Abstract
Rollen microRNAs i småcellet lungekreft (SCLC) er i stor grad ukjent. MIR-34a er kjent som en p53 regulert tumor suppressor mikroRNA i mange krefttyper. Imidlertid har sin terapeutiske innblanding aldri blitt studert i SCLC, en krefttype med hyppig dysfunksjon av p53. Vi undersøkte uttrykk for et panel av 7 microRNAs (MIR-21, MIR-29b, MIR-34a /b /c, MIR-155, og la 7a) i 31 SCLC svulster, 14 SCLC cellelinjer, og 26 NSCLC celle linjer. Vi observerte betydelig lavere MIR-21, MIR-29b, og MIR-34a uttrykk i SCLC cellelinjer enn i NSCLC cellelinjer. Uttrykket av de 7 microRNAs var relatert til SCLC pasientenes kliniske egenskaper og var verken prognostisk på sikt av total overlevelse eller progresjonsfri overlevelse eller prediktiv av behandlingsrespons. Overekspresjon eller nedregulering av MIR-34a påvirket ikke SCLC celle levedyktighet. Uttrykket av disse 7 microRNAs heller ikke forutsi
in vitro
følsomhet for cisplatin eller etoposid i SCLC cellelinjer. Overekspresjon eller nedregulering av MIR-34a ikke påvirke følsomheten for cisplatin eller etoposid i SCLC cellelinjer. I motsetning til nedregulering av Mir-34a målgener cMET og Axl ved overekspresjon av MIR-34a hos NSCLC cellelinjer, den iboende uttrykk for cMET og Axl var lav i SCLC cellelinjer og ble ikke påvirket av overekspresjon av MIR-34a. . Våre resultater tyder på at uttrykket av de 7 utvalgte microRNAs er ikke prognostisk i SCLC pasienter, og MIR-34a er relatert til ondartet oppførselen til SCLC celler og er usannsynlig å være et terapeutisk mål
Citation: Lee JH , Voortman J, Dingemans A-MC, Voeller DM, Pham T, Wang Y, et al. (2011) mikroRNA Expression og klinisk utfall av småcellet lungekreft. PLoS ONE seks (6): e21300. doi: 10,1371 /journal.pone.0021300
Editor: William C. S. Cho, Queen Elizabeth Hospital, Hong Kong
mottatt: 08.02.2011; Godkjent: 25 mai 2011; Publisert: 22 juni 2011
Dette er en åpen-tilgang artikkelen, fri for all opphavsrett, og kan bli fritt reproduseres, distribueres, overføres, endres, bygd på, eller brukes av alle for ethvert lovlig formål. Arbeidet er gjort tilgjengelig under Creative Commons CC0 public domain engasjement
Finansiering:. Studien ble finansiert av National Institutes of Health, National Cancer Institute utført program. Ingen ekstra ekstern finansiering ble mottatt for denne studien. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Småcellet lungekreft (SCLC) står for ca 10-20% av lungekrefttilfeller og er beryktet for sin aggressivitet og dårlig overlevelse [1], [2]. Til tross for moderat framdriften i de siste to tiårene, er overlevelsen av SCLC pasienter fortsatt svært dårlig [2], [3]. Delvis på grunn av mangel på tilstrekkelige molekylære biomarkører for å veilede behandling av SCLC, de kliniske resultatene av molekylære målrettet terapi som imatinib, gefitinib, BCL-2-hemmere, og mTOR-hemmere ved behandling av SCLC pasienter er skuffende [4].
mikroRNA uttrykk korrelerer med biologiske egenskaper for kreft, for eksempel celledifferensiering, aggressivitet, invasjon, angiogenese og metastatisk oppførsel [5], [6], [7]. For eksempel, Mir-34 familiemedlemmer, MIR-34a, MIR-34b, og MIR-34C, er direkte transkripsjons mål av p53 og deres uttrykk induserer cellesyklus arrest i kreftcellelinjer [8]. MIR-29b fungerer som en tumor suppressor mikroRNA gjennom restaurering av en normal DNA metylering mønster [9]. Klinisk har mikroRNA profilering vist seg å hjelpe til ved diagnostisering av kreft, så vel som prediksjon av prognose og behandling respons [6], [10]. Rollene som microRNAs i kreft biologi og prognose prediksjon i ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) har vært mye studert. Økt MIR-34a ble assosiert med færre tilbakefall i en liten retrospektiv studie av resected NSCLC pasienter [11]. Overekspresjon av la-7a, eventuelt gjennom undertrykkelse av RAS onkogen [12], ble vist å være relatert til økt total overlevelse hos NSCLC pasienter [13], og var også blant de beskyttende prognostiske faktorer som hindrer tilbakefall i kirurgisk reseksjon NSCLC [14] . Overekspresjon av «oncomirs» Mir-21 og MIR-155 ble vist å være relatert til redusert total overlevelse hos NSCLC pasienter [13], [15]. Det er bare snaut data om rollen til mikroRNA ekspresjon i SCLC, og funksjonen av flere godt dokumenterte kreft-relaterte microRNAs i andre krefttyper har aldri blitt adressert i SCLC. For eksempel, selv om SCLC er preget av hyppige p53 dysfunksjon [16], rollen MIR-34a, en p53 regulert tumor suppressor mikroRNA [8], [17], har aldri blitt undersøkt i SCLC.
nylig demonstrert ved hjelp av en real-time polymerase chain reaction (PCR) -basert plateform, det uttrykket profiler av et panel av syv kreft-assosiert microRNAs (MIR-21, MIR-29b, MIR-34a /b /c, speil 155, og la 7a) er verken logisk eller prognostisk i NSCLC pasienter som fikk platinum-basert adjuvant kjemoterapi [18]. Men i resected bukspyttkjertelkreft ved bruk av samme panel av microRNAs, viste vi at lav uttrykk for MIR-21 var assosiert med økt overlevelse etter adjuvant behandling i to uavhengige kohorter av pancreatic ductal adenokarsinom pasienter [19], noe som tyder på at uttrykk for microRNAs og deres prognostiske og prediktive implikasjonene er sannsynlig å være tumor spesifikke. I denne studien, vi utforsket rollen microRNAs for prediksjon av både prognose og behandlingsresultat i SCLC med pasientprøver og SCLC cellelinjer. Vi videre studert hvordan uttrykk for MIR-34a påvirker ondartet oppførselen til SCLC celler.
Resultater
mikroRNA uttrykk i SCLC svulster og lungekreftcellelinjer
Tabell 1 oppsummerer hoved~~POS=TRUNC pasientenes egenskaper, og tabell S1 viser mikroRNA uttrykk i forhold til kliniske variabler. Trender ble observert i favør av høyere la-7a uttrykk hos kvinner og hos yngre pasienter (p = henholdsvis 0,07 og 0,13, ved Wilcoxon Rank Sum-test). Det ble ikke observert signifikante sammenhenger mellom uttrykk for microRNAs og kliniske kjennetegn. Vi sammenlignet ekspresjonen av de 7 microRNAs mellom SCLC-cellelinjer og NSCLC-cellelinjer. Lavere uttrykk for MIR-21, MIR-29b, og MIR-34a ble funnet i SCLC cellelinjer enn i NSCLC cellelinjer (p 0,001 for alle tre microRNAs, Figur S1), som er i overensstemmelse med en tidligere rapport [20] . Vi utførte videre
in situ
hybridisering av Mir-34b i en SCLC svulst prøven og observert i cytoplasma uttrykk for Mir-34b og kjernekraft uttrykk for nukleolært RNA U6 som forventet (figur S2).
mikroRNA uttrykk ikke er korrelert med overlevelsen av SCLC pasienter
median total overlevelse og progresjonsfri overlevelse av denne studien kohorten var 49,1 og 35,7 uker, henholdsvis. Som ventet lengre total overlevelse ble observert i SCLC pasienter som hadde begrenset sykdom og pasienter som oppnådde komplett respons etter behandling (Tabell 1 og Tabell S2). Blant de 7 microRNAs undersøkt, var det ingen overlevelse forskjell mellom pasienter med høy og lav mikroRNA uttrykk, definert ved median ekspresjon av hvert mikroRNA i tumorprøver (tabell 2). Dette gjaldt både begrenset og omfattende sykdom pasienter (tabell S3).
p53 protein uttrykk er relatert til MIR-34a /b /c uttrykk i SCLC svulster
Som speil 34a, MIR-34b, og MIR-34c er direkte transkripsjons mål av p53 [8] og bCL-2 er et mål på MIR-34a [21], utforsket vi enten p53 uttrykk påvirker uttrykket av MIR-34a /b /c og enten bCL-2 uttrykk er relatert til Mir-34a. Ved hjelp av prøver fra samme studie kohort, Dingemans
et al
vist at protein uttrykk av p53 er relatert til overlevelse av SCLC pasienter og er ikke relatert til protein uttrykk av BCL-2 samt [22]. Vi observerte at protein uttrykk av p53 i SCLC svulster var relatert til uttrykk av MIR-34a, MIR-34b, og MIR-34c (figur S3A, B og C). I tillegg uttrykk for MIR-34a var relatert til uttrykk av BCL-2 i SCLC tumorer (figur S3D).
MIR-34a uttrykk er ikke relatert til levedyktigheten til SCLC
in vitro
for å undersøke hvilken rolle mikroRNA uttrykk i ondartet oppførsel av SCLC, fokuserte vi på MIR-34a fordi MIR-34a ble rapportert å være en prognostisk overlevelse markør [11] og for å være en av de få kandidater til mikroRNA erstatning terapi i NSCLC [23], [24]. Vi over-uttrykt eller nedregulert MIR-34a i SCLC celler. Ved hjelp av en Cy3-merket MIR forløper eller inhibitor for å evaluere transfeksjonen effekten, har vi funnet at 24 timer etter transfeksjon, transfeksjon effekt av MIR-forløper eller inhibitor i NCI-H82 SCLC-celler var nesten 100% (fig S4). Høy transfeksjon effekt ble også observert i NCI-H146, NCI-N592, GLC4, A549, og NCI-H1299-celler (data ikke vist). Vi observerte høyere modne MIR-34a uttrykk i celler transfektert med MIR-34a forløper og lavere modne MIR-34a uttrykk i celler transfektert med MIR-34a hemmer sammenlignet med celler transfektert med kontroll forløper og hemmer henholdsvis (figur 1A). Mens overekspresjon av MIR-34a induserer G1 arrest i flere kreftcellelinjer [8], ble G1 arrest ikke observert i NCI-H82 SCLC celle transfektert med MIR-34a forløper (figur 1B). Nedregulering av MIR-34a i NCI-H146-celler som uttrykte høyere MIR-34a sammenlignet med median ekspresjonsnivået av de 14 SCLC-cellelinjer (tabell S4), og i NCI-N592-celler som uttrykte lavere MIR -34a, ikke påvirker levedyktigheten av SCLC celler (figur 1C og D). I motsetning til den generelt aksepterte tumor suppressor virkning av MIR-34a, overekspresjon av MIR-34a i NCI-82 celler som ikke klarte å svekke cellevekst (figur 1E), mens dempning av cellevekst ble observert i NCI-H1299 NSCLC-celler (figur S5 ), som vist i en tidligere rapport [23]. I motsetning til Wiggins
et al.
Som viste at repeterende transfeksjon og langsiktig inkubasjon av MIR-34a reduserer NCI-H226 NSCLC kreftcelle levedyktighet [23], vi klarte å observere effekten av repetitive transfeksjon av MIR-34a på å redusere celleviabilitet i NCI-N592 celler (figur 1F).
(A) MIR-34a uttrykk i NCI-N592 celler og NCI-H82 celler transfektert med MIR-34a forløper eller inhibitor. Deltaet-delta Ct verdien ble kalibrert til deltaet Ct verdien av miR34a i celler transfektert med kontroll Mir forløper eller inhibitor, henholdsvis. (B) Cellesyklus distribusjon av NCI-H82 celle transfektert med kontroll MIR forløper, MIR-34a forløper, kontrollere MIR inhibitor, og MIR-34a-hemmer. (C og D) Cellevekst analyse av NCI-H146 (C) og NCI-N592 (D) celler transfektert med MIR-34a-inhibitor eller kontroll MIR inhibitor. (E) Cellevekst analyse av NCI-H82 celler transfektert med MIR-34a forløper eller kontrollere MIR forløper. (F) Celleviabilitet av NCI-N592 celler etter repeterende transfeksjon av kontroll MIR forløper eller MIR-34a forløper. Cellene ble telt og transfektert igjen hver tredje dag. Feilfelt angir standardavvik. p-verdier ble beregnet i henhold til cellenes levedyktighet 5 dager etter transfeksjon med unntak av mikroRNA forløper i NCI-N592 celle, som ble beregnet i henhold til det antall celler tellet 9 dager etter den første transfeksjon.
mikroRNA uttrykket ikke påvirke narkotika følsomheten SCLC celler
Vi testet først sammenhengen mellom mikroRNA uttrykk og følsomhet av de 14 SCLC cellelinjer til cisplatin og etoposid. Ikke overraskende, følsomheten av SCLC-celler til etoposid korrelerer med følsomhet overfor cisplatin (korrelasjonskoeffisient = 0,74, p = 0,004). Vi observerte at uttrykket av de 7 microRNAs ikke var assosiert med kjemosensitivitet av SCLC celler til enten middel (tabell 3).
Vi neste vurdert om overekspresjon eller nedregulering av MIR-34a i SCLC celler vil påvirke kjemoterapi følsomhet, som MIR-34a ekspresjon ble rapportert å være relatert til kjemoterapi motstand i en prostatakreft-cellelinje [25]. NCI-H82 celler, som bærer en stille TP53-mutasjon (tabell S4) ble transfektert med kontroll MIR forløper, MIR-34a forløper, kontrollere MIR inhibitor og MIR-34a-hemmer, og deretter behandlet med cisplatin eller etoposid. IC
50-verdier ved cisplatinbehandling var 0,9 ± 0,02 uM, 1,19 ± 0,3 uM 0,83 ± 0,15 uM, og 0,79 ± 0,13 uM, henholdsvis (p = 0,1 ved en-veis ANOVA) (figur 2A og B). IC
50-verdier ved etoposid behandling var 0,28 ± 0,05 uM, 0,31 ± 0,04 uM, 0,54 ± 0,40 uM, og 0,58 ± 0,07 uM, henholdsvis (p = 0,24) (figur 2C og D). For GLC4 celler, som bærer K132E mutasjon i TP53-genet (tabell S4), IC
50-verdier ved cisplatin behandling var 3,03 ± 0,87 mikrometer, 2,56 ± 0,85 mikrometer, 1,87 ± 0,30 mikrometer, og 1,92 ± 0,61 mikrometer, henholdsvis (p = 0,14) (fig S6a); IC
50-verdier ved etoposid behandling var 0,19 ± 0,03 uM, 0,28 ± 0,01 uM, 0,20 ± 0,03 uM, og 0,19 ± 0,06 uM, henholdsvis (p = 0,08) (fig S6B). I sammendraget, forbigående overekspresjon eller nedregulering av MIR-34a i SCLC celler ikke påvirker følsomheten til cisplatin eller etoposid, uavhengig av TP53 status.
Celler ble transfektert med de angitte oligonukleotider. Feilfelt angir standardavvik på analyser i tre eksemplarer.
Uttrykk av MIR-34a målgener varierer blant kreftcellelinjer
Vi evaluerte uttrykket av utvalgte MIR-34a target-gener i SCLC og NSCLC-cellelinjer. Gener valgt var MET [8], MAP2K1 [26], BCL2 [21], og AXL [27]. Vi observerte en invers korrelasjon mellom MIR-34a og c-MET men ikke BCL-2 uttrykk i 5 SCLC cellelinjer (figur S7A og B). Til tross for relativt lavere Mir-34a uttrykk i SCLC cellelinjer (figur S1), gjorde vi ikke observere relativt høyere c-MET uttrykk i SCLC cellelinjer enn i NSCLC cellelinjer (figur S7A). Vi observerte imidlertid en redusert protein ekspresjon av cMET i A549 og NCI-H1299 NSCLC-cellelinjer transfektert med MIR-34a-forløper (figur 3A). Siden cMET uttrykk i NCI-H82 var umulig å oppdage, ektopisk uttrykk for MIR-34a eller kontroll forløpere hadde ingen effekt på cMET uttrykk, som forventet. En reduksjon av bcl-2-protein-ekspresjon ble observert i NCI-N592-celler transfektert med MIR-34a-forløper (figur 3A). Som bare MAP2K1 men ikke MAP2K2 genet er målet for MIR-34a, hadde vi ikke påvise redusert protein uttrykk for MEK1 /2 i celler transfektert med MIR-34a forløper; Dette er antagelig på grunn av overflødig rollene til MAP2K1 og 2. Transfeksjon av MIR-34a forløper downregulated mRNA ekspresjon av genet i AXL A549 og NCI-H1299 NSCLC-celler med mer enn 70% (endring av delta-Ct med mer enn 1,7), mens mRNA-ekspresjon av AXL genet i NCI-H82 NCI-og N592 SCLC-celler var for lavt til å bli detektert ved sanntids-PCR-analyse (figur 3B). I sammendraget, viste vi at ektopisk uttrykk for MIR-34a kunne nedregulerer MIR-34a target-gener i celler som uttrykker målene.
(A) protein uttrykk for MIR-34a mål i kreftcellelinjer transfekterte med kontroll forløper (C) eller MIR-34a-forløperen (M). (B) mRNA ekspresjon av AXL genet i cancerceller transfektert med kontroll-forløper eller MIR-34a forløper. RNA ble oppsamlet 24 timer etter transfeksjon. Uttrykket av genet i NCI-H82 og NCI-N592 celler var umulig å oppdage (UD).
Diskusjoner
Her er vi viste uttrykk for 7 kjente kreftfrem forbundet microRNAs i SCLC tumorer og cellelinjer så vel som i NSCLC-cellelinjer. Vi observerte at uttrykket av disse microRNAs var relatert til kliniske egenskaper og utfallet av SCLC pasienter. Uttrykk av disse microRNAs var relatert til følsomheten av SCLC celler til cisplatin eller etoposid. Videre overekspresjon eller nedregulering av MIR-34a påvirket ikke SCLC celle levedyktighet eller følsomhet for cisplatin og etoposid. Vi videre observert at uttrykket av MIR-34a målgener kan variere mellom SCLC og NSCLC cellelinjer.
Selv om microRNAs har vært mye studert i flere krefttyper, er det bare noen få publikasjoner som omhandler rolle mikroRNA i ondartet oppførsel av SCLC [20], [28], [29], [30]. Miko
et al.
Forhold mikroRNA uttrykk mellom SCLC-cellelinjer og tumorfrie lungevev fra pasienter med kronisk obstruktiv lungesykdom [28]. Du
et al.
Sammenlignet mikroRNA uttrykk mønster mellom 9 SCLC og 7 NSCLC cellelinjer, og en mesothelioma cellelinje [20], og Guo
et al.
Sammenlignet en SCLC cellelinje, NCI-H69, med sin doxorubicin-resistente underlinje [30]. Ranade
et al
rapporterte den eneste studie med SCLC vevsprøver [29].; 16 microRNAs ble undersøkt for overlevelsesanalyse i 25 pasienter, og MIR-92a-2 * ble identifisert som en potensiell dårlig prognostisk markør.
Selv om uttrykket av de 7 microRNAs i vår studie ble evaluert i mange krefttyper
in vitro
,
in vivo
, og i vevsprøver, de har ikke blitt evaluert før i forhold til pasientens overlevelse i SCLC. Selv om vår undersøkelse er retrospektiv og pasienten kohorten er liten, er dette den desidert største SCLC pasient kohort og innsamling av SCLC cellelinjer etterforsker mikroRNA uttrykk i denne svulsttypen. I tråd med vår forrige rapport, en posthoc analyse av en stor prospektiv randomisert studie med NSCLC [18], et uttrykk for de 7 microRNAs var ikke prognostisk heller ikke de relateres til behandlingsresultat hos pasienter med SCLC. Vi kan ikke utelukke at andre enn de 7 microRNAs presenteres her microRNAs kan være viktig for SCLC, og derfor videre studier kan være berettiget i SCLC å evaluere den prognostiske verdien av microRNAs ikke inkludert i denne studien.
speil 34a er en mye studert tumor suppressor mikroRNA som formidler apoptose, cellesyklus arrest, hemming av spredning, senescence, og hemming av invasjon og migrasjon i ulike krefttyper (gjennomgang av Hermeking
et al
. [31]). Den tumor suppressor Effekten av MIR-34a på kreftceller, men kan være tumortype spesifikk; mens MIR-34a nedregulerer vekst av IMR-90 fibroblast [8], samt flere NSCLC cellelinjer [23], Li
et al.
viste at overekspresjon av MIR-34a har verken påvirker celleproliferasjon, cellecyklus-fordeling, og heller ikke apoptose i en leverkreft cellelinje [32], og Pang
et al.
vist at overekspresjon av MIR-34a har ingen virkning på proliferasjonen av livmorhalskreft cellelinjer Hela og Siha samt choriocarcinoma-cellelinjen JAR [33]. MIR-34a er en direkte transcriptional mål av p53 [8], og mutasjoner av TP53-genet er funnet i mer enn 75% av SCLC prøvene [16]. En trend favoriserer lavere uttrykk for MIR-34a i SCLC cellelinjer i forhold til tumorfrie lungevev har blitt observert tidligere [28]. Etter avtale med våre opplever at ektopisk MIR-34a uttrykk ikke ned-regulere cellevekst eller indusere G1 arrest, gjorde MIR-34a uttrykk ikke korrelerer med sykdomsstatus (tabell S1) og progresjon (tabell 2) av SCLC pasienter. Forbløffende nok alle SCLC cellelinjene som ble testet i denne studien uttrykte lave cMET og Axl, to MIR-34a målgener. Det er sannsynlig at den veksthemming effekten av MIR-34a kan være vevs- og sykdomsspesifikk, diktert muligens ved nivået av iboende MIR-34a target-genekspresjon i hvilke celler med lave nivåer av MIR-34a target-genekspresjon, slik som SCLC celler, kan gjengi MIR-34a funksjonelt impotent.
i konklusjonen, gjorde uttrykk for 7 kreft-assosiert microRNAs ikke relateres til kliniske utfall av SCLC pasienter. MIR-34a uttrykk ble heller ikke relatert til ondartet oppførselen SCLC kreftceller og er dermed neppe være en kandidat terapeutisk mål for denne sykdommen.
Materialer og metoder
Pasient og etikk statement
Tretti-en formalinfikserte, parafininnstøpte (FFPE) tumorprøver fra pasienter som ble inkludert i en fase III-studie av Nord-Holland onkologi gruppen [22] ble hentet fra VU University Medical Center, Amsterdam, Nederland , etter godkjenning av Institutional Review Board [22]. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle deltakerne.
Cellelinjer
Et panel av 14 SCLC og 26 NSCLC cellelinjer ble studert og er oppført i Materials S1. Alle kreftcellelinjer ble holdt i RPMI-1640, supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS), med unntak av NCI-H792 som ble opprettholdt i DMEM supplert med 10% FBS. TP53 genmutasjon i cellelinjer ble bestemt ved å søke på p53 nettsiden (https://p53.free.fr/), IARC TP53 Database (https://www-p53.iarc.fr/), og den kosmiske database (https://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic/).
RNA ekstraksjon
Total RNA ble ekstrahert fra FFPE-prøver ved hjelp av RecoverAll Total nukleinsyreisolering kit (Ambion, Austin, TX) og total RNA fra cellelinjer ble ekstrahert med Trizol reagens (Invitrogen, Carlsbad, California), i henhold til produsentens anvisninger.
Kvantitativ real-Time PCR (QRT-PCR)
uttrykk av modne miRNAs, inkludert MIR-21, MIR-29b, MIR-34a /b /c, MIR-155, og la-7a, ble evaluert ved QRT-PCR-analyse som beskrevet tidligere [18] . RNU6B snRNA ble anvendt som en endogen kontroll. Hver mikroRNA analyse ble utført i tre eksemplarer. Uttrykk for microRNAs ble rapportert som delta Ct-verdien (Ct verdien av RNU6B – Ct verdien av målet mikroRNA). Vi definerte gruppene av tumorer eller celler med høy eller lav ekspresjon basert på median ekspresjon verdien av hver mikroRNA.
Ekspresjon av AXL-genet ble utført ved hjelp av Taqman genekspresjon analyse (Applied Biosystems) og er rapportert som delta Ct verdi. GAPDH-genet ble brukt som endogen kontroll.
Transfeksjon av mikroRNA forløper eller hemmere
MIR-34a forløper og inhibitor samt Cy3-merket kontroll MIR forløper og inhibitor ble kjøpt fra Ambion. Transfeksjon av MIR-forløper eller inhibitor ble gjennomført ved hjelp SIPORT ™
NeoFX
™ transfeksjon Agent (Ambion) etter produsentens anbefaling på en endelig oligonukleotid konsentrasjon på 30 nM.
Cell vekstanalyse
for å bestemme effekten av transfeksjon av cellevekst, 5000-10000 celler transfektert med de indikerte mikroRNA forløper eller inhibitor ble sådd ut i 96-brønners plater. Cellevekst ble bestemt av CellTiter 96 AQueousOne Solution Cell Proliferation Assay (Promega Corp. Madison, WI) hver 24. time i 5 påfølgende dager. Resultatene ble presentert som den optiske tetthet (OD verdi) absorbans ved 490 nm.
Gjentatte transfectin av N592 celle
100000 NCI-N592 SCLC-celler ble sådd ut i 24-brønners plater og transfektert med mir -34a forløper eller kontroll forløper. Cellene ble høstet, telt, og transfekteres på nytt med de respektive mirnas hver 72. time.
vekstinhibering assays
Cisplatin og etoposid ble oppnådd fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MI). 10.000 celler ble sådd på 96-brønners flatbunnede plater, transfektert med indikert forløper eller inhibitor microRNAs, dyrket i 24 timer før tilsetning av forskjellige konsentrasjoner av cisplatin og etoposid, og inkubert i ytterligere 72 timer. Den cytotoksiske effekten av cisplatin og etoposid ble bestemt av CellTiter 96 AQueousOne Solution Cell Proliferation analysen. Forsøk ble utført in triplo. Prosentandelen av cellelevedyktigheten ble bestemt ved å dividere absorbansverdiene for de behandlede celler av de av de ubehandlede celler, og konsentrasjonen av cisplatin eller etoposid som resulterer i 50% veksthemning (IC
50) ble bestemt.
Immunohistokjemi studie
Immunohistochemistry studie av p53 og bCL-2 i SCLC svulster ble utført og rapportert tidligere [22].
Western blot
NCI-N592 og A549 celler transfektert med MIR-34a-forløper eller kontroll-forløper ble inkubert i 48 timer. Cellene ble høstet, lysater ble fremstilt, og Western blot ble utført som beskrevet tidligere [34]. Antistoffer ble oppnådd fra Sigma-Aldrich (aktin), Santa Cruz Biotechnology Inc. (c-MET), Cell Signaling Technology (MEK1 /2), og Dako (bcl-2). Styrken på c-MET og BCL-2 ble vurdert ved hjelp GeneTools programvare (Syngene), normalisert ved intensiteten av aktin, og kalibrert til uttrykket nivå i A549 og NCI-H146 celle, henholdsvis.
Cellesyklus analyse ved strømningscytometri
48 timer etter transfeksjon, ble cellene samlet opp, vasket med kald PBS, fiksert med kald 70% etanol i PBS i minst 24 timer, og merket med propidiumjodid før telling av celler. Etter farging ble cellene telles på FACSCalibur hjelp av Cellquest Pro programvare (Becton Dickinson and Company, Frankin Lakes, NJ). Cellesyklus fraksjonene ble analysert ved hjelp av Modfit v3.0 programvare.
In situ
hybridisering av microRNAs
In situ
hybridisering av Mir-34b ble utført som tidligere beskrevet [18]. Nukleolære RNA U6 ble brukt som positiv kontroll.
Statistisk analyse
Statistisk analyse ble utført ved hjelp av SPSS versjon 17.0 (SPSS, Chicago, IL). Overlevelse ble beregnet ved anvendelse av Kaplan-Meier-metoden. Sammenligning av overlevelse mellom forskjellige grupper ble bestemt ved log-rank test. Forskjellene i mikroRNA uttrykk mellom gruppene ble analysert ved Wilcoxon Rank Sum-test. Korrelasjonen mellom narkotika følsomhet og mikroRNA uttrykk ble analysert ved Spearman rank korrelasjon. Sammenligning av medikamentsensitivitet av celler transfektert med forskjellige oligonukleotider ble utført ved en-veis analyse av varians (en-veis ANOVA). Alle p-verdier var to-sider og p-verdier mindre enn 0,05 ble ansett betydelig.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Expression of microRNAs i SCLC versus hos NSCLC cellelinjer. En delta Ct verdi på -15 indikerer at uttrykket av mikroRNA i cellen er for lavt til å bli oppdaget
doi:. 10,1371 /journal.pone.0021300.s001 plakater (TIF)
Figur S2.
in situ
hybridisering av microRNAs i en SCLC svulst. Nukleolære RNA U6 og Mir-34b ble oppdaget ved hjelp av en biotinyl tyramide-basert system med Vector NovaRed som substrat (brun). Prøver for rykke negativ kontroll og Mir-34b ble co-farget med Mayers hematoksylin (blå)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0021300.s002 plakater (TIF)
Figur S3.
Korrelasjon av uttrykk av p53 og (A) MIR-34a, (B) MIR-34b, og (C) MIR-34C, og (D) korrelasjon av uttrykk for MIR-34a og BCL-2. Ekspresjon av p53 og bcl-2 ble presentert som prosent av fargede celler ved immunohistokjemi. Korrelasjonskoeffisient (r) og p-verdien ble bestemt ved Spearman metode
doi:. 10,1371 /journal.pone.0021300.s003 plakater (TIF)
Figur S4.
NCI-H82 celle transfektert med (A) Cy3-merket mikroRNA inhibitor og (B) Cy3-merket mikroRNA forløper.
doi: 10,1371 /journal.pone.0021300.s004 plakater (TIF)
Figur S5.
Cellevekst analyse av NCI-H1299 NSCLC celler transfektert med MIR-34a eller kontroll forløper. Feilfelt referere til standardavvik
doi:. 10,1371 /journal.pone.0021300.s005 plakater (TIF)
Figur S6.
veksthemmende analyse av de GLC4 celler behandlet med (A), cisplatin og (B) etoposid. -Celler ble transfektert med de angitte oligonukleotider. Feilfelt angir standardavvik på analyser i tre eksemplarer
doi:. 10,1371 /journal.pone.0021300.s006 plakater (TIF)
Figur S7.
Protein uttrykk for c-MET og BCL-2 i 5 SCLC og 3 NSCLC cellelinjer. (B) Sammenheng mellom MIR-34a og c-MET uttrykk samt BCL-2 i 5 SCLC cellelinjer.
doi: 10,1371 /journal.pone.0021300.s007 plakater (TIF)
Tabell S1.
microRNAs og kliniske covariables.
doi: 10,1371 /journal.pone.0021300.s008 plakater (DOC)
Tabell S2.
Effekt av kliniske covariables på progresjonsfri overlevelse (PFS).
doi: 10,1371 /journal.pone.0021300.s009 plakater (DOC)
tabell S3.
Effekt av mikroRNA uttrykk på progresjonsfri overlevelse (PFS, uker) hos pasienter med SCLC stratifisert ved begrenset sykdom eller omfattende sykdom.
doi: 10,1371 /journal.pone.0021300.s010 plakater (DOC)
Tabell S4.
TP53 status og MIR-34a uttrykk i SCLC cellelinjer.
doi: 10,1371 /journal.pone.0021300.s011 plakater (DOC)
Materialer S1.
kreft cellelinjer.
doi: 10,1371 /journal.pone.0021300.s012 plakater (DOC)
