitor LEHD-FMK konjugert til FITC penetrerer levende celler til å binde seg til aktiv caspase 9 på en irreversibel måte. Celler ble sådd ut på sterile dekkglass (50 000 pr dekkglass) tillates å følge i fire timer og eksponert til test nukleosider og camptothecin, henholdsvis i 24 timer. Deretter ble cellene vasket med PBS og så inkubert med substratet ved 37 ° C i en time. Lysbilder ble vasket i PBS og sett på et Olympus BX41 epifluorescence mikroskop. Bilder ble tatt med et Olympus DP72 kamera og analysert med Olympus CellSens programvare pakken. Celler med aktivert caspase 9 skjerm en lys grønn fluorescens.
Vurdering av HT-29 og Caco-2 cellemorfologi
Effekt av nukleosidene på cellemorfologi ble undersøkt ved fasekontrast og fluorescensmikroskopi . For fasekontrastmikroskopi, ble cellene dyrket i 6 brønners kulturplater (50 000 celler per brønn), tillates å overholde over natten og deretter eksponert for nukleosider for ulike tidsperioder. Alle forsøk ble gjentatt minst tre ganger. Celler ble observert med en Olympus CKX41 invertert mikroskop og bilder ble tatt med en Olympus DP21 kamera. Cell morfologi ble videre evaluert med Hoechst 33342 (Life Technologies) og acridinoransje (Life Technologies) fluorescerende fargestoffer. Celler ble dyrket på sterilisert varmedekkglass og eksponert til test nukleosidene ved varierende konsentrasjoner. Bruke de riktige filtre, ble cellene observert med en Olympus BX41 epifluorescence mikroskop. Bilder ble tatt med et Olympus DP72 kamera og analysert med Olympus CellSens programvare pakken.
Vurdering av Bcl-2 og Bax uttrykk
Uttrykket og cellulære plasseringen av både Bcl-2 og Bax i HT-29 og Caco-cellelinjer ble bestemt ved immunofluorescens-mikroskopi. Celler ble dyrket på dekkglass (50 000 celler pr dekkglass), tillates å overholde over natten og eksponert til test nukleosider og camptothecin i 6 timer. Etter skylling med PBS, ble cellene fiksert med 3% formaldehyd i PBS i 20 minutter. Cellene ble skylt permeabiliserte og i 5 minutter med 0,25% Triton X100, fremstilt i PBS med 0,5% bovint serumalbumin (BSA). Etter permeabiliseringen ble cellene blokkert med 1% (BSA) i PBS i en time. Deretter ble cellene vasket og inkubert over natten med de respektive primære antistoffer (Bcl-2 eller Bax i PBS med 0,5% BSA) ved 4 ° C. Mus anti-Bcl-2 og mus anti-Bax ble oppnådd fra Biovision og anvendt i en konsentrasjon på 10 mg /ml. Etter vask med PBS ble cellene inkubert med arter kompatibel Alexa-Fluor 568 (Abcam) sekundært antistoff. FITC-konjugert phalloidin, (Abcam), ble anvendt for å visualisere cytoskjelettet og kjerner ble gjort synlige med Hoechst 33342 beis som beskrevet tidligere. Cellene ble sett ved hjelp av et Olympus BX41 epifluorescence mikroskop med passende filtre for hver fluorochrome. Bilder ble tatt med et Olympus DP72 kamera og analysert med Olympus CellSens programvare pakken.
Evaluering av celler for induksjon av autofagi
Celler ble dyrket på sterile dekkglass i 6 brønners plater 9 (50 000 celler per dekkglass) lov til å følge over natten og behandlet med 50 mikrometer test nukleosider. Klorokin (50 uM) ble anvendt som en positiv kontroll, siden det er kjent for å forårsake omfattende autophagic vakuolen formasjon [17, 18]. Celler ble eksponert for testforbindelser, klorokin og camptothecin i 3 timer, vasket med PBS og deretter inkubert ved 37 ° C med 50 pM monodansyl-cadaverine (MDC) (Sigma) i PBS i 15 minutter [19, 20, 21]. Camptothecin ble inkludert som en negativ kontroll for vacuole formasjon som den ikke klarte å føre vacuole dannelse i de to cellelinjer. Dekk ble skylt med PBS og levende celler ble vist under Olympus BX41 epifluorescence mikroskop. Bilder ble tatt med et Olympus DP72 kamera og analysert med Olympus CellSens programvare pakken.
Nukleosidnaive testforbindelser
Romanen nukleosid derivater, nukleosid 1, 2 og 5 vurderes i denne studien ble syntetisert i School of Chemistry, University of the Witwatersrand, og preget av en
H og
13C NMR, IR og HRMS spektroskopi. De ble syntetisert fra en rekke forskjellige utgangsmaterialer kjøpt fra Sigma-Aldrich ifølge modifiserte fremgangsmåtene beskrevet i Sproat, 1994 [22]. Nukleosidet 2 er en kjent forbindelse og spektrene fra de to andre forbindelser er tilgjengelige fra forfatterne. Stamløsninger (20 mm) på test nukleosidene ble utarbeidet i vevskultur klasse DMSO.
analyse og datastatistikker
Alle dataene ble analysert og dose-responskurver bygget ved hjelp av Graph-Pad Prism versjon 5. Forskjeller mellom kontroller og nukleosid behandlet prøvene ble testet for signifikans med Prizm3 INSTAT programvarepakke, ved hjelp av variansanalyse (ANOVA) og studentens t-test med en betydning terskel satt til
p
0,05.
Resultater
nukleosidanaloger er cytotoksiske til HT-29 og Caco-2 celler
Tre nye pyrimidin ribonukleosid analoger ble identifisert i en screeningprosedyre av tjue tre nye nukleosider som har cytotoksisk aktivitet mot både HT-29 og Caco-2-cellelinjer når de ble testet ved en konsentrasjon på 100 uM. Strukturene til de tre aktive nukleosider er vist i figur 1A. Nukleosid 1 og 2 var uridine analoger og nukleosid 5 var en cytidine analog. De pyrimidinbaser ble koblet via en
N
-glycosidic bindingen til karbon en av ribose sukker. Alle tre molekyler ble substituert med voluminøse fenylgrupper på karbon 5 av ribose-sukker. Nukleosid 1 hadde et C-O-binding med en 4,4-dimetoksytrityl-gruppen og nukleosider 2 og 5 ble koblet til en tert-butyldifenyl gruppe via en stabil Si-O-binding. Nukleosidene ble vilkårlig nummerert 1-23 og test nukleosider nummer en, to og fem ble funnet å være aktiv i den innledende screening-analyser.
femti prosent hemmende konsentrasjon (IC
50 ) verdier ble oppnådd for de tre aktive nukleosider og er vist i figur 1B. De to cellelinjer som vises forskjellig sensitivitet til de tre aktive testforbindelsene og til camptothecin. HT-29 celler var mer følsomme for camptothecin enn Caco-2-celler, med en IC
50 verdi på 5,7 pM i forhold til 10,6 uM, respektivt. Nukleosid-5 var det mest effektive mot HT-29-celler med en IC
50 verdi på 3,4 uM og viste lignende aktivitet til Caco-2-celler med et IC
50 verdi på 4,8 uM. I HT-29-celler, nukleosid 1 og 2 hadde IC
50 verdiene 6,4 og 3,4 ganger høyere enn for camptothecin, viser IC
50 verdier på 36,3 og 19,1 uM, respektivt. Dette er i kontrast med de Caco-2-celler, hvor en nukleosid hadde lignende aktivitet til camptothecin og nukleosidet 2 var 3 ganger mer aktiv enn camptothecin, med en IC
50 verdi på 3,5 uM. responskurver representative dose er vist i fig S1
Eksponering av nylig isolerte leukocytter til hver av de tre nukleosidanaloger og til camptothecin, henholdsvis indikerte at nucleoside 2 hadde størst hemmende effekt på leukocytter, forårsaker en 38,5% reduksjon av leucocyte levedyktighet ved en konsentrasjon på 100 uM. Dette ble to ganger lavere enn virkningen av camptothecin på leukocytter. Nukleosid en og nukleosid 5 var de minst giftige for leukocytter, med celleviabilitet blir opprettholdt på 82,7% og 99,9%, henholdsvis (se figur 1C).
Nukleosider indusere caspase 8 og caspase 3-aktivitet
caspase 8 er en initiator caspase som bevirker spaltning og aktivering av kaspaser effektor, for eksempel caspase 3. figur 2 viser kaspase 8 og kaspase 3 aktivitet bestemmes ved forskjellige tidsintervaller, etter tilsetning av test nukleosider, til begge cellelinjer. De tre nukleosider medført en økning i kaspase 8 og kaspase 3 aktivitet i begge cellelinjer i forhold til den negative kontroll. Imidlertid, med unntak av nukleosidet 2, caspase-aktivitet var ikke så høy som det som blir indusert av camptothecin. Nukleosid-2 var den mest effektive induseren av kaspase-aktivitet i begge cellelinjer, indusere caspase 8 og 3 aktivitet til et lignende nivå som camptothecin. Imidlertid, både i HT-29 og Caco-2-cellelinjer, induksjon av caspase maksimal 8 og 3 aktivitet tok lengre tid for å oppnå (12 timer i motsetning til 2-4 timer). Viktigere, aktiviteten til både caspases falt i et saktere tempo enn de camptothecin behandlede celler, gjenværende høyere enn camptothecin etter 24 timers eksponering.
Nukleosider ha en minimal effekt på mitokondriemembranen potensial (Δψm )
Δψm ble målt ved flowcytometri med kationiske fluorescerende fargestoff JC-1. Prosentandelene av Δψm i nukleosid behandlede HT-29 og Caco-2-celler sammenlignet med de negative og positive kontrollceller er oppsummert i tabell 1. I forhold til den negative kontroll, i HT-29-celler, nukleosid 2 og 5 hadde en marginal ( 3%) effekt på Δψm. Nukleosid en behandling resulterte i 4% av celler med et nedsatt Δψm over den for kontrollen. I motsetning til dette, camptothecin-behandlede celler hadde 34,8% av celler med et nedsatt Δψm sammenlignet med kontrollen. I de Caco-2-celler, nukleosider 1 og 5 påvirkes noe 17% av celler som resulterer i en redusert Δψm, mens nukleosid 2 hadde en marginal effekt ( 3%) over den for kontrollen. Dette er i kontrast med kamptotecin som forårsaket 34,6% celler med en Δψm i Caco-2 celler. Scattergraphs er vist i supplerende S2 Fig.
Nukleosider endre intracellulær cytokrom c distribusjon
I celler, mellom 90 og 100% av total cellular cytokrom c er vanligvis plassert i mitokondriene. Figur 3A og 3B viser at test nukleosider øket cytosoliske cytokrom c fraksjon for begge cellelinjer i forhold til den negative kontroll, men ikke i samme grad som camptothecin. I HT-29-celler, nukleosid-2 forårsaket den høyeste prosentandel av cytokrom c lengde cytosol (75,35 ± 1,15%), om enn noe lavere enn den for camptothecin (85,19 ± 1,54%). Nukleosider 1 og 5 forårsaket noen 68,22 ± 0,62% og 70,42 ± 0,62% av cytokrom c lengde cytosol, respektivt.
Cellene ble eksponert for 100 uM av nukleosid-1, 2, 5 og camptothecin, respektivt , i 24 timer. Stolpene representerer gjennomsnitt ± SEM fra tre ELISA-analyser utført for hvert nukleosid.
I de Caco-2 celler, nukleosid 5 forårsaket den høyeste andelen av cytokrom c for å skifte til cytosol (70,42 ± 1,76%), som er lavere enn den til camptothecin (86,94 ± 1,72%). Virkningene av nukleosider 1 og 2 var sammenlignbare med nukleosid 5 med cytosoliske cytokrom c fraksjoner av 63,87 ± 2,03% og 68,23 ± 0,62%, henholdsvis. Resultatene indikerer således at behandling med nukleosidanalogene forårsaket en reduksjon i mitokondrie cytokrom c og samtidig økning i cytosol-cytokrom c.
Annexin V-bindende økninger i HT-29 og Caco-2-celler
den flowcytometrisk analyse for annexin V-FITC, indikerer at apoptose indusert etter tilsetning av de aktive nukleosid-analoger til begge cellelinjer, som vist i tabell 2 og S3 fig. Etter 24 timer med eksponering for nukleosidanaloger eller camptothecin, var det først og fremst to populasjoner av celler: levedyktig, ikke-apoptosing celler (annexin V-FITC og PI negative) og celler som gjennomgår apoptose (annexin V-FITC positive og PI negative). En liten populasjon av celler ble observert å være annexin V-FITC og PI positiv, noe som indikerer at de var i sluttstadiet apoptose eller nekrose.
prosentandel av hver undergruppe av celler i begge cellelinjene eksponert til nukleosid-analoger er vist i tabell 2. i de HT-29-celler, en nukleosid var den mest effektive apoptotiske inducer, med 38,4% av cellene som blir detektert i begynnelsen av apoptose og 5,9% av cellene i slutten av apoptose /nekrose. Mens overlegen camptothecin for tidlig apoptose, camptothecin behandling forårsaket likevel noen 19,6% av cellene til å skifte til sent apoptose /nekrose. Dette indikerer at camptothecin var i stand til å indusere apoptose i et raskere tempo enn nukleosidene. Nukleosid-2-behandlingen resulterte i 20,5% av cellene er i begynnelsen av apoptose og 10,6% på slutten av apoptose. Nukleosid 5 hadde 22,2% celler i tidlig apoptose og 2,3% celler i slutten av apoptose /nekrose.
Effektene var forskjellig i de Caco-2 celler, alle tre nukleosider viste en tilsvarende andel av levedyktige celler, som strekker seg fra 61 til 66,3%. Nukleosid-5 var det mest effektive med 30,9% av celler som detekteres i tidlig apoptose og 4,8% i slutten av apoptose eller nekrose, mens etter at nucleoside en behandling, 17,4% av cellene var i begynnelsen av apoptose og 14,8% på slutten av apoptose. Noen 21,7% celler ble detektert i begynnelsen av apoptose og 11,4% av cellene i slutten av apoptose /nekrose følgende nukleosid to behandling. Scattergraphs er vist i S3 fig.
nukleosidene ikke klarer å indusere kaspase 9 aktivitet
Evnen som test nukleosidene for å stimulere kaspase 9 aktivitet ble bestemt etter at cellene ble utsatt for 50 uM av hvert nukleosid for 24 timer. Kamptotecin (20 uM) ble anvendt som en positiv kontroll, og var i stand til å stimulere kaspase 9 aktivitet, i motsetning til de tre nukleosidene som er vist i S4 fig.
Do
Nucleosides ikke påvirker ekspresjonen av Bcl-2 og Bax
for å få mer informasjon om omfordeling av cytokrom c til cytoplasma uten en fremtredende endring i mitokondriemembranen potensial, undersøkte vi uttrykket av Bcl-2 og Bax i HT-29 og Caco-2 celle linjer og deres respons på nukleosid behandling. Celler ble eksponert for 50 uM nukleosider i 6 timer.
Bcl-2 er sterkt uttrykt, og forbundet med kjernen i både HT-29 og Caco-2-celler.
i ubehandlet og behandlet HT -29 celler, Bcl-2 ble uttrykt med en sterkt fluorescerende signal og forbundet med kjernen (S5 fig). Dette ble bekreftet av sammenslåing Hoechst og BCL-2 bilder som presenteres et rosa sammenslåtte bildet indikerer samlokalisering av de to fluorokromer. Eksponering for test nukleosidene hadde ingen åpenbar effekt på BCL-2 uttrykk nivåer eller sin subcellulære fordeling. Caco-2-celler på samme måte, hadde en overveiende atom fordeling av Bcl-2. Men noen celler slippes en mye svakere signal enn andre (S6 Fig). Eksponering for nukleosid 1 og 2 forårsaket minimal omfordeling av BCL-2 til perinukleær plass som ikke ble observert med nukleosid 5 behandling.
Bax er dårlig uttrykt i HT-29 og Caco-2 celler med en perinukleær distribusjon.
I HT-29 kontrollceller, Bax ble sparsomt knyttet til kjerner med en overveiende perinukleær fordeling (S7 fig). Hoechst /Bax fusjonerte bilder støtter den observasjon at Bax har et perinukleært fordeling. Noteably, den fluorescerende intensitet av Bax var mye lavere enn den til Bcl-2 indikerer relativt lavere ekspresjonsnivåer. Eksponering for de tre nukleosider viste en liten økning i Bax fluorescens sammenlignet med den i kontrollen. I tillegg behandling med nukleosid 5, forårsaket en polarisert atom gruppering av Bax (S7 fig). Den Hoechst /Bax fusjonert bildet viser en økning i rosa fluorescens indikerer en økt sammenslutning av Bax med kjernen.
Expression og cellulær distribusjon av Bax var lik i Caco-2 celler (S8 Fig). Bax uttrykk var lav i Caco-2 celler og bilder måtte bli forbedret for å vise subcellulære fordeling. Det var derfor ikke mulig å fastslå om de nukleosider hadde en direkte effekt på Bax uttrykk nivåer eller dets subcellulære fordeling i Caco-2 celler.
Effekter av nukleosidene på cellemorfologi
Hoechst flekker identifiserer apoptotiske kjerner.
i HT-29-celler, både nukleosid 1 og 2 var i stand til å indusere apoptose som reflekteres av den spesifikke kjernefargemønster (indikert med en faststoff /blokk pilen i figur 4). Kjerner av ubehandlede kontrollceller var stort sett oval i form, farving blått med en jevn fordeling av fargestoffet. I motsetning til dette nukleosidet 5 behandlede celler som forble festet til veksten overflaten etter 20 timer, viste uregelmessig formede kjerner (fig 4), noe som indikerer at cellekjernen kan være et mulig mål. I tillegg er disse cellene viste en høy grad cytoplasmatisk blæredannelse (figur 4), noe som indikerer en omfattende cytoplasmatiske effekt.
Celler ble eksponert for 50 uM av nukleosid 1, 2 og 5 i 24 timer og farget med Hoechst 33342 flekk . Scalebar: 20 mikrometer
Ubehandlet Caco-2 celler viste den typiske ovale kjernestruktur med enda fargestoff fordeling når farget med Hoechst (figur 5)..
