Abstract
Bakgrunn
neuregulin-en (NRG1) er en antatt schizofreni mottakelighet genet er involvert mye i sentralnervesystemet utvikling samt kreft invasjon og metastasering. Ved hjelp av en B lymfoblast-celle-modellen, vi tidligere har demonstrert svekkelse i NRG1α-mediert migrasjon i celler avledet fra pasienter med schizofreni så vel som virkninger av risiko alleler i NRG1 og katekol-O-metyltransferase (COMT), et andre gen involvert både ved schizofreni følsomhet og i kreft.
metodikk /hovedfunnene
Her undersøker vi celle adhesjon, en essensiell komponent prosess cellemotilitet, ved hjelp av en inte-celleadhesjon analyse basert på et samspill mellom ICAM- 1 og CD11 /CD18 heterodimer-integrin uttrykkes på lymfoblaster. I vår analyse, induserer NRG1α lymphoblasts å anta ulik adhesjon preget av tidsavhengige svingninger i fastheten i vedlegget. Den maksimale variasjons i vedheft over seksti minutter korrelerer sterkt med NRG1α-indusert migrasjon (r
2 = 0,61). NRG1α-indusert adhesjon variasjon er blokkert av erbB2, PI3K, og Akt inhibitorer, men ikke ved PLC, ROCK, MLCK, eller MEK-inhibitorer, impliserer erbB2 /PI3K /akt1 signalveien i NRG1-stimulerte, integrin-mediert celleadhesjon. I cellelinjer fra 20 pasienter med schizofreni og 20 friske kontrollpersoner, celler fra pasienter viser en vesentlig mangel i området NRG1α-indusert adhesjon (p = 0,0002). I motsetning til responsen av pasient-avledede celler forbolmyristatacetat er usvekket. Den COMT Val108 /158Met genotype viser en sterk trend mot å forutsi omfanget av NRG1α-indusert adhesjon respons med risiko homozygote ha redusert variasjon i celle adhesjon selv i normale personer (p = 0,063).
Konklusjon /Betydning
Våre funn tyder på at en mekanisme av NRG1 genetisk tilknytning til schizofreni kan innebære molekylærbiologi av cellen adhesjon
Citation. Kanakry CG, Li Z, Nakai Y, Sei Y, Weinberger DR ( 2007) neuregulin-en Regulerer celle adhesjon via en ErbB2 /phosphoinositide-3 kinase /Akt-Dependent Pathway: Potensielle implikasjoner for schizofreni og kreft. PLoS ONE 2 (12): e1369. doi: 10,1371 /journal.pone.0001369
Academic Redaktør: Schahram Akbarian, University of Massachusetts Medical School, USA
mottatt: 12 november 2007; Godkjent: 05.12.2007; Publisert: 26.12.2007
Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Public Domain erklæring som fastslår at en gang plassert i det offentlige rom, dette arbeidet kan fritt kopieres, distribueres, den egenutført Research Program av National Institute of Mental Health, NIH, forutsatt at majoriteten av midlene samt laboratorium:
finansiering overføres, endres, bygd på, eller brukes av alle for ethvert lovlig formål. plass der disse eksperimentene ble utført. The Howard Hughes Medical Institute-NIH stipendiater Program også gitt midler som støttet dette forskningsprosjektet. Verken sponsor var involvert i utformingen eller føring av selve forskningen, innsamling, analyse, eller tolkning av data, eller i forberedelse eller gjennomgang av den resulterende manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer.
Innledning
den dominerende gjeldende visningen av patogenesen av schizofreni tar for gitt at det er en nevrologiske lidelse knyttet til genetiske faktorer som påvirker hjernens utvikling og plastisitet. [1] Blant stadig flere mulige schizofreni mottakelighet gener er neuregulin-en (NRG1), som først ble funnet å være assosiert med økt risiko for schizofreni i en islandsk befolkning [2] og senere bekreftet i flere studier av andre populasjoner. [3] NRG1 finnes i flere isoformer, som alle inneholder en epidermal vekstfaktor (EGF) -lignende domene som kan signalisere gjennom erbB2, erbB3, eller ErbB4-reseptorer. [4] de fleste NRG1 isoformer eksisterer som transmembrane proteiner som antas å være proteolytisk spaltet, slik at den ekstracellulære, EGF-lignende domene bindes til erbB reseptorer. [5] NRG1 er involvert i mange viktige nevrologiske funksjoner, inkludert neuronal migrasjon, synaptisk modulasjon, og oligodendrocyte utvikling. [4], [6] Siden disse funksjonene og andre som er regulert av NRG1 er i det minste teoretisk er relatert til schizofreni største antatte nevrologiske opprinnelse, er NRG1 en biologisk plausibel schizofreni resistensgenet. Ikke desto mindre, den spesifikke biologiske mekanismen av dens genetiske forbindelse med schizofreni og dens rolle i patogenesen sykdommen er ukjent.
Bruken av B-lymfoblaster som en cellemodell for å undersøke grunnleggende molekylære mekanismer og genetiske sammenslutninger av et antall humane sykdommer , inkludert nevropsykiatriske lidelser, blir stadig mer utbredt. [7], [8], [9] anvendelsen av denne modellen for å utforske cellemigrasjon synes særlig hensiktsmessig gitt at nevronale og immunceller har mange felles molekylære og cellulære funksjoner som er viktige for cellemotilitet . [10], [11], [12] Således molekylær karakterisering og genetiske sammenslutninger av cellemotilitet i celler av hematopoietisk opprinnelse kan gi innsikt i nevronale celleprosesser. I nyere arbeid med en B lymphoblast celle modell, viste vi at B lymphoblasts uttrykke ErbB2 og ErbB3 reseptorer, og at NRG1α signaler gjennom disse reseptorene via PI3K /Akt og PLC veier for å fremme kjemotaktisk migrasjon. [7] Vi har også funnet at genetisk variasjon både i NRG1 og COMT tidligere assosiert med schizofreni spådd den vandrende responsen av disse cellene til NRG1, noe som tyder på en potensiell cellulær mekanisme for genetisk assosiasjon til sykdommen. I denne studien undersøker celle adhesjon, en fundamental komponent prosessen involvert i cellemotilitet. For å gjøre dette, har vi utviklet en integrin-celleadhesjon analyse i 96-brønners plater basert på et samspill mellom rekombinant humant ICAM-1 og dens CD11 /CD18 inte heterodimer reseptor uttrykt på lymfoblaster.
Integriner er en klasse av celleoverflatereseptorer som spiller viktige roller i en lang rekke cellulære og fysiologiske prosesser, alt fra embryoutvikling til immunitet mot metastase. [13], [14] Integriner danne heterodimere, trans reseptorer som består av en α-subenheten ikke- kovalent forbundet med en β subenhet. Inte mekle signale toveis, bidrar til å integrere intracellulære prosesser med den ekstracellulære miljøet. Festing av integriner til ekstracellulære matriksproteiner, eller motreseptorer tilstede på andre celler, aktiveres såkalt «utenfra og inn» signalering som fremmer en rekke cellulære prosesser, deriblant regulering av celleoverlevelse, proliferasjon og differensiering. [15] I mellomtiden, chemokine og annen kjemisk stimulering av celler kan modulere klebrighet av integriner, fremme såkalt «innside-ut» signalering. [16], [17], [18], [19]
inte~~POS=TRUNC griner~~POS=HEADCOMP har også vært implisert som spille nøkkelfunksjoner i formidling neuronal migrasjon [20] og synapse dannelse og vedlikehold. De spiller viktige roller i en rekke nevrologiske prosesser, innbefattet nerve- forløper celleadhesjon, kjetting migrering, differensiering og proliferasjon, [21], [22] regulering av neural-radial glial interaksjoner og fremming av riktig kortikale laminær organisasjon gjennom interaksjoner med Reelin [23] korrekt migrasjon av optiske tectal neuroblasts til spesifikke lameller; [24] riktig neural crest utvikling; [25] neural vekst kjegle filopodial modulering [26] oligodendrocyte overleve; [27] og retning av nevromuskulær synaptogenesis og migrasjon av Schwann celler til periferien. [28] Blant sine andre roller i synapse biologi er fremme synaptic modning, [29] formidling av synaptisk plastisitet, [30], [31] og avgjørende engasjement i LTP induksjon [32] og stabilisering [33], [34] samt romlige hukommelse. [32]
Fordi NRG1 og inte sammen på ulike utviklingsprosessene knyttet til neuronal migrasjon og til synapse biologi og gitt våre tidligere funn knyttet til NRG1-mediert celle migrasjon, vi utforsket virkningene av NRG1 aktivering av lymfoblaster i integrin-mediert celleadhesjon. Vi rapporterer at NRG1α induserer varierende grad av celle adhesjon preget av tidsavhengige svingninger i fasthet vedlegg målt med en roman vedheft analysen. Den maksimale rekkevidden av denne variasjon i adhesjon over tid (heretter forkortet som MRVA) korrelerer sterkt med effektiviteten av NRG1α-indusert cellemigrering, hvilket indikerer at MRVA tiltaket har biologisk relevans, i det minste i disse cellene. NRG1α-indusert MRVA er avhengig erbB2 /PI3K /Akt signalering. Videre MRVA indusert av NRG1α er betydelig lavere i B-lymfoblaster avledet fra pasienter med schizofreni, sammenlignet med de som er avledet fra normale kontroller. Til slutt, en enkeltnukleotidpolymorfi innenfor COMT, et gen involvert i følsomhet både til schizofreni og til metastatisk kreft, viser en sterk trend mot å forutsi MRVA av en gitt cellelinje, selv i normale personer. Totalt sett, våre studier viser at NRG1 signale aktiverer vedheft maskiner i en prosess som er svekket i celler avledet fra pasienter med schizofreni. Hvis disse funnene i immunceller er bevart i nervecelleprosesser, ville de hevde at en mekanisme av NRG1 genetisk tilknytning til schizofreni innebærer molekylærbiologi av cellen vedheft.
Resultater
lymfoblaster uttrykke inte homogent
Lymfocytter hovedsakelig uttrykker CD11 /CD18 heterodimer integrin (α
L /β
2, som også er kjent som leukocytt-funksjon-assosiert antigen-1 eller LFA-1). [35] Vi brukte strømningscytometri for å bestemme grunnlinjen integrin uttrykk og å sammenligne ekspresjon mellom cellelinjer avledet fra pasienter med schizofreni forhold til normale kontroller. Alle de testede cellelinjer uttrykte CD11 (korrigert midlere fluorescens, 14,018 ± 0,968) og CD18 (14,336 ± 1,019), med unntak av en pasient-avledet cellelinje. Denne cellelinje ble utelukket fra all ytterligere testing og statistiske sammenligninger. Det var ingen signifikant forskjell mellom cellelinjer som stammer fra pasienter eller kontroller i uttrykket av enten CD11a (pasienter (n = 23), 13.479 ± 1.364, kontroller (n = 35), 14.790 ± 1,303; p = 0,5046) eller CD18 (pasienter (n 23 =), 14.215 ± 1,633, kontroller (n = 35), 14,832 ± 1.291, p = 0,7667). Korrelasjon av CD11a med CD18-ekspresjon (lineær regresjon (n = 58), r = 0,806; Fisher r til z, p 0,0001) var i overensstemmelse med den konklusjon at CD11 og CD18 i hovedsak var som danner heterodimerer med hverandre. Dermed disse dataene viser at våre lymphoblast cellelinjer uttrykker CD11 /CD18 inte og at forskjells baseline uttrykk for disse inte er ikke en viktig faktor i forskjeller i migrasjon [7] eller adhesjon (se nedenfor) av pasient avledet lymfoblaster.
NRG1α induserer timelig varierende celleadhesjonsprosesser
Første forsøk med vår vedheft analysen antydet at vedheft hadde en tidsavhengighet. Så ble tidsforløpseksperimenter utført hvori lymfoblaster ble eksponert for NRG1α eller forbolmyristatacetat (PMA) i ICAM-belagte plater for enten 15, 30, 45 eller 60 minutter, og deretter ble platene vasket for å fjerne celler som ikke var fast tilhenger. PMA ble anvendt som en positiv kontroll som det fremmer cellebinding ved direkte aktivering av PKC. For hver cellelinje, ble cellene utsatt for samtidig eksponering til ICAM-belagte plater i fravær av NRG1α eller PMA. Variasjonen i rå NRG1 feste data (figur S1) og i NRG /kjøretøyet grad over tid (Figur 1, Figur S1, fig S2, og fig S3) indikerte at NRG1α-stimulerte celler som en populasjon ble varierende mellom tilstander av relativt fastere og svakere tilknytning sammenlignet med baseline kontroll vedheft. For å kvantifisere den observerte variasjon i celleadhesjon, vi definert NRG1-induserte maksimale rekkevidden av varierende adhesjon (MRVA) som den maksimale NRG /kjøretøy forhold minus minimums NRG /kjøretøy forholdet mellom de fire tidspunkter (figur 1).
som svar på NRG1α stimulering over tid, celler av en gitt cellelinje som en befolkning svinge mellom statene i forhold løsrivelse og tilstander av relativ vedlegg. For å teste påliteligheten av disse mønstrene ble ti cellelinjer på to forskjellige dager testet ved anvendelse av vårt adhesjonsanalysen. To representative eksempler er vist. Mens timingen av topper og bunner varierte mellom kjøringer, den maksimale rekkevidden av varierende adhesjon (MRVA) var bemerkelsesverdig konsistent (p = 0,016). Beregning av MRVA for hver kjøring av hver cellelinje vises.
Den maksimale omfanget av varierende adhesjon (MRVA) vises karakteristisk for hver cellelinje
For ytterligere å adressere pålitelighet disse mønstrene, vi utført gjentatte vedheft analyser på ti cellelinjer på to forskjellige dager. Disse ti linjene ble valgt for å gi et spekter av MRVA verdier i både pasient og kontrollcellelinjer, inkludert høy, middels og lave nivåer av variasjon. Klare mønstre av varierende vedheft over tid ble sett på begge dager, og selv om selve mønsteret varierte mellom gjentatte kjøringer i forhold til bestemte tider som definerte området vedheft, omfanget av vedheft responser observert (dvs. MRVA mål) var svært reproduserbare (Spearman rank korrelasjon (n = 10), rho = 0,806, p = 0,016) (figur 1).
Den MRVA av NRG1α-indusert celle adhesjon spår NRG1α-indusert migrering
MRVA korrelerte positivt og svært betydelig med graden av kjemotaktisk migrasjon som svar på NRG1α (lineær regresjon (n = 37), r
2 = 0,6065; Fisher r til z, p 0,0001) (figur 2), ved hjelp av migrasjon data vi har tidligere rapportert i de samme cellelinjer. [7] (tre cellelinjer som ble brukt for vedheft studier manglet migrasjon data og så ble ikke tatt med i denne sammenligningen.) Disse dataene tyder på at MRVA tiltaket har bredere biologisk betydning, i hvert fall til disse cellene. Selv om korrelasjonen ikke indikerer årsakssammenheng, er en varierende lim tilstand en biologisk plausibel og nødvendig mekanisme for celle migrasjon.
Adhesjonstester data ble sammenlignet med tilgjengelige data samlet ett år tidligere av NRG1α-indusert migrering av de samme cellelinjer.
Definere utfallsmål
Gitt påliteligheten av MRVA i en cellelinje og dens åpenbare biologiske betydningen, den MRVA ble etablert på dette punktet som den primære avhengige måling for all fremtid vedheft eksperimenter. I tillegg ble flere andre avhengige tiltak definert og anvendt for å studere effekten av signalveien inhibitorer. To andre Spekteret måler ble definert som følger: 1) ICAM-bare MRVA, som blir beregnet fra kontroll-celler alene (maksimum minus minimum av de fire tidspunktene) og representerer effekten av endogent signalisering og /eller tilstedeværelsen av ICAM seg i modulerende varierende adhesjon over tid, og 2) PMA /kjøretøy MRVA, som er beregnet analogt med NRG /kjøretøy MRVA og representerer variasjonen i celle adhesjon over tid som svar på PMA stimulering. Et mål på netto utgangsutstyret også er definert som følger: betyr ICAM virkning, som er gjennomsnittet av de fire ICAM fluorescens-verdier, og representerer den generelle «klebrighet» og relativ tilslutning tilstand av kontrollcellene ved utgangspunktet. I situasjoner hvor en hemmer utøves effekter på både baseline og kjemisk-indusert adhesjon, ble gjennomsnitts NRG og mener PMA fluorescens verdier analysert for å skille effektene på telleren kontra nevneren av gjennomsnittet NRG /kjøretøy eller mener PMA /kjøretøy forholdstall.
NRG1α medierer sine effekter på celle adhesjon gjennom erbB2 signaliserer
Vi har tidligere vist at NRG1α-mediert migrasjon av lymfoblaster var avhengig erbB2 signale; derfor testet vi om erbB2 stimulering var involvert i mekanismen NRG1α-indusert celle adhesjon ved å behandle celler med selektive erbB2 hemmer AG825. AG825, viste en betydelig doseavhengig effekt på å dempe MRVA av NRG1α-indusert adhesjon (ANOVA, F (3,4) = 23,358, p 0,0001). (Tall 3)
Administrasjon av AG825 i DMSO kjøretøy (n = 5) forårsaket en robust, reduksjon doseavhengig i MRVA indusert av NRG1α. Sammenlignet med kontrollen over bilen, ** representerer p 0,01 og **** representerer p 0,0001. Sammenlignet med lav dose, representerer + p 0,05 og +++ representerer p. 0,001
PI3K signalering er viktig for formidling NRG1α-indusert varierende celle adhesjon
For å adressere rollen til PI3K signalering i NRG1α-indusert adhesjon effekt, studerte vi den irreversible inhibitor PI3K Wortmannin. Dosene som ble brukt var alle godt under konsentrasjoner som Wortmannin kryssreagerer med MAPK, myosin-lettkjede-kinase (MLCK), eller phosphoinositide-4-kinase signalering i et forsøk på spesifikt mot PI3K signalering. Wortmannin viste en signifikant, doseavhengig, dempende på NRG /kjøretøy MRVA (ANOVA, F (3,4) = 17,208, p 0,0001). (Figur 4) uten effekter på baseline eller PMA-indusert adhesjon
Wortmannin i DMSO kjøretøy (n = 5) viste en sterk, doseavhengig, dempende på NRG /kjøretøy MRVA tiltak. Sammenlignet med kontrollen over bilen, * representerer p 0,05, ** representerer p 0,01, og **** representerer p 0,0001. Sammenlignet med lav dose, representerer + p 0,05 og ++ representerer p. 0,01
Akt hemming ligner PI3K hemming og demper NRG1α-indusert adhesjon effekt
Akt Inhibitor X selektivt hemmer fosforylering av Akt med minimale effekter på PI3K, PDK1, eller SGK1 signalering. Effekten av dette stoffet speilet resultatene av PI3K hemming med en doseavhengig, betydelig reduksjon i NRG /kjøretøy MRVA (ANOVA, F (3,4) = 4,709, p = 0,0214) (figur 5a), og ingen effekt på ICAM- alene eller PMA /kjøretøy MRVA. I motsetning til med PI3K-hemming, ble Akt inhibering assosiert med en signifikant reduksjon i gjennomsnittlig ICAM-stående feste (ANOVA, F (3,4) = 6,711, p = 0,0086) (figur 5b). Men denne reduksjonen ble bare sett ved den høyeste dosen (p = 0,0033). Den samme effekten ble også sett i betydelig grad redusere den rå NRG fluorescens verdier ved den høye dosen bare (ANOVA, F (3,4) = 11,639, p = 0,0007) med ingen åpenbare trend på andre doser. Gitt denne felles effekt på gjennomsnittlig ICAM-alene og mener NRG vedlegg utelukkende ved høye doser, kan det representere en kryssreaksjon av inhibitor ved høye konsentrasjoner med en annen signalveien viktig for å opprettholde et lim tilstand.
Administrasjon av Akt Inhibitor X i vannfartøyet (n = 5) forårsaket en doseavhengig nedgang i NRG /kjøretøy MRVA (A). I motsetning til PI3K-hemming, ble Akt inhibering forbundet med en statistisk signifikant reduksjon i gjennomsnittlig ICAM (B) og bety NRG (ikke vist) rå fluorescens-verdier ved høye dosen bare med noen trend ved lavere doser. Sammenlignet med kontrollen over bilen, * representerer p 0,05 og ** betyr p 0,01. Sammenlignet med lav dose, representerer + p 0,05 og ++ representerer p. 0,01
Rho kinase er ikke avgjørende for NRG1- eller PMA-indusert vedheft effekter
Siden rho er også nedstrøms av PI3K og har vært implisert i celle adhesjon mekanismer, [36], [37] var det viktig å undersøke hvorvidt Rho spiller en rolle i NRG1-indusert celle-adhesjon. Det er imidlertid ingen celle-gjennomtrengelige, spesifikke Rho-inhibitorer som er tilgjengelige, slik at Rho-assosiert proteinkinase (ROCK) inhibitor Rho Kinase Inhibitor IV ble anvendt. Dette ROCK hemmer hadde ingen signifikant effekt på noen av vedheft parametere undersøkt, og så ROCK signale ikke ut til å spille noen avgjørende rolle i moduler baseline, NRG1-indusert, eller PMA-indusert varierende heft.
MEK signalering er ikke er vesentlig for den NRG1-indusert celle-adhesjon virkning
den selektive MEK-inhibitor PD98059 hadde ingen virkning på noen av de adhesjons parametre på en hvilken som helst dose (ikke vist). Dette tyder på at selv ble MEK signalering er involvert i disse prosessene, er det ikke avgjørende for baseline adhesjon eller NRG1- eller PMA-mediert adhesjon.
fosfolipase C-signalering er nødvendig for å opprettholde et klebemiddel tilstand generelt
som PI3K, PLS-inhibitoren U73122 også forårsaket en signifikant reduksjon i den induserte NRG1α-MRVA (ANOVA, F (3,4) = 4,186, p = 0,0304) (figur 6a), men virkningen av denne inhibitor syntes å være en samlet reduksjon i celleadhesjon generelt, og ikke en NRG1 /erbB2-avhengige virkning. Både baseline variasjon (ICAM-alone MRVA) (ANOVA, F (3,4) = 8,883, p = 0,0023) og baseline bety vedlegg (gjennomsnittlig ICAM-alone) (ANOVA, F (3,4) = 4,915, p = 0,0186 ) ble redusert etter eksponering for U73122 (figurene 6b og c, henholdsvis). Imidlertid endringen i midlere ICAM-alene var betydelig bare ved den høyeste dosen (p = 0,0155) (figur 6c). Likeledes, den rå midlere NRG og PMA fluorescens-verdier hadde signifikant reduksjon bare ved den høyeste dosen (NRG: ANOVA, F (3,4) = 8,672, p = 0,0025; PMA: ANOVA, F (3,4) = 4,736, p = 0,0210). Det er viktig å merke seg at hverken den midlere NRG /kjøretøy (figur 6d) og heller ikke den midlere PMA /kjøretøy (figur 6e) ratio signifikant forskjellig grader doser, noe som indikerer at PLC inhibering påvirker vanlig celledelt signalering på tvers av disse baner til en tilsvarende grad uavhengig av den stimulerende middel. Derfor, selv om PLC inhibitor gjorde utøve en betydelig effekt på å redusere NRG /kjøretøy MRVA, dette sannsynligvis skyldes redusere den samlede adhesjon og sammentrekkende omfanget av den potensielle respons, snarere enn til spesifikk hemming av en NRG1 /erbB2-avhengig reaksjonsvei.
Mens PLC inhibitoren U73122 i etanol bærer (n = 5) forårsake en betydelig reduksjon i NRG /kjøretøy MRVA (A) og en utvikling i retning av reduksjon av PMA /kjøretøy MRVA (ikke vist), det utøves en mye sterkere effekt på dempende basislinje MRVA på grunn av tilstedeværelsen av ICAM og endogene signal alene (B). Videre, ved høye doser, forårsaket det en signifikant reduksjon i referanse ICAM festet (C) og i gjennomsnittlig NRG og PMA feste (rå fluorescens-verdier) (ikke vist). Imidlertid mener NRG /bærer (D) og at PMA /bærer (E) ble ikke signifikant endret. Sammenlignet med kontrollen over bilen, * representerer p 0,05 og ** betyr p 0,01. Sammenlignet med lav dose, ++ representerer p 0,01 og +++ representerer p. 0,001
myosinlettkjedefosfatase kinase (MLCK) signalering er viktig for baseline vedheft
Gitt den kjente betydningen av MLCK fremme vedlegget ble MLCK inhibitor ML-7 brukes til å undersøke dens virkning på våre ulike vedheft parametere. Som forventet, den viktigste effekten av MLCK inhibering var en doseavhengig reduksjon i gjennomsnittlig ICAM-stående feste (ANOVA, F (3,4) = 17,601, s 0,0001) (figur 7a). Men det var ingen endringer i de rå fluorescens verdier av PMA (ANOVA, F (3,4) = 0,381, p = 0,7686) (figur 7b) eller NRG (ANOVA, F (3,4) = 0,322, p = 0,8095 ) (figur 7c). Det er ingen signifikant effekt på noen av de tre MRVA parametere ble sett. Det er også viktig å understreke at effekten observert av PLC versus MLCK hemming var ikke identiske. PLC-hemming forårsaket nedgang i de rå NRG og PMA fluorescens verdier, noe som tyder på sin brede betydning for flere vanlige veier av vedheft. I kontrast, MLCK hemming syntes å utøve en effekt begrenset til baseline ICAM vedheft uten effekter på de rå gjennomsnitts NRG eller PMA fluorescens verdier.
Administrasjon av MLCK inhibitor ML-7 i DMSO kjøretøy (n = 5) forårsaket en signifikant reduksjon i referanse feste på midten, og høye doser (A). Selv om dette var forbundet med økning i gjennomsnittlig NRG /kjøretøy og mener PMA /kjøretøy (ikke vist), disse effektene var bare en konsekvens av reduksjoner i nevneren som både rå PMA (B) og NRG (C) fluorescens verdier var uendret. Sammenlignet med kontrollen over bilen, ** representerer p 0,01 og *** representerer p 0,001. Sammenlignet med lav dose, +++ representerer p 0,001 og ++++ representerer p 0,0001
NRG1α-indusert varierende vedheft er fuktet lymphoblasts avledet fra pasienter med schizofreni
Gitt vår tidligere observasjon at pasient avledet lymphoblasts viste en mindre robust trekkfugl respons NRG1α og den nåværende korrelasjonen mellom våre migrasjon og vedheft tiltak, spådde vi at det ville også være en MRVA forskjell mellom pasienter og kontroller. Faktisk NRG /kjøretøy MRVA var betydelig lavere i lymphoblasts avledet fra pasienter sammenlignet med de som stammer fra normale kontroller (pasienter (n = 20), 0.520 ± 0.045, kontroller (n = 20), 0,780 ± 0,044; p = 0,0002) ( Figur 8a og c). I motsetning til dette, PMA responsen var lik mellom grupper, noe som indikerer at pasienten avledet lymfoblaster fremdeles beholdt evnen til å mediere robust celleadhesjon, men var ikke i stand til å gjøre det hensiktsmessig i respons til NRG1α. En serie av PMA dose-respons-forsøk ble utført for å utelukke muligheten for at mangelen på forskjellene mellom gruppene var det en dosesensitiv fenomen; Disse testene viste nesten identiske bølgeformer i alle fag på alle analyserte konsentrasjoner (figur S2), noe som ytterligere antyder at PMA responsen var normal i pasient-avledede cellelinjer. Det er viktig å merke seg at PMA også induseres varierende grad av adhesjon i vår analyse, på samme måte, men mer ekstreme enn for NRG1α. Både MRVA mål på PMA-indusert adhesjon (pasienter (n = 20), 1.561 ± 0,217, kontroller (n = 20), 1,356 ± 0,121, p = 0.4124) (figur 8b), og gjennomsnittlig PMA /kjøretøy (pasienter (n = 20), 2,083 ± 0,120, kontroller (n = 20), 1,980 ± 0,085; p = 0,4840) ikke skiller mellom pasient avledet og kontroll-avledet celler. Det var ingen forskjell i gjennomsnittlig ICAM tilknytning mellom pasient-avledet og kontroll-avledede celler i den ustimulerte ICAM stående tilstand.
NRG /kjøretøy MRVA var signifikant lavere i lymfoblaster avledet fra pasienter sammenlignet med de som er avledet fra normal kontroller~~POS=HEADCOMP (A). PMA /kjøretøy MRVA var lik mellom pasient-avledet og kontrollcellelinjer utvunnet (B). Den relative svekkelse i pasient avledet celler ikke synes å være isolert til vedlegg eller løsrivelse, men var indikasjon på en generell mer innsnevret respons med mindre variasjon fra baseline vedheft svar på NRG1α (C). *** Representerer p. 0,001
COMT genotype spår variasjons i NRG1α-indusert adhesjon
Gitt forholdet mellom enkeltnukleotidpolymorfi i COMT (val108 /158met, rs4680 ) og i NRG1 (rs6994992) til NRG1α-indusert cellemigrasjon etablert tidligere, [7] vi søkt å finne ut om NRG1α-indusert celle adhesjon viste også slike assosiasjoner. Nærværet av schizofreni risiko forbundet COMT val allele viste en sterk trend mot å forutsi mindre NRG1α-indusert MRVA i hele prøven med lignende virkninger i begge grupper (uparet t-test, p = 0,0632) (figur 9a). ANOVA utføres med diagnosegruppen og genotype som uavhengige faktorer viste ingen genotype etter diagnose interaksjoner for enten genet. I tillegg var det ingen effekt av COMT genotype på PMA-indusert MRVA (uparet t-test, p = 0,8727). På grunn av den lave mindre allel frekvensen NRG1 rs6994992, ble vår studie underpowered å teste for en tilknytning til denne SNP.
COMT, en antatt mottakelighet genet for både schizofreni og metastatisk kreft, tidligere ble vist å ha genotypen effekter på celle migrasjon med risiko genotype rs4680 V /V som viser mest svekket migrasjon. I våre vedheft data (n = 40), var det en sterk trend (p = 0,0632) mot redusert NRG1α-indusert MRVA risiko homozygote sammenlignet med ikke-risiko homozygote (ingen heterozygote cellelinjer opprettholdes).
Diskusjoner
Vi har presentert en rekke studier som gir bevis for at NRG1α aktivering av B lymfoblaster induserer en timelig varierende celle adhesjon respons som er mediert av erbB2 /PI3K /akt1 sti og som er unormal i celler avledet fra pasienter med schizofreni og påvirket av COMT val /møtte genotype. Så vidt vi vet, disse er de første data som viser at NRG1α induserer vedlegg i B lymfoblaster i en analyse av celle adhesjon, avslørende tidsavhengig svingninger i netto heft. I våre studier, den MRVA av denne NRG1α-indusert adhesjon responsen har tydelig biologisk relevans i at det spår både graden av cellemigrasjon respons på NRG1α samt forskjeller mellom schizofreni saker og normale kontrollpersoner. I sin tur kan MRVA selv forutsies ved en enkeltnukleotidpolymorfi innenfor COMT, som også er involvert i metastatisk kreft. Mens eksogene NRG1α øker celleoverflate-ekspresjon av CD18-integrin (figur S4), er stabile karakter av denne effekt over tid tyder på at denne økte overflate-ekspresjon ikke er direkte ansvarlig for formidling av temporært varierende adhesjon respons. Snarere er dette NRG1α-indusert adhesjon svar avhengig signaliserer gjennom erbB2, PI3K, og Akt veier. PLC og MLCK signale også spille roller i heft, men ikke anstrenge NRG1α-spesifikke effekter.
Metodiske betraktninger
Som tidsavhengig variasjon i celle adhesjon som svar på NRG1 er den kritiske fenomen hvorpå arbeidet rapportert her er basert, er det viktig å validere at denne variasjonen representerer en reell biologisk effekt, og er ikke bare «støy.» Ja, det kan hevdes at siden vår tiltaket er basert på en populasjon av celler som sannsynligvis er ikke homogen med hensyn til feste stater, cellesyklusfaser og andre biologiske fenomener, er det MRVA mer sannsynlig tilfeldig enn ikke. Vi har utført en rekke detaljerte eksperimenter som viser overbevisende og konsekvent at dette varierende vedheft er ikke tilfeldig: spesifikt, en) bestemte tidsmessige mønstre av tilknytning og løsrivelse, mens ikke iboende i unstimulated cellen selv, synes å være relativt bevart når celler fra samme cellelinje under de samme betingelser på samme tid utsettes for spesifikke stimuli som endrer deres festing tilstand (figur S2); 2) den MRVA er usedvanlig pålitelig innenfor en cellelinje undersøkt ved gjentatte anledninger på forskjellige dager (figur 1); 3) den MRVA påvirkes på en doseavhengig måte ved hjelp av forskjellige relevante signalveien inhibitorer (figurene 3-7); 4) MRVA indusert av NRG1 spår andre NRG1 relaterte fenomener i disse cellene, f.eks
