Abstract
kreft stamceller (cscs) er en liten del av kreftceller i stand til selvfornyelse og tumor vedlikehold. Utrydde kreft stamceller, roten av svulst opprinnelse og tilbakefall, har dukket opp som en lovende tilnærming for å forbedre lungekreft overlevelse. Cancer stamceller er rapportert å oppholde seg i side populasjonen (SP) av dyrkede lungekreftceller. Vi rapporterer her sameksistens av en distinkt populasjon av ikke-SP (NSP) celler som har tilsvarende selvfornyelse kapasitet i forhold til SP celler i en lunge svulst sfære analysen. Sammenlignet med tilsvarende celler i monolagkulturer, lunge svulst kuler, dannet fra human ikke-småcellet lungekreft cellelinjer A549 eller H1299, viste tydelige morfologiske forskjeller og økt uttrykk av stamcellemarkører CD133 og OCT3 /4. Lungetumorkuler oppviste også økt karsinogent potensial som bare 10000 lungetumor sfæriske celler var nødvendig for å fremstille xenoimplantater tumorer i nakne mus, mens det samme antall monolagsceller ikke klarte å indusere tumorer. Vi viser også at lungetumor sfærer viste nedsatt 26S-proteasomet aktivitet sammenlignet med monolaget. Ved hjelp av ZsGreen-COdc (C-terminal sekvens som dirigerer degradering av ornitindekarboksylase) reporter analyse i NSCLC-cellelinjer, bare mindre enn 1% monolagskulturer ble ZsGreen positive indikerer lav 26S-proteasomet, mens lungetumor sfære viste økt antall av ZsGreen- positive celler, noe som tyder berikelse av cscs i sfæren kulturer
Citation. Pan J, Zhang Q, Wang Y, du M (2010) 26S Proteasome aktivitet er nedregulert i Lung Cancer Stem-lignende celler Spredd
In vitro
. PLoS ONE 5 (10): e13298. doi: 10,1371 /journal.pone.0013298
Redaktør: Xinwei Wang, National Cancer Institute, NIH, USA
mottatt: 18 april 2010; Godkjent: 17 september 2010; Publisert: 11 oktober 2010
Copyright: © 2010 Pan et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Arbeidet ble støttet av NIH stipend R01CA134682. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
kreft stamceller (cscs) er et lite reservoar av selvbærende celler med den eksklusive muligheten for selvfornyelse og tumor vedlikehold [1]. Bare en liten undergruppe av kreftceller i en tumor har karakteristikkene av stamceller, og kan derfor sette i gang en tumor når transplanterte [3], [4]. Antatte cscs i akutt myelogen leukemi (AML) ble først isolert i 1994 [5]. Med fremskrittene i fluorescens-aktivert cellesortering (FACS), og nylig identifiserte celleoverflatemarkører som Sca-1, og CD133, kan cscs isoleres ikke bare fra blod kreft, men også fra faste tumorer [1].
cscs i menneskelig brystkreft har blitt identifisert som en sjelden populasjon av CD44
+ /CD24
– /lav /ESA
+ celler [6]. 100 av disse cellene var i stand til å danne nye svulster, mens andre tumorceller som ikke klarte å danne tumorer i SCID-mus. Bryst cscs ble også identifisert som CD44
+ /CD24
– /oktober-4
+ av Ponti
et al
. i 2005 [7]. Cscs i tykktarmskreft ble funnet å være en mindre enn 2,5% av befolkningen med positive CD133 uttrykk [8], og nylig definert som CD44
+ /CD166
+ /ESA
+ [9]. Bronchioalveolar stamceller (BASCs) ble nylig identifisert som den antatte stamcelle befolkningen for lunge adenokarsinom, og kan bli isolert som CD45
– /PECAM
– /Sca-en
+ /CD34
+ celler ved FACS [10]. Cscs i småcellet og ikke-småcellet lungekreft ble også rapportert som en sjelden populasjon av udifferensiert CD133
+ celler [11]. Disse var i stand til å fornye seg selv som tumor kuler i serumfritt medium, og generere tumorxenografter fenotypisk skilles fra den opprinnelige tumor, når det injiseres i SCID-mus.
En alternativ metode for isolering av stamcellepopulasjoner er gjennom anriking av side populasjon (SP) celler [2]. SP-celler er identifisert ved evnen til å effluks Hoechst fargestoff, en prosess mediert av ATP-bindende kassett transportør brystkreft motstand protein (BCRP-1) [12]. Siden Goodell
et al
. først rapportert at SP er anriket på hematopoetiske stamceller (HSCs) [13], SP-celler er identifisert i en rekke normale og maligne vev, inkludert lungene [14]. BCRP-en mangelfull mus manglet SP i benmargen, men hadde ingen vesentlige blodkreft unormalt [15]. Således, den nøyaktige funksjonelle forhold mellom SP fenotype og stamcelle funksjon er fortsatt uklar. Både SP og NSP fraksjoner fra DAOY medulloblastom-cellelinjen var i stand til å rekonstituere det opprinnelige foreldre befolkning, og bare liten klonogene anrikning ble observert i SP-fraksjonen [16].
Hematopoetiske stamceller (HSCs) er rapportert å bor i SP brøkdel av voksen mus benmarg (BM), men en fersk rapport viste sameksistens av NSP HSCs som ikke signifikant forskjellig fra SP HSCs i antall, og selvfornyelse kapasitet [17]. I tillegg CD34
– /lowc-Kit
+ Sca-1
+ avstamning markør
– cellepopulasjon, som er sterkt anriket på mus HSCs, ble nesten likt inndelt i SP og NSP celler. Disse var i en hviletilstand og viste enhetlige celle-sykluskinetikk, uavhengig av om de var i SP eller NSP [17]. Ytterligere karakterisering av SP i kreftceller er derfor nødvendig å vurdere hvilken rolle disse cellene spiller i lungekreft fullt.
Nyere funn viser at kjemoterapeutiske legemidler, slik som doxorubicin og cisplatin, kan indusere spredning av cscs
in vitro product: [18]. Disse cellene opprettholdt sin selvfornyelse kapasitet som demonstrert av veksten av kreftkuler
in vitro
, og hadde høy tumorigent og metastatisk potensial følgende inokulasjon i SCID-mus. Cellegifter, slik som cisplatin og ifosfamid, er også kjent for å trykke ned uttrykk for proteasomal subenheter [19], og ned-regulere ubiquitin-proteasome avhengig proteolyse [20]. Reduserte 26S proteasomet aktivitet ble funnet å være en unik funksjon i CIC (kreft initiere celler) i glioma og brystkreft, kan det brukes til å spore cscs
in vivo product: [21]. Men Benzyloxicarbonyl-Leu-Leu-Nle-CHO (LLNle), en γ-sekretase inhibitor, ble rapportert å effektivt drepe menneskelige glioblastom tumor initiere celler (GBM TIC)
in vitro
av hemming av 26S proteasomet . Derfor er ytterligere klarlegging av 26S proteasomet aktivitet er nødvendig for fullt ut å bestemme dens rolle i cscs og anticancerterapi. I siste instans kan dette hjelpe til med identifisering av nye mål for fremtidig terapeutisk intervensjon.
I denne studien undersøkte vi om lunge cscs utelukkende ligge i siden befolkningen og om lunge svulst kuler med selvfornyelse kapasitet fra NSCLC cellelinjer kan være en kilde til berikelse av lunge cscs.
Metoder
Cell Culture
Menneskelig NSCLC cellelinjer A549 og H1299 ble kjøpt fra American Type Culture Collection (Manassas, VA), og dyrket i RPMI 1640 medium med 10% føtalt bovint serum (FBS) (Gibco) og penicillin og streptomycin cocktail (Gibco). 293 FT-celler ble innkjøpt fra Invitrogen (Carlsbad, CA) og dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM) (Gibco) med 10% FBS og penicillin og streptomycin cocktail. Alle celler ble dyrket i en fuktet inkubator ved 37 ° C med 5% CO
2.
Farging av celler med Hoechst 33342
Metoder for identifikasjon av SP ble tilpasset fra tidligere rapporter [ ,,,0],22], [23]. I korthet ble cellene trpsinized og resuspendert ved 1 x 10
6 celler /ml i DMEM med høy glukose, 2% (v /v) FBS og 10 mM N- (2-hydroksyetyl) piperazin-N «- (2- -etansulfonsyre) (HEPES)), inkubert med 5 ug /ml Hoechst 33342 fargestoff (med eller uten Fumitremorgin C (MP Biomedicals, Eschwege, Tyskland) i 90 minutter i et 37 ° C vannbad, og rørene ble forsiktig snudd hver 20 min for å motvirke celle sedimentering og klumpdannelse. cellene ble sentrifugert ved 375 x g i 6 minutter ved 4 ° C og resuspendert i et egnet volum av kald Hanks balanserte saltløsning (HBSS) med 2% (v /v) FBS. cellene holdt ved 4 ° C for resten av forsøket. for død celle diskriminering, ble 2 ug /ml propidiumjodid (PI) tilsettes umiddelbart før strømningscytometri. celle~~POS=TRUNC prøver~~POS=HEADCOMP ble analysert på en MoFlo (Beckman Coulter) cellesorterer, og utslipp ble samlet inn gjennom en 610 nm lang pasning dichroic speil (DCLP) til en 620 nm lang pasning (LP) filter for Hoechst rød samling og en 424/44 nm båndpass (BP) filter for Hoechst blå samling. Den siden befolkning «SP» ble identifisert som en gruppe av celler i stand til å utelukke Hoechst fargestoff, et karakteristisk opphevet med 10 pM Fumitremorgin C-behandling [22].
Sphere Formation Assay
Lunge tumor sfærer ble isolert gjennom kultur ved lav tetthet i serumfritt kultur tilstand som tidligere beskrevet, som tillater valg av udifferensierte kreft stilk og progenitorceller, mens serumavhengige differensiert tumorceller og ikke-transformerte hjelperceller ble negativt valgt [8], [11], [24]. A549 og H1299 lungekreftceller ble platet ved klonal tetthet i serumfritt DMEM-F12-medium supplert med, 5 mM HEPES, 0,1% natriumbikarbonat, 0,4% BSA, glutamin og antibiotika (Gibco-Invitrogen), og inneholdende 20 ng /ml EGF og 10 ng /ml bFGF. Ubehandlede vevskulturflasker ble brukt til å redusere cellene skulle vedhefte og støtte vekst som udifferensierte kreft kuler. Medium ble erstattet eller supplert med nye vekstfaktorer to ganger i uken frem til cellene begynte å vokse og danne flytende aggregater. Tumor sfærer ble samlet inn med en 100 mikrometer celle sil (BD, Bedford, MA), og utvidet ved enzymatisk og mekanisk dissosiasjon, etterfulgt av re-plating av både enkeltceller og rest små aggregater i fullstendig frisk medium.
Flow cytometry
for flowcytometri, tumor kuler eller monolagskulturer ble mekanisk dissosiert til enkeltceller, vasket og inkubert med en passende fortynning av kontroll eller spesifikt antistoff. Antistoffer som ble brukt var PE konjugert anti-CD133 /1 fra Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Tyskland), FITC konjugert anti-CD44 (eBioscience, San Diego, CA), og anti-OCT3 /4 (Santa Cruz Biotechology, CA). For PE-konjugert anti-CD133 /1, ble cellene først blokkert med blokkerings reagens i 5 minutter, deretter en 20 minutters inkubering med antistoff. For OCT3 /4 uttrykk, ble cellene fiksert og permeabilized med FIX PERM® reagenser (Invitrogen) ved å følge fremstilling instruksjon, og inkubert med muse-monoklonalt antistoff mot Oct3 /4 (Santa Cruz Biotechnology) i 20 min i mørket, etter vasket med PBS ble cellene deretter inkubert i mørket med et FITC-konjugert sekundært antistoff ( Invitrogen). Som negativ kontroll ble cellene farget med de passende isotop kontroll. For FITC konjugert anti-CD44 ble cellene inkubert med antistoffer for 20 minutter i mørket. Etter vasket med PBS ble cellene analysert på en FACS Calibur flowcytometer (Becton Dickinson).
Proteasome Funksjons Analyser
chymotryptisk, tryptiske og caspase proteasomer aktiviteter ble målt som beskrevet tidligere [25] med noen mindre modifikasjoner. A549, ble H1299 og deres primær lungetumor sfæriske cellene ble vasket med fosfat-bufret saltvann (PBS) og pelletert ved sentrifugering. Cellepelletene ble sonikert i homogeniseringsbuffer (25 mM Tris [pH 7,5], 100 mM NaCl, 5 mM ATP, 0,2% (v /v) Nonidet P-40 og 20% glycerol, og celleavfall ble fjernet ved sentrifugering ved 4 ° C. protein~~POS=TRUNC konsentrasjonen~~POS=HEADCOMP i den resulterende rå cellulære ekstrakter ble bestemt ved mikro (bicinchoninic syre) protokoll (Bio Rad, Rockford, IL) med BSA (Sigma) som standard. for å måle 26S-proteasomet aktivitet, 100 ug protein fra råolje cellulære ekstrakter av hver prøve ble fortynnet med buffer i (50 mM tris [pH 7,4], 2 mM ditiotreitol, 5 mM MgCl
2, 2 mM ATP) til et sluttvolum på 1 ml (analysert i fire eksemplarer). De fluorogene proteasomer substrater Suc-LLVY-AMC (chymotryptisk underlaget; Biomol International, Plymouth Meeting, PA), Z-ARR-AMC (tryptiske underlaget, Calbiochem), og Z-LLE-AMC (caspase-lignende substrat; Biomol International) ble oppløst i DMSO og tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 80 uM. Proteolytiske aktiviteter ble kontinuerlig overvåket i 2 timer ved 37 ° C ved å måle frigivelse av den fluorescerende gruppe, 7-amido-4-metylkumarin (AMC), ved en fluorescens plateleser (Spectramax M2, Molecular Devices, Sunnyvale, CA) med eksitasjon og emisjonsbølgelengder av 380 og 460 nm, henholdsvis.
Alamar blå analyse
Celleviabilitet ble målt ved Alamar blå [26]. A549 og H1299-celler ble sådd ut i 96-brønners plater (Falcon BD) med en tetthet på 2 x 10
3-celler per brønn. For kreft sfære kulturer, enkelt celle var enzymatisk og mekanisk dissosiert. 24 timer etter utsåing ble cellene eksponert for forskjellige konsentrasjoner av cisplatin eller doksorubicin som indikert i 48 timer. Alamar Blå (Biosource, Camarillo, CA) ble tilsatt direkte til kulturmediet på 10% av medievolumet i løpet av de siste 10 timer av den 48 timers eksponeringsperiode. Fluorescerer med en eksitasjon på 544 nm og emisjon detektert ved 590 nm ble målt ved anvendelse av en mikroplateleser.
Dannelse av stabile cellelinjer som uttrykker ZsGreen-COdc fusjonsproteiner ved hjelp Retroviral Transduksjon
retrovirusekspresjonsvektor pQCXIN-ZsGreen-COdc var en slags gave fra Dr. Frank Pajonk (Division of Molecular og Cellular Oncology, Department of Radiation Oncology, David Geffen School of Medicine ved University of California, Los Angeles, Los Angeles, CA), der karboksyl endestasjonen på murine ornitindekarboksylase (COdc) degron, sekvensen som styrer startstedet for nedbrytning, ble smeltet til ZsGreen reporter [21]. pQCXIN-ZsGreenc-ODC ble ko-transfektert med pVSV-G inn i GP2-293 pantropiske retrovirale pakkingscellene (Clontech) og retrovirus supernatanten ble brukt til å infisere A549 og H1299 celler. 48 timer etter infeksjon ble cellene valgt med G418 (Invitrogen). Oppbyggingen av ZsGreen-COdc protein ble overvåket av fluorescens mikroskop og flowcytometri (FL-1channel).
Generering av Subkutan Lung Cancer transplantater i Nude mus
For mus xenografter, både mono og tumor sfære celler ble trypsinert og mekanisk dissosiert for å oppnå en enkelt cellesuspensjon før subkutan injeksjon. Seks uker gamle kvinnelige naken mus (Harlan Lab, Indianapolis, IN) ble brukt. Tumor sfære (1 × 10
4) og monolags (1 × 10
4) celler var subkutant injisert i venstre og høyre flanker av samme mus for å evaluere tumorigen aktivitet. Mus ble overvåket daglig for utseendet av subkutane tumorer. Musene ble avlivet på dag 60 og tumorvev ble oppsamlet. Tumorvolumet ble beregnet ved hjelp av formelen 0,52 x lengde x bredde
2. Hematoxylin og eosin-farging etterfulgt av IHC-analyse ble utført for å analysere tumorhistologi. Seksjoner ble også farget med antistoff mot β-catenin av standard IHC-protokollen.
Statistical Analysis
Data er presentert som gjennomsnitt ± SD. Forskjeller ble bestemt av to tailed Student t-test. AP verdi av 0,05 ble betraktet som signifikant
Resultater
SP og NSP cellene danner tumor sfære med samme frekvens i menneskelig adenokarsinom cellelinjer
SP celler har vært. innblandet som antatte cscs som de viser forhøyet tumorigenicity i nude /SCID mus sammenlignet med NSP celler [27]. For å avgjøre om SP-celler har større selvfornyelse kapasitet enn NSP celler i kultur, ble SP og NSP celler fra to humane lungecancercellelinjer sorteres basert på evnen til dyseutstrømningen Hoechst 33342 fargestoff for å generere en Hoechst blå-rød-profil. En selektiv ABCG2 inhibitor, Fumitremorgin C (FTC), ble ko-inkubert med Hoechst 33342 for å blokkere aktiviteten til transportøren, og SP-port ble definert som den svekkede området i nærvær av FTC. De menneskelige adenokarsinom cellelinjer A549 og H1299 inneholdt 17,7% og 0,2% SP celler, henholdsvis (fig 1A.). Dyrking av SP og NSP-celler i tumor sfære dannende media, som bare tillater for seleksjon av udifferensierte kloner eller kreft stilk og stamceller [11], resulterte i tumor sfære formasjon lunge fra begge underpopulasjoner uten forskjell i graden av formasjonen (fig. 1B og data ikke vist). SP-celler typisk gi opphav til SP og NSP-celler ved hjelp av asymmetrisk celledeling, mens NSP-celler har ikke dette potensial [28]. Ved å re-farging av sortert SP og NSP celler fra A549 og H1299-celler etter en uke, FACS-analyse viste at SP-cellene ga opphav til en betydelig del av NSP celler. I tillegg isolerte NSP celler ga også opphav til tilsvarende andel av SP celler (Fig. 1C).
A. Karakteristisk Hoechst 33342 fargestoff flekker profil som viser eksistensen av SP (polygon gated) og NSP (ellipse gated) celler i humane A549 og H1299 adenokarsinomceller. Prosentandelen av SP-celler er angitt. Cellene ble farget med 5 mg /ml Hoechst33342 (HO), og kontrollceller var også co-farget med 10 mM fumitremorgin C (FTC) for å spesifisere SP celler. Celler ble sortert ved hjelp av en Beckman MoFlo cytometer og data ble kommentert ved hjelp av FCS Express. B. Fase kontrast fotografier av lunge kreft kuler hentet fra SP og NSP celler. SP og NSP-celler (1000 celle /ml) ble sådd ut på ultra lav adherente kolber i serumfritt medium supplert med vekstfaktorer og dyrket som beskrevet i Materialer og Metoder. C. Re-flekken av SP og NSP celler fra A549 og H1299 med Hoechst 33342 fargestoff. Andel SP celler er merket.
lungetumoren kuler utstillings kreft stamcelle funksjoner
Siden cellene i stand til selvfornyelse bor i både side og ikke-side populasjoner, vi undersøkt om tumor sfære celler viste noen CSC funksjoner, som for eksempel uttrykk for stamcellemarkører, slik som CD44, CD133 og OCT3 /4. Først, for å utelukke effekten av CSC media på uttrykket, ble monolags celler dyrket i CSC media sjekket, og ingen forskjell ble funnet mellom cellene vokse i CSC medier og vanlige vekstmedier (data ikke vist). Celler fra monolagskulturer og kule fra A549 og H1299 cellene ble deretter høstet og analysert for CD44 og CD133. Over 90% av A549 og H1299-celler i monolag-kulturer var CD44
+, mens bare en meget liten del av cellene ble CD133
+ (0,2% i A549-celler, og 0,55% i H1299 celler.). Men i lunge svulst sfærer, CD133
+ celler ble sterkt anriket til over 10% i A549, og 1,7% i H1299 (Fig. 2A). Transkripsjonsfaktor OCT3 /4 er ansett som en sentral regulator av humane embryonale stamceller pluripotency og selvfornyelse kapasitet. Dens ekspresjon synes å være viktig for å opprettholde den udifferensierte tilstand i embryonal karsinom, så vel som i andre kreft [29], [30]. OCT3 /4
+ celler i A549 og H1299 monolag var mindre enn 4%, mens tallene var signifikant oppregulert i tumor kuler til 36% og 50%, hver for seg.
A. Lungetumoren sfærer viste økt CD133 uttrykk. Ekspresjon av CD44 og CD133 i monolayer og tumor sfære celler, som bestemt ved to-farge strømningscytometri-analyse. Isotype-matchet monoklonale antistoffer og et andre preimmunt antiserum ble anvendt som negative kontroller. Prosentandelen av enkel- og dobbel-positive celler er angitt. B. lungetumoren sfærer viste økt OCT3 /4 uttrykk. En gjennomsnittlig fluorescensintensitet av OCT3 /4 i kontroll (grått område), monolags celler (prikket linje) og tumor kuler (heltrukket linje) er vist. Prosenter av positive celler er angitt i tabellen.
lungetumoren sfærer har høy karsinogent potensial
For å avgjøre om lunge kreftkuler fra A549 og H1299 celler ulik tumorigent potensial i forhold til celler dyrket i et monolag, vi injisert subkutant 10.000 celler fra hvert av disse populasjonene inn i flankene til nakne mus. Tumorvekst ble observert i alle mus inokulert med tumor sfæriske celler avledet fra A549, mens ingen tumorvekst ble observert etter inokulering med monolag A549-celler (tabell 1). Tumor sfære celler fra H1299-celler vokste i 2 av 3 nakne mus, mens det samme antall monolagsceller kan ikke gi opphav til en hvilken som helst tumor, selv med en utvidet 4 flere ukers observasjon (tabell 1 og data ikke vist). H E farging avdekket en svært mobil masse med store kjerner og fremtredende nucleoli (Fig. 3). Tumorsnitt fra xenopodet tumor sfærer ble farvet ved anvendelse av et antistoff mot β-catenin, noe som er en viktig regulator av Wnt reaksjonsveien som fungerer i å kontrollere stamcelleselvfornyelse. Den translokasjon av β-catenin til kjernen fører til forbedret ekspresjon av β-catenin målgener som fremmer tumor etablering, vekst, og invasjon [31]. Vi observerte at β-catenin ble uttrykt hovedsakelig i cytoplasma, mens ekspresjon i kjernene ble observert i tumor sfæren indusert tumorsnitt (fig. 3). Translokasjon av β-catenin til kjernen fører til forsterket uttrykking av β-catenin målgener som fremmer tumor etablering, vekst, og invasjon [31].
kirurgisk fjernet tumoren ble fiksert i bufret formalin, og deretter analysert ved immunhistokjemi (IHC) av standardprotokollen.
lungetumoren kuler er mer motstandsdyktig mot kjemoterapeutiske midler
Ettlagskulturer og tumor sfære celler ble eksponert for ulike konsentrasjoner av cellegifter for tiden i bruk i klinisk setting, slik som cisplatin og doksorubicin. Cellelevedyktigheten ble målt ved Alamar blå assay 2 dager etter underkaste monolags og tumorceller sfære til cisplatin eller doksorubicin. Som vist i figur 4, levedyktigheten til monolagskulturer sank signifikant etter både kjemoterapeutiske midler behandlinger sammenlignet med tumorceller sfære. Den relative levedyktigheten var rundt 20% for både A549 og H1299 monolagskulturer når de ble behandlet med 12,5 pM av doxorubicin, mens over 50% av tumorceller (sphere 50,4% for H1299, og 64,8% for A549) overlevde. Ved behandling med 25 uM av cisplatin, den relative levedyktighet var 11,7% for A549 og 25,3% for H1299 monolagskultur, mens 65,4% av A549 tumor sfære og 79,3% av H1299 tumor sfæriske cellene overlevde denne behandling, noe som indikerer monolagskultur kan være mer sensitive til cisplatin og doxorubicin i forhold til tumor-sfærer, som demonstrert ved den mindre prosentandel av levedyktige celler etter in vitro eksponering for medikamentet.
A. cisplatin, ble B. doxorubicin motstanden enlagskultur og kreftkuler analysert. Celler dissosiert fra lungetumor kuler eller monolag ble platet ut i 96-brønn plate med 2 x 10
4 celler /ml, 24 timer senere, media inneholdende forskjellige konsentrasjoner av cisplatin eller doksorubicin ble tilsatt. Etter 48 timers dyrking, ble 10% Alamar blå tilsatt og avlest ved 544/590 nm, ble den prosentvise levedyktighet beregnet i forhold til celler som ikke er utsatt for noen kjemoterapeutiske medikamenter. Resultatene representerer gjennomsnitt ± SD.
Lung kreftkuler utstillings redusert proteasome aktivitet
nedregulering av ubiquitin-proteasome avhengig proteolyse ble observert i respons på ulike kjemoterapeutiske midler, slik som cisplatin, [19], ifosfamid [19] og bortezomib [32]. Nyere funn viser at kjemoterapeutiske legemidler, slik som cisplatin, kan også føre til spredning av cscs [18]. For å undersøke om redusert proteasome aktivitet er observert i lunge cscs, utførte vi fluorogene proteasome funksjonsanalyser ved hjelp av monolags og sfære kulturer fra A549 og H1299 human NSCLC celler. 26S proteasomet har minst tre forskjellige typer proteolytiske aktiviteter som chymotrypsin-, trypsin, og caspase-lignende aktiviteter. For å overvåke bestemte protease aktiviteter 26S proteasome, tre fluorogene underlag: Suc-LLVY-AMC for chymotypsinlignende, Z-ARR-AMC for trypsin-lignende, og Z-LLE-AMC for caspase-lignende aktivitet, ble inkubert med celle lysates fra enten enkeltlag eller lunge svulst sfære kulturer. Caspase-aktig og kymotrypsinlignende aktiviteter fra monolagene økt over 2 timer inkubasjon med substrater, men forble uendret i tumor sfære lysatene. Kymotrypsin-lignende aktiviteter ble tilsvarende øket i monolag-kulturer og i mindre grad i lungetumor kuler (fig. 5A, B). Trypsin-lignende aktivitet var ikke signifikant forskjellig i begge grupper (fig. 5C). Chymotrypsin-lignende aktivitet, den dominerende aktivitet til 26S proteasomet, ble redusert til omtrent 30% i sfæren kulturer i forhold til monolagskulturer. Caspase-lignende aktivitet ble redusert til ca 20%, mens den trypsin-lignende aktivitet var ikke signifikant forskjellig (fig. 5D). Dette resultatet indikerer at lungetumoren sfære kulturer har lavere 26S proteasomet aktivitet enn monolagskulturer.
A. caspase-aktig, B. chymotrypsin-lignende, og C. trypsin-lignende aktivitet av monolagskultur og tumor kuler fra A549 og H1299-celler ble measued i løpet av de angitte tider. D. Sluttpunkt analyse (120 min) av 26S proteasomet aktiviteter i monolagkulturer og kreftkuler. Middelverdi ± SD blir plottet og utledet fra tre uavhengige eksperimenter. Studentens paret, og to-tailed t-tester ble utført, * p 0,05, ** p 0,01, og *** p 0,001 (tre gjentak per eksperiment)
lungetumoren kuler. er beriket med celler med lav proteasome aktivitet
Proteasomal nedbrytning av de fleste proteiner må først gå gjennom ubiquitinering veien før de blir degradert av proteasome. Men ornitindekarboksylase (ODC) er en godt karakterisert cellulærprotein lagt ubiquitin-uavhengig proteasomal degradering, og når anerkjent av 26S proteasome, det fører til umiddelbar nedbrytning av proteiner som inneholder det [21]. Retrovirus som uttrykker ZsGreen-COdc (dvs. sammensmelting av et fluorescerende protein ZsGreen, og den C-terminale ende av muse-ornitindekarboksylase (COdc) degron) tillater identifikasjon av celler med redusert 26S-proteasomet aktivitet på grunn av ZsGreen fluorescens. Dette har tidligere blitt rapportert å spore CIC i glioma og brystkreft
in vitro
basert på dens evne til å merke levende celler med lav 26S proteasomet aktivitet [21]. For å bekrefte at svulsten sfære celler er beriket for lunge cscs, infisert vi A549 og H1299 celler med ZsGreen-COdc uttrykker retrovirus. Vi har observert at monolagskulturer av A549 og H1299 oppviste lav bakgrunnsfluorescens på mer enn 98% av cellene, og bare svært få celler (2%) viste høye nivåer av ZsGreen (fig. 6A og data ikke vist). Interessant, lunge tumor kuler avledet fra ZsGreen-COdc infiserte A549 og H1299 cellene ble sterkt anriket for ZsGreen-positive celler, noe som indikerer lav proteasome aktivitet og således et høyt anriket kilde for cscs (fig. 6B). For ytterligere å bekrefte at cscs anrikes i populasjonen med lav proteosomet aktivitet, ble ZsGreen-positive og -negative cellene også sortert i 96-brønners plate, og antallet kuler som dannes ut fra 100 sorterte cellene ble telt, ZsGreen-positive celler fra både A549 og H1299 cellelinjer hadde en statistisk signifikant høyere sfære-dannende evne sammenlignet med de ZsGreen-negative celler (Fig.6C).
A. Frekvens av ZsGreen celler i A549 og H1299 monolagkulturer. B. Frekvens av ZsGreen celler i A549 og H12199-avledet tumor kuler med opphopning av ZsGreen-COdc, og dermed lav proteasome aktivitet indikeres. C. Antall kuler dannet fra ZsGreen positive og de negative celler ZsGreen etter sortering med flowcytometri i 96-brønners plater. ZsGree-positive og -negative cellene ble sortert i 96-brønns plate (100cells /brønn), etter dyrket i tumor sfære media i 2 uker; antall dannet kuler ble talt. Studentens paret, og to-tailed t-tester ble utført, *** p 0,001 (tre gjentak per eksperiment)
Diskusjoner
I denne studien har vi vist. at: 1) var i overensstemmelse med foregående bevis [11], trenger CSC-lignende celler eksistere i lungekreft; 2) både SP og NSP cellene danner kreft kuler med lik frekvens som indikerer eksistensen av selvfornyelse CSC-lignende celler i begge populasjoner; 3) lunge CSC-lignende celler kan bli dyrket i serumfritt medium; og 4) lav 26S-proteasomet aktivitet er forbundet med lunge CSC-lignende celler. Kreft stamcelle hypotese spår at SP-fraksjon bør være i stand til å regenerere både SP og NSP fraksjoner mens NSP fraksjonen bør bare være i stand til å regenerere seg selv [28]. Interessant, resultatene presentert her viser at både SP og NSP fraksjonene har kapasitet til å regenerere fullstendig begge fraksjoner. Det samme funn har også blitt observert i C6 glioma og DAOY medulloblastom cellelinjer hvor begge fraksjonene var i stand til å rekonstituere den parentale celle befolkning [16], [33]. I denne studien, SP celler vises tumor sfære-lignende vekst, den klassiske
in vitro
analyse av selvfornyelse potensialet, og befester dermed tidligere funn om at SP celler viser stilk-lignende aktivitet [34]. Imidlertid NSP-celler var også i stand til å danne tumor kuler med en frekvens sammenlignes med SP-celler.
CD133 (human prominin-1), et transmembrandomene fem glykoprotein, ble opprinnelig identifisert som en celleoverflate-antigen som er tilstede på CD34
+ hematopoetiske stamceller. Nylig, CD133 ble vist som en antatt overflatemarkør av kreft stamceller i mange faste tumorer, så som hjernetumor [35], prostatakreft [36], tykktarmskreft [8], eggstokk-kreft [37] og lungekreft [11] . Den ekstremt lave overflod av CD133
+ eller Oct3 /4
+ celler i svulster, gjør det vanskelig å isolere disse populasjonene. I vår studie viser vi at anrikning av CD133
+ /oktober 3/4
+ celler ved
in vitro
serumfritt kultur er mulig.
Det har lenge vært kjent at ikke alle tumorcelle er et tumor-initiere celle, og således millioner av tumorceller er ofte nødvendig å transplantere en ny tumor fra en eksisterende. I den foreliggende undersøkelse, xenograft tumorvekst i nakne mus forekom med injeksjon av 10 000 tumorceller sfære, men ikke ved å injisere et tilsvarende antall monolagsceller. Disse svulstene hadde store kjerner med fremtredende nucleoli og kjernekraft farging av β-catenin, som indikerer mulig aktivering av Wnt veien. Nuclear akkumulering av β-catenin [38] har vist seg å spille en rolle i å kontrollere stamcelleselvfornyelse [31], [39].
kjemoterapeutiske medikamenter, såsom cisplatin og ifosfamid [19], er kjent for å drepe mesteparten av tumorer ved å nedregulere ubikvitin-proteasom-avhengig proteolyse [20]. Men de kan også føre til spredning av cscs [18].
